專利名稱：4碳醇的發(fā)酵生產(chǎn)的制作方法
與相關(guān)申請的交叉參考
本申請根據(jù)35 U.S.C.§119要求于2005年9月29日提交的美國臨時申請系列號60/721677，和2006年6月16日提交的美國臨時申請系列號60/814470的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及工業(yè)微生物學和醇生產(chǎn)領(lǐng)域。更具體而言，1-丁醇經(jīng)由重組微生物的工業(yè)發(fā)酵來生產(chǎn)。

背景技術(shù)：
丁醇是重要的工業(yè)化學藥品，用作燃料添加劑、塑料工業(yè)中的原料化學藥品、以及食物和調(diào)味劑工業(yè)中的食物級提取劑。每年有100-120億磅丁醇通過石油化學方法進行生產(chǎn)，并且關(guān)于這種日用化學藥品的需要將很可能增加。
用于化學合成1-丁醇的方法是已知的，例如Oxo Process、ReppeProcess、和巴豆醛氫化(Ullmann＇s Encyclopedia of Industrial Chemistry，第6版，2003，Wiley-VCHVerlag GmbH and Co.，Weinheim，德國，第5卷，第716-719頁)。這些方法使用來源于石油化學的原材料并且一般是昂貴且不是環(huán)境友好的。來自植物衍生原材料的1-丁醇生產(chǎn)將使溫室氣體排放減到最小且將代表本領(lǐng)域的進展。
用于通過其他有機化學藥品的生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1-丁醇的方法也是已知的。例如，Muramoto等人(JP63017695)描述了使用假單胞菌屬(Pseudomonas)菌株用于從醛生產(chǎn)醇包括丁醇的方法。此外，Kuehnle等人(EP 1149918)描述了通過各種赤紅球菌(Rhodococcus ruber)菌株氧化烴來制備1-丁醇和2-丁醇的方法。
通過發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法也是已知的，其中最普遍的方法生產(chǎn)丙酮、1-丁醇和乙醇的混合物，且被稱為ABE方法(Blaschek等人，美國專利號6,358,717)。通過丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)發(fā)酵是認識最久的已知工業(yè)發(fā)酵之一，并且負責生產(chǎn)這些溶劑的途徑和基因已得到報道((Girbal等人，Trends inBiotechnology 1611-16(1998))。然而，實際發(fā)酵仍是相當復(fù)雜且難以控制的。自20世紀50年代以后ABE發(fā)酵已不斷下降，且現(xiàn)在幾乎所有丁醇都經(jīng)由如上所述的石油化學途徑生產(chǎn)。在一般的ABE發(fā)酵中，丁酸、丙酸、乳酸和乙酸首先通過丙酮丁醇梭菌生產(chǎn)，培養(yǎng)物pH降低且經(jīng)歷代謝“蝶形(butterfly)”移動，隨后形成1-丁醇、丙酮、異丙醇和乙醇。在常規(guī)ABE發(fā)酵中，來自葡萄糖的1-丁醇產(chǎn)量低，一般為約15％且很少超過25％。因此，在常規(guī)ABE發(fā)酵中的1-丁醇濃度通常低于1.3％。
通過消除所有其他溶劑副產(chǎn)品使來自ABE方法的1-丁醇生產(chǎn)達到最大的嘗試尚未完全成功，且因此該方法產(chǎn)生相當大量不能用作汽油添加劑的丙酮。用于發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的其中1-丁醇是唯一產(chǎn)物的方法將代表本領(lǐng)域的進展。
因此需要用于生產(chǎn)1-丁醇作為單一產(chǎn)物、環(huán)境負責、有成本效益的方法。本發(fā)明通過發(fā)現(xiàn)表達1-丁醇生物合成途徑的重組微生物生產(chǎn)宿主解決了這個需要。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了具有工程改造的1-丁醇生物合成途徑的重組微生物。工程改造的微生物可以用于1-丁醇的商業(yè)生產(chǎn)。因此本發(fā)明提供了包含編碼多肽的至少一種DNA分子的重組微生物宿主細胞，所述多肽催化選自下述的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 a)乙酰輔酶A至乙酰乙酰輔酶A b)乙酰乙酰輔酶A至3-羥丁酰輔酶A c)3-羥丁酰輔酶A至巴豆酰輔酶A d)巴豆酰輔酶A至丁酰輔酶A e)丁酰輔酶A至丁醛和 f)丁醛至1-丁醇； 其中所述至少一種DNA分子對于所述微生物宿主細胞是異源的且其中所述微生物宿主細胞生產(chǎn)1-丁醇。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)1-丁醇的方法，所述方法包括 i)提供包含編碼多肽的至少一種DNA分子的重組微生物宿主細胞，所述多肽催化選自下述的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 a)乙酰輔酶A至乙酰乙酰輔酶A b)乙酰乙酰輔酶A至3-羥丁酰輔酶A c)3-羥丁酰輔酶A至巴豆酰輔酶A d)巴豆酰輔酶A至丁酰輔酶A e)丁酰輔酶A至丁醛和 f)丁醛至1-丁醇； 其中所述至少一種DNA分子對于所述微生物宿主細胞是異源的；和 ii)使(i)的所述宿主細胞在由此生產(chǎn)1-丁醇的條件下與可發(fā)酵的碳底物接觸。
附圖簡述和序列描述 根據(jù)形成本申請部分的下述詳細描述、附圖和伴隨的序列描述可以更充分地理解本發(fā)明。


圖1顯示了1-丁醇生物合成途徑。標記為“a”、“b”、“c”、“d”、“e”和“f”的步驟表示下文描述的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。
下述序列符合37 C.F.R.1.821-1.825(＂Requirements for PatentApplications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules＂)，并且符合世界知識產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標準ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求(管理條令(Administrative Instructions)的規(guī)則5.2和49.5(a-bis)，以及部分(section)208和附錄C)。對于核苷酸和氨基酸序列使用的符號和格式遵守37 C.F.R.§1.822中所述規(guī)則。
表1 基因和蛋白質(zhì)SEQ ID NO.概括 SEQ ID NOs17-44是用于擴增1-丁醇生物合成途徑基因的寡核苷酸引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs45-72是用于測序的寡核苷酸引物的核苷酸序列。
SEQ ID NOs73-75是用于構(gòu)建實施例9中所述轉(zhuǎn)化載體的寡核苷酸引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO76是在本文中稱為CaTER的密碼子最優(yōu)化的CAC0462基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO77是在本文中稱為EgTER(opt)的密碼子最優(yōu)化的EgTER基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO78是在本文中稱為ald(opt)的密碼子最優(yōu)化的ald基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO79是質(zhì)粒pFP988的核苷酸序列。
SEQ ID NO＇s 80-127、160-185、和190-207是用于克隆、測序或篩選本文所述的1-丁醇生物合成途徑基因的克隆、測序或PCR篩選引物的核酸序列，且在表4和5中更充分地描述。
SEQ ID NO156是cscBKA基因簇的核苷酸序列。
SEQ ID NO157是蔗糖水解酶(CscA)的氨基酸序列。
SEQ ID NO158是D-果糖激酶(CscK)的氨基酸序列。
SEQ ID NO159是蔗糖透性酶(CscB)的氨基酸序列。
SEQ ID NO186是實施例17中所述的密碼子最優(yōu)化的tery基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO187是由密碼子最優(yōu)化的tery基因(SEQ ID NO186)編碼的丁酰輔酶A脫氫酶(ter)的氨基酸序列。
SEQ ID NO188是實施例17中所述的密碼子最優(yōu)化的aldy基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO189是由密碼子最優(yōu)化的aldy基因(SEQ ID NO188)編碼的丁酰脫氫酶(ald)的氨基酸序列。
SEQ ID NO208是實施例14中使用的模板DNA的核苷酸序列。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及使用重組微生物生產(chǎn)1-丁醇的方法。本發(fā)明滿足了許多商業(yè)和工業(yè)需要。丁醇是具有多種應(yīng)用的重要工業(yè)日用化學藥品，其中它作為燃料或燃料添加劑的潛力特別重要。盡管只是4碳醇，但丁醇具有的能含量類似于汽油的那種，且可以與任何化石燃料摻合。丁醇作為燃料或燃料添加劑是有利的，因為當在標準內(nèi)燃機中燃燒時，它只產(chǎn)生CO2，且產(chǎn)生很少或沒有SOx或NOx。此外丁醇的腐蝕性少于迄今為止最優(yōu)選的燃料添加劑乙醇。
除了其作為生物燃料或燃料添加劑的效用，丁醇具有影響新興的燃料電池工業(yè)中的氫分布問題的潛力。燃料電池現(xiàn)今受到與氫運輸和分布有關(guān)的安全關(guān)心的困擾。丁醇可以容易地對于其氫含量進行改造，且可以通過現(xiàn)有加油站以燃料電池或車輛所需的純度進行分配。
最后本發(fā)明從植物衍生的碳源生產(chǎn)丁醇，從而避免了與用于丁醇生產(chǎn)的標準石油化學方法相關(guān)的負面環(huán)境影響。
下述定義和縮寫用于解釋權(quán)利要求和說明書。
如本文使用的，術(shù)語“發(fā)明”或“本發(fā)明”是非限制性術(shù)語，且不預(yù)期指本發(fā)明的任何單個實施方案，而是包含如說明書和權(quán)利要求中所述的所有可能實施方案。
“ABE”是關(guān)于丙酮-丁醇-乙醇發(fā)酵方法的縮寫。
術(shù)語“1-丁醇生物合成途徑”意指從乙酰輔酶A(乙酰CoA)生產(chǎn)1-丁醇的酶途徑。
術(shù)語“乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶”指催化2個乙酰輔酶A分子轉(zhuǎn)化成乙酰乙酰輔酶A和輔酶A(CoA)的酶。優(yōu)選的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶是對短鏈?；o酶A和乙酰輔酶A具有底物優(yōu)先的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(在正向中的反應(yīng))，且分類為E.C.2.3.1.9[EnzymeNomenclature 1992，Academic Press，San Diego]；盡管，具有更廣泛底物范圍的酶(E.C.2.3.1.16)也將起作用。乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶可從許多來源獲得，例如大腸桿菌(GenBank NosNP_416728(SEQ IDNO129)，NC_000913(SEQ ID NO128)；NCBI(國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information))氨基酸序列，NCBI核苷酸序列)，丙酮丁醇梭菌(GenBank NosNP_349476.1(SEQ ID NO2)，NC_003030(SEQ ID NO1)；NP_149242(SEQID NO4)，NC_001988(SEQ ID NO3)，枯草芽孢桿菌(GenBankNosNP_390297(SEQ ID NO131)，NC_000964(SEQ ID NO130))，和啤酒糖酵母(GenBank NosNP_015297(SEQ ID NO133)，NC_001148(SEQ ID NO132))。
術(shù)語“3-羥丁酰輔酶A脫氫酶”指催化乙酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化成3-羥丁酰輔酶A的酶。3-羥丁酰輔酶A脫氫酶可以是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依賴性的，對(S)-3-羥丁酰輔酶A或(R)-3-羥丁酰輔酶A具有底物優(yōu)先，且分別分類為E.C.1.1.1.35和E.C.1.1.1.30。此外，3-羥丁酰輔酶A脫氫酶可以是還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)依賴性的，對(S)-3-羥丁酰輔酶A或(R)-3-羥丁酰輔酶A具有底物優(yōu)先，且分別分類為E.C.1.1.1.157和E.C.1.1.1.36。3-羥丁酰輔酶A脫氫酶可從許多來源獲得，例如，丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_349314(SEQ ID NO6)，NC_003030(SEQID NO5))，枯草芽孢桿菌(GenBank NOsAAB09614(SEQ ID NO135)，U29084(SEQ ID NO134))，富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(GenBankNOsYP_294481(SEQ ID NO137)，NC_007347(SEQ ID NO136))，和真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(GenBank NOsAAA21973(SEQ ID NO139)，J04987(SEQ ID NO138))。
術(shù)語“巴豆酸酶”指催化3-羥丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化成巴豆酰輔酶A和H2O的酶。巴豆酸酶可以對(S)-3-羥丁酰輔酶A或(R)-3-羥丁酰輔酶A具有底物優(yōu)先，且分別分類為E.C.4.2.1.17和E.C.4.2.1.55。巴豆酸酶可從許多來源獲得，例如大腸桿菌(GenBank NOsNP_415911(SEQ ID NO141)，NC_000913(SEQ ID NO140))，丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_349318(SEQ ID NO8)，NC_003030(SEQID NO6))，枯草芽孢桿菌(GenBank NOsCAB13705(SEQ ID NO143)，Z99113(SEQ ID NO142))，和豚鼠氣單胞菌(GenBank NOsBAA21816(SEQ ID NO145)，D88825(SEQ ID NO144))。
術(shù)語“丁酰輔酶A脫氫酶”指催化巴豆酰輔酶A轉(zhuǎn)化成丁酰輔酶A的酶。丁酰輔酶A脫氫酶可以是NADH依賴性或NADPH依賴性的，且分別分類為E.C.1.3.1.44和E.C.1.3.1.38。丁酰輔酶A脫氫酶可從許多來源獲得，例如，丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_347102(SEQID NO10)，NC_003030(SEQ ID NO9)))，小眼蟲(GenBankNOsQ5EU90SEQ ID NO147)，AY741582SEQ ID NO146))，丘鏈霉菌(GenBank NOsAAA92890(SEQ ID NO149)，U37135(SEQ ID NO148))，和天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)(GenBank NOsCAA22721(SEQ ID NO151)，AL939127(SEQ IDNO150))。
術(shù)語“丁醛脫氫酶”指使用NADH或NADPH作為輔因子，催化丁酰輔酶A轉(zhuǎn)化成丁醛的酶。對于NADH具有優(yōu)先的丁醛脫氫酶被稱為E.C.1.2.1.57，且可從下述來源獲得例如，拜氏梭菌(GenBank NOsAAD31841(SEQ ID NO12)，AF157306(SEQ ID NO11))和丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_149325(SEQ ID NO153)，NC_001988(SEQ ID NO152))。
術(shù)語“丁醇脫氫酶”指使用NADH或NADPH作為輔因子，催化丁醛轉(zhuǎn)化成1-丁醇的酶。丁醇脫氫酶可從下述來源獲得例如，丙酮丁醇梭菌(GenBank NOsNP_149325(SEQ ID NO153)，NC_001988SEQ ID NO152；注這種酶具有醛和醇脫氫酶活性)；NP_349891(SEQ ID NO14)，NC_003030(SEQ ID NO13)；和NP_349892(SEQ ID NO16)，NC_003030(SEQ ID NO15))和大腸桿菌(GenBankNOsNP_417484(SEQ ID NO155)，NC_000913(SEQ ID NO154))。
術(shù)語“兼性厭氧菌”指在需氧和厭氧環(huán)境中都能夠生長的微生物。
術(shù)語“碳底物”或“可發(fā)酵的碳底物”指能夠由本發(fā)明的宿主生物代謝的碳源，且特別是選自單糖、寡糖、多糖和一碳底物或其混合物的碳源。
術(shù)語“基因”指能夠表達為特定蛋白質(zhì)的核酸片段，任選包括在編碼序列前(5＇非編碼序列)和后(3＇非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列?！疤烊换颉敝溉缭谧匀唤缰信c其自身調(diào)節(jié)序列一起發(fā)現(xiàn)的基因?！扒逗匣颉敝覆皇翘烊换虻娜魏位?，包含在自然界中未在一起發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)和編碼序列。因此，嵌合基因可以包含來源于不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或調(diào)節(jié)序列和編碼序列來源于相同來源，但排列方式不同于自然界中發(fā)現(xiàn)的那種?！皟?nèi)源基因”指在生物基因組中其天然位置中的天然基因?！巴鈦怼被颉爱愒椿颉敝冈谒拗魃镏型ǔＮ窗l(fā)現(xiàn)，但通過基因轉(zhuǎn)移引入宿主生物內(nèi)的基因。外來基因可以包含插入非天然生物內(nèi)的天然基因，或嵌合基因。“轉(zhuǎn)基因”是已通過轉(zhuǎn)化程序引入基因組內(nèi)的基因。
如本文使用的，術(shù)語“編碼序列”指編碼特定氨基酸序列的DNA序列?！昂线m的調(diào)節(jié)序列”指位于編碼序列上游(5＇非編碼序列)、之內(nèi)或下游(3＇非編碼序列)，且影響轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性、或相關(guān)編碼序列翻譯的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列可以包括啟動子、翻譯前導序列、內(nèi)含子、多腺苷酸化識別序列、RNA加工位點、效應(yīng)物結(jié)合位點和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
術(shù)語“啟動子”指能夠控制編碼序列或功能性RNA表達的DNA序列。一般而言，編碼序列位于啟動子序列的3＇。啟動子可以整體來源于天然基因，或由來源于自然界中發(fā)現(xiàn)的不同啟動子的不同元件組成，或甚至包含包含合成的DNA區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，不同啟動子可以指導基因在不同組織或細胞類型中，或在不同發(fā)育階段，或響應(yīng)不同環(huán)境或生理條件表達。引起基因在大多數(shù)細胞類型中在大多數(shù)時間表達的啟動子通常被稱為“組成型啟動子”。進一步認識到因為在大多數(shù)情況下調(diào)節(jié)序列的確切邊界尚未完全限定，所以不同長度的DNA片段可以具有相同的啟動子活性。
術(shù)語“可操作地連接的”指單個核酸片段上的核酸序列的結(jié)合，從而使得一種的功能受另一種的影響。例如，當啟動子能夠影響編碼序列表達時(即，編碼序列在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下)，它與那種編碼序列可操作地連接。編碼序列可以與調(diào)節(jié)序列在有義或反義方向上可操作地連接。
如本文使用的，術(shù)語“表達”指來源于本發(fā)明核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定累積。表達可以指mRNA翻譯成多肽。
如本文使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物內(nèi)，從而導致遺傳學穩(wěn)定的遺傳。包含轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物被稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化”生物。
術(shù)語“質(zhì)?！?、“載體”和“盒”指通常攜帶并非細胞中央代謝部分的基因的染色體外元件，且通常為環(huán)狀雙鏈DNA片段的形式。此類元件可以是來源于任何來源的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列，線性或環(huán)狀單或雙鏈DNA或RNA，其中許多核苷酸序列已連接或重組到獨特構(gòu)建體內(nèi)，所述獨特構(gòu)建體能夠?qū)㈥P(guān)于所選基因產(chǎn)物的啟動子片段和DNA序列連同合適的3＇非翻譯序列引入細胞內(nèi)?！稗D(zhuǎn)化盒”指包含外來基因且具有除外來基因外的元件的特定載體，所述元件促進特定宿主細胞的轉(zhuǎn)化?！氨磉_盒”指包含外來基因且具有除外來基因外的元件的特定載體，所述元件允許那種基因在外來宿主中增強的表達。
如本文使用的，術(shù)語“密碼子簡并”指允許核苷酸序列變異而不影響編碼的多肽的氨基酸序列遺傳密碼中的性質(zhì)。技術(shù)人員將充分知道由特定宿主細胞在指定給定氨基酸的核苷酸密碼子選擇中顯示的“密碼子偏倚”。因此，當合成用于在宿主細胞中改善的表達的基因時，希望這樣設(shè)計基因，從而使得其密碼子選擇頻率接近宿主細胞的優(yōu)選密碼子選擇頻率。
當術(shù)語“密碼子最優(yōu)化的”指用于轉(zhuǎn)化各種宿主的基因或核酸分子編碼區(qū)時，它指基因或核酸分子編碼區(qū)中的密碼子改變，以反映宿主生物的一般密碼子選擇而不改變由DNA編碼的多肽。
本文使用的標準重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，且由下述參考文獻描述Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(下文＂Maniatis＂)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1984)；以及Ausubel，F(xiàn).M.等人，Current Protocols in MolecularBiology，由Greene Publishing Assoc.and Wiley-lnterscience出版(1987)。
1-丁醇生物合成途徑 利用碳水化合物的微生物使用Embden-Meyerhof-Parnas(EMP)途徑、Entner-Doudoroff途徑和戊糖磷酸循環(huán)作為中央代謝途徑，以提供能量和細胞前體用于生長和維持。這些途徑共有中間物甘油醛-3-磷酸，且最終直接或與EMP途徑組合形成丙酮酸鹽。隨后，丙酮酸鹽經(jīng)由多種方法轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A(乙酰-CoA)，包括與丙酮酸脫氫酶復(fù)合體、丙酮酸-甲酸裂合酶、和丙酮酸-鐵氧還蛋白氧化還原酶反應(yīng)。乙酰輔酶A充當例如脂肪酸、氨基酸和次生代謝物產(chǎn)生中的關(guān)鍵中間物。糖轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A的組合反應(yīng)產(chǎn)生能量(例如，腺苷-5＇-三磷酸，ATP)和還原當量(例如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH)。NADH和NADPH必須再循環(huán)至其氧化形式(分別為NAD+和NADP+)。在無機電子受體(例如O2、NO3-和SO42-)的存在下，還原當量可以用于增加能量庫；可替代地，可以形成還原的碳副產(chǎn)品。起因于碳水化合物發(fā)酵的乙醇和1-丁醇產(chǎn)生是后者的例子。
通過提供如圖1中所示從乙酰輔酶A到1-丁醇的完整1-丁醇生物合成途徑，本發(fā)明使得能夠用重組微生物從碳水化合物來源生產(chǎn)1-丁醇。由于不存在基因或缺乏合適的基因調(diào)節(jié)，一般在微生物群落中缺乏的這種生物合成途徑，包括下述底物至產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 a)如例如由乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶催化的，乙酰輔酶A至乙酰乙酰輔酶A； b)如例如通過3-羥丁酰輔酶A脫氫酶催化的，乙酰乙酰輔酶A至3-羥丁酰輔酶A； c)如例如通過巴豆酸酶催化的，3-羥丁酰輔酶A至巴豆酰輔酶A； d)如例如通過丁酰輔酶A脫氫酶催化的，巴豆酰輔酶A至丁酰輔酶A； e)如例如通過丁醛脫氫酶催化的，丁酰輔酶A至丁醛；和 f)如例如通過丁醇脫氫酶催化的，丁醛至1-丁醇。
該途徑不需要ATP且產(chǎn)生NAD+和/或NADP+，因此和產(chǎn)生乙酰輔酶A的中央代謝途徑平衡。天然生物通過發(fā)酵產(chǎn)生1-丁醇的能力是罕見的且最顯著地由拜氏梭菌和丙酮丁醇梭菌例示。關(guān)于丙酮丁醇梭菌的基因組織和基因調(diào)節(jié)已得到描述(L.Girbal和P.Soucaille，Trends inBiotechnology 21611-16(1998))。然而，這些酶活性中的許多還與可替代途徑相關(guān)，例如烴利用、脂肪酸氧化、和聚羥基鏈烷酸酯代謝。因此，在提供從乙酰輔酶A到1-丁醇的重組途徑中，存在實現(xiàn)個別反應(yīng)步驟的許多選擇，且本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠利用公眾可用序列以構(gòu)建相關(guān)途徑。本領(lǐng)域已知和1-丁醇生物合成途徑構(gòu)建中有用的許多代表性基因列表在下文表2中列出。
表2 1-丁醇途徑基因來源 用于1-丁醇生產(chǎn)的微生物宿主 用于1-丁醇生產(chǎn)的微生物宿主可以選自細菌、藍細菌、絲狀真菌和酵母。用于1-丁醇生產(chǎn)的微生物宿主優(yōu)選對1-丁醇是耐受的，從而使得得率不受丁醇毒性限制。在1-丁醇高效價水平上有代謝活性的微生物不是本領(lǐng)域眾所周知的。盡管丁醇耐受突變體已從產(chǎn)溶劑菌(solventogenic)梭菌(Clostridia)中分離，但關(guān)于其他潛在有用細菌菌株的丁醇耐受性的可用信息很少。關(guān)于細菌中的醇耐受性比較的大多數(shù)研究暗示丁醇比乙醇更有毒(de Cavalho等人，Microsc.Res.Tech.64215-22(2004)和Kabelitz等人，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.220223-227(2003))。Tomas等人(J.Bacteriol.1862006-2018(2004))報道了丙酮丁醇梭菌發(fā)酵期間的丁醇得率可能受丁醇毒性限制。丁醇對丙酮丁醇梭菌的主要作用是膜功能的破壞(Hermann等人，Appl.Environ.Microbiol.501238-1243(1985))。
選擇用于1-丁醇生產(chǎn)的微生物宿主優(yōu)選對1-丁醇是耐受的，且能夠?qū)⑻妓衔镛D(zhuǎn)化成1-丁醇。關(guān)于合適微生物宿主選擇的標準包括下述對1-丁醇的固有耐受性、高的葡萄糖利用率、用于基因操作的遺傳工具的有效性、和產(chǎn)生穩(wěn)定染色體改變的能力。
對于1-丁醇具有耐受性的合適宿主菌株可以通過基于菌株的固有耐受性的篩選來鑒定。微生物對1-丁醇的固有耐受性可通過下述測量測定當在極限培養(yǎng)基中生長時負責50％生長速率抑制的1-丁醇濃度(IC50)。IC50值可以使用本領(lǐng)域已知的方法來測定。例如，目的微生物可以在各種量的1-丁醇的存在下生長，且通過測量600納米處的光密度來監(jiān)控生長速率。倍增時間可以由生長曲線的對數(shù)部分來計算，且用作生長速率的測量。產(chǎn)生50％生長抑制的1-丁醇濃度可以從百分比生長抑制對1-丁醇濃度的圖來測定。優(yōu)選地，宿主菌株對于1-丁醇應(yīng)當具有大于約0.5％重量/體積的IC50。
用于1-丁醇生產(chǎn)的微生物宿主還應(yīng)以高比率利用葡萄糖。大多數(shù)微生物能夠利用碳水化合物。然而，某些環(huán)境微生物不能利用碳水化合物至高效率，且因此將不是合適的宿主。
基因修飾宿主的能力是任何重組微生物生產(chǎn)所必需的?；蜣D(zhuǎn)移技術(shù)的方式可以是電穿孔、接合、轉(zhuǎn)導或天然轉(zhuǎn)化。廣泛范圍的宿主接合質(zhì)粒和藥物抗性標記是可用的。基于可以在那種宿主中起作用的抗生素抗性標記的性質(zhì)使克隆載體適合于宿主生物。
微生物宿主還必須通過缺失各種基因進行處理，以滅活關(guān)于碳流的競爭途徑。這要求指導滅活的轉(zhuǎn)座子或染色體整合載體的有效性。此外，生產(chǎn)宿主應(yīng)當順應(yīng)化學誘變，從而使得可以獲得改善固有1-丁醇耐受性的突變。
基于上述標準，用于生產(chǎn)1-丁醇的合適微生物宿主包括但不限于，梭菌屬(Clostridium)、發(fā)酵單胞菌屬(Zymomonas)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、棒桿菌屬(Corynebacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、假絲酵母屬(Candida)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)和糖酵母屬(Saccharomyces)的成員。優(yōu)選宿主包括大腸桿菌、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、浸麻類芽孢桿菌(Paenibacillus macerans)、紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)、惡臭假單胞菌、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、鶉雞腸球菌(Enterococcus gallinarium)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、枯草芽孢桿菌和啤酒糖酵母。
生產(chǎn)宿主的構(gòu)建 包含必需基因的重組生物可以使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)進行構(gòu)建，所述必需基因?qū)⒕幋a使可發(fā)酵的碳底物轉(zhuǎn)化成1-丁醇的酶促途徑。在本發(fā)明中，編碼1-丁醇生物合成途徑酶的基因可以如上所述從各種來源分離，所述酶即乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、3-羥丁酰輔酶A脫氫酶、巴豆酸酶、丁酰輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶、和丁醇脫氫酶。
從細菌基因組獲得所需基因的方法是分子生物學領(lǐng)域常見和眾所周知的。例如，如果基因序列是已知的，那么合適的基因組文庫可以通過限制性內(nèi)切核酸酶消化來制備，且可以用與所需基因序列互補的探針來篩選。一旦序列分離，DNA就可以使用標準引物指導的擴增方法例如聚合酶鏈反應(yīng)(Mullis，美國專利號4,683,202)進行擴增，以獲得適合于使用合適載體轉(zhuǎn)化的DNA量。對于在異源宿主中表達的密碼子最優(yōu)化的工具是容易獲得的。用于密碼子最優(yōu)化的一些工具基于宿主生物的GC含量是可用的。某些示例性微生物宿主的GC含量在表3中給出。
表3 微生物宿主的GC含量 一旦相關(guān)途徑基因被鑒定和分離，它們就可以通過本領(lǐng)域眾所周知的方法轉(zhuǎn)化到合適的表達宿主內(nèi)。對于多種宿主細胞轉(zhuǎn)化有用的載體或盒是常見的，且從公司例如

(Madison，WI)，Invitrogen Co rp.(Carlsbad，CA)，Stratagene(La JoIIa，CA)，和New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)商購可得。一般地，載體或盒包含指導相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列、選擇標記、和允許自主復(fù)制或染色體整合的序列。合適的載體包含具有轉(zhuǎn)錄起始控制的基因5＇區(qū)域，和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段3＇區(qū)域。2個控制區(qū)都可以來源于與轉(zhuǎn)化的宿主細胞同源的基因，盡管應(yīng)當理解此類控制區(qū)也可以來源于對于選擇作為生產(chǎn)宿主的特定物種非天然的基因。
用于驅(qū)動相關(guān)途徑編碼區(qū)在所需宿主細胞中表達的起始控制區(qū)或啟動子是眾多的，且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。事實上能夠驅(qū)動這些遺傳元件的任何啟動子都適合于本發(fā)明，包括但不限于，CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI、CUP1、FBA、GPD、和GPM(對于在糖酵母菌屬中表達有用)；AOX1(對于在畢赤氏酵母屬中表達有用)；和lac、ara、tet、trp、IPL、IPR、T7、tac，和trc(對于在大腸桿菌、產(chǎn)堿菌屬和假單胞菌屬中表達有用)；amy、apr、npr啟動子和對于在枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和浸麻類芽孢桿菌中表達有用的各種噬菌體啟動子；nisA(對于在革蘭氏陽性細菌中表達有用，Eichenbaum等人Appl.Environ.Microbiol.64(8)2763-2769(1998))；和合成P11啟動子(對于在植物乳桿菌中表達有用，Rud等人，Microbiology 1521011-1019(2006))。
終止控制區(qū)也可以來源于對優(yōu)選宿主天然的各種基因。任選地，終止位點可能是不必要的，然而，如果包括，那么它是最優(yōu)選的。
某些載體能夠在廣泛范圍的宿主細菌中復(fù)制且可以通過接合進行轉(zhuǎn)移。pRK404的完整和注解的序列以及3種相關(guān)載體-pRK437、pRK442和pRK442(H)是可用的。這些衍生物已被證明是用于在革蘭氏陰性細菌中基因操作的有價值的工具(Scott等人，Plasmid50(1)74-79(2003))。廣宿主范圍lnc P4質(zhì)粒RSF1010的幾種質(zhì)粒衍生物與可以在一系列革蘭氏陰性細菌中起作用的啟動子也是可用的。質(zhì)粒pAYC36和pAYC37具有活性啟動子連同多克隆位點，以允許異源基因在革蘭氏陰性細菌中表達。
染色體基因替代工具也是廣泛可用的。例如，廣宿主范圍復(fù)制子pWV101的熱敏變體已進行修飾以構(gòu)建質(zhì)粒pVE6002，所述質(zhì)粒pVE6002可以用于在一系列革蘭氏陽性細菌中產(chǎn)生基因替代(Maguin等人，J.Bacteriol.174(17)5633-5638(1992))。此外，體外transposomes可用于在來自商業(yè)來源例如

的多種基因組中產(chǎn)生隨機突變。
1-丁醇生物合成途徑在各種優(yōu)選微生物宿主中的表達在下文更詳細地描述。
1-丁醇生物合成途徑在大腸桿菌中的表達 對于大腸桿菌轉(zhuǎn)化有用的載體或盒是常見的且從上文列出的公司商購可得。例如，如實施例11中所示，1-丁醇生物合成途徑的基因可以從各種梭菌菌株中分離、克隆到修飾的pUC19載體內(nèi)，且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌NM522內(nèi)。1-丁醇生物合成途徑在幾種其他大腸桿菌菌株中的表達在實施例13中描述。
1-丁醇生物合成途徑在紅串紅球菌中的表達 一系列大腸桿菌-紅球菌屬穿梭載體可用于在紅串紅球菌中表達，包括但不限于pRhBR17和pDA71(Kostichka等人，Appl.Microbiol.Biotechnol 6261-68(2003))。此外，一系列啟動子可用于在紅串紅球菌中的異源基因表達(參見例如Nakashima等人，Appl.Envir.Microbiol.705557-5568(2004)，和Tao等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.2005，DOI 10.1007/s00253-005-0064)。紅串紅球菌中染色體基因的靶向的基因破壞可以使用由Tao等人，同上和Brans等人(Appl.Envir Microbiol.662029-2036(2000))描述的方法來制備。
如上所述1-丁醇生產(chǎn)所需的異源基因可以最初克隆到pDA71或pRhBR71中且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌內(nèi)。載體隨后可以如Kostichka等人，同上所述通過電穿孔轉(zhuǎn)化到紅串紅球菌內(nèi)。重組體可以在包含葡萄糖的合成培養(yǎng)基中生長，且1-丁醇的生產(chǎn)可以使用本領(lǐng)域已知方法來跟蹤。
1-丁醇生物合成途徑在枯草芽孢桿菌中的表達 關(guān)于在枯草芽孢桿菌中基因表達和生成突變的方法也是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，如實施例12中所述，1-丁醇生物合成途徑的基因可以從各種梭菌菌株中分離、克隆到修飾的pUC19載體內(nèi)，且轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌BE1010內(nèi)。此外，如實施例14中所述，1-生物合成途徑的6種基因可以分成2個操縱子用于表達。將該途徑的前3種基因(thl、hbd和crt)整合到枯草芽孢桿菌BE1010染色體內(nèi)(Payne和Jackson，J.Bacteriol.1732278-2282(1991))。將后3種基因(EgTER、ald和bdhB)克隆到表達質(zhì)粒內(nèi)，且轉(zhuǎn)化到攜帶整合的1-丁醇基因的芽孢桿菌菌株內(nèi)。
1-丁醇生物合成途徑在地衣芽胞桿菌中的表達 在枯草芽孢桿菌中復(fù)制的大多數(shù)質(zhì)粒和穿梭載體可以用于通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或電穿孔轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌。例如，1-丁醇生產(chǎn)所需的基因可以克隆到質(zhì)粒pBE20或pBE60衍生物內(nèi)(Nagarajan等人，Gene 114121-126(1992))。轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌的方法是本領(lǐng)域已知的(例如參見Fleming等人Appl.Environ.Microbiol.，61(11)3775-3780(1995))。構(gòu)建用于在枯草芽孢桿菌中表達的質(zhì)粒也可以轉(zhuǎn)化到地衣芽孢桿菌內(nèi)，以產(chǎn)生生產(chǎn)1-丁醇的重組微生物宿主。
1-丁醇生物合成途徑在浸麻類芽胞桿菌中的表達 質(zhì)粒可以如上文關(guān)于在枯草芽孢桿菌中表達所述進行構(gòu)建，且通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化用于轉(zhuǎn)化浸麻類芽孢桿菌，以產(chǎn)生生產(chǎn)生產(chǎn)1-丁醇的重組微生物宿主。
1-丁醇生物合成途徑在真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(富養(yǎng)羅爾斯通氏菌)中的表達 關(guān)于在富養(yǎng)羅爾斯通氏菌中基因表達和生成突變的方法是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Taghavi等人，Appl.Environ.Microbiol.，60(10)3585-3591(1994))。關(guān)于1-丁醇生物合成途徑的基因可以克隆到上文所述的任何廣宿主范圍載體中，且進行電穿孔以產(chǎn)生生產(chǎn)1-丁醇的重組體。羅爾斯通氏菌屬(Ralstonia)中的多羥基丁酸鹽途徑已得到詳細描述，且修飾富養(yǎng)羅爾斯通氏菌基因組的多種遺傳技術(shù)是已知的，且那些工具可應(yīng)用于工程改造1-丁醇生物合成途徑。
1-丁醇生物合成途徑在惡臭假單胞菌中的表達 關(guān)于在惡臭假單胞菌中基因表達的方法是本領(lǐng)域已知的(參見例如Ben-Bassat等人，美國專利號6,586,229，所述專利引入本文作為參考)。例如，丁醇途徑基因可以插入到pPCU18內(nèi)，且這種連接的DNA可以電穿孔到電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的惡臭假單胞菌DOT-T1 C5aAR1細胞內(nèi)，以產(chǎn)生生產(chǎn)1-丁醇的重組體。
1-丁醇生物合成途徑在啤酒糖酵母中的表達 關(guān)于在啤酒糖酵母中基因表達的方法是本領(lǐng)域已知的(參見例如Methods in Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics andMolecular and Cell Biology(Part A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(Eds.)，Elsevier Academic Press，San Diego，CA)?；蛟诮湍钢械谋磉_一般需要啟動子、隨后為目的基因、和轉(zhuǎn)錄終止子。許多酵母啟動子可以用于構(gòu)建關(guān)于編碼1-丁醇生物合成途徑的基因的表達盒，包括但不限于，組成型啟動子FBA、GPD和GPM，以及誘導型啟動子GAL1、GAL10和CUP1。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于，F(xiàn)BAt、GPDt、GPMt、ERG10t和GAL1t。如實施例17中所述，合適的啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子和1-丁醇生物合成途徑的基因可以克隆到酵母2微米(2μ)質(zhì)粒內(nèi)。
1-丁醇生物合成途徑在植物乳桿菌中的表達 乳桿菌屬屬于乳桿菌目(Lactobacillales)科，且在枯草芽孢桿菌和鏈球菌屬(Streptococcus)轉(zhuǎn)化中使用的許多質(zhì)粒和載體可以用于乳桿菌屬。合適載體的非限制性例子包括pAMβ1及其衍生物(Renault等人，Gene 183175-182(1996)；和O＇Sullivan等人，Gene 137227-231(1993))；pMBB1和pMBB1的衍生物pHW800(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol.621481-1486(1996))；接合質(zhì)粒pMG1(Tanimoto等人，J.Bacteriol.1845800-5804(2002))；pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.634581-4584(1997))；pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.671262-1267(2001))；和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.Agents Chemother.381899-1903(1994))。來自植物乳桿菌的幾種質(zhì)粒已得到報道(例如，vanKranenburg R，Golic N，Bongers R，Leer RJ，de Vos WM，Siezen RJ，KleerebezemM.Appl.Environ.Microbiol.2005Mar；71(3)1223-1230)。例如，1-丁醇生物合成途徑在植物乳桿菌中的表達在實施例18中描述。
1-丁醇生物合成途徑在屎腸球菌、鶉雞腸球菌和糞腸球菌中的表達 腸球菌屬屬于乳桿菌目科，且在乳桿菌屬、枯草芽孢桿菌和鏈球菌屬轉(zhuǎn)化中使用的許多質(zhì)粒和載體可以用于腸球菌屬。合適載體的非限制性例子包括pAMβ1及其衍生物(Renault等人，Gene 183175-182(1996)；和O＇Sullivan等人，Gene 137227-231(1993))；pMBB1和pMBB1的衍生物pHW800(Wyckoff等人Appl.Environ.Microbiol.621481-1486(1996))；接合質(zhì)粒pMG1(Tanimoto等人，J.Bacteriol.1845800-5804(2002))；pNZ9520(Kleerebezem等人，Appl.Environ.Microbiol.634581-4584(1997))；pAM401(Fujimoto等人，Appl.Environ.Microbiol.671262-1267(2001))；和pAT392(Arthur等人，Antimicrob.Agents Chemother.381899-1903(1994))。使用來自乳球菌屬(Lactococcus)的nisA基因的糞腸球菌的表達載體也可以使用(Eichenbaum等人，Appl.Environ.Microbiol.642763-2769(1998)。此外，用于在屎腸球菌染色體中基因替代的載體可以使用(Nallaapareddy等人，Appl.Environ.Microbiol.72334-345(2006))。例如，1-丁醇生物合成途徑在糞腸球菌中的表達在實施例19中描述。
發(fā)酵培養(yǎng)基 本發(fā)明中的發(fā)酵培養(yǎng)基必須包含合適的碳底物。合適的底物可以包括但不限于，單糖例如葡萄糖和果糖、寡糖例如乳糖或蔗糖、多糖例如淀粉或纖維素或其混合物，和來自可再生原料的未純化混合物，例如干酪乳清滲透物、玉米漿、蔗糖蜜、和大麥芽。此外碳底物也可以是已證實代謝轉(zhuǎn)化為關(guān)鍵生物化學中間物的單碳底物，例如二氧化碳、或甲醇。除了單和二碳底物，也已知甲基營養(yǎng)生物利用許多其他含碳化合物，例如甲胺、葡萄胺和多種氨基酸用于代謝活性。例如，已知甲基營養(yǎng)酵母利用來自甲胺的碳以形成海藻糖或丙三醇(Bellion等人，Microb.Growth C1 Compd.，[Int.Symp.]，7th(1993)，415-32.Editor(s)Murrell，J.Collin；Kelly，Don P.PublisherIntercept，Andover，UK)。類似地，各種假絲酵母屬(Candida)物種將代謝丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153485-489(1990))。因此預(yù)期本發(fā)明中利用的碳源可以包含廣泛多樣的含碳底物，且將只受宿主選擇限制。
盡管預(yù)期所有上文提及的碳底物及其混合物都適合于本發(fā)明，但優(yōu)選碳底物是葡萄糖、果糖和蔗糖。
除了合適的碳源，發(fā)酵培養(yǎng)基必須包含本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，適合于培養(yǎng)物生長和促進1-丁醇生產(chǎn)所需酶促途徑的合適礦物質(zhì)、鹽、輔因子、緩沖液及其他組分。
培養(yǎng)條件 細胞一般在約25℃-約40℃溫度下在合適培養(yǎng)基中生長。本發(fā)明中合適的生長培養(yǎng)基是常見的商業(yè)制備培養(yǎng)基，例如Luria Bertani(LB)液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖(Sabouraud Dextrose)(SD)液體培養(yǎng)基或酵母培養(yǎng)基(YM)液體培養(yǎng)基。其他確定成分或合成生長培養(yǎng)基也可以使用，并且關(guān)于特定微生物生長的合適培養(yǎng)基將是微生物學或發(fā)酵科學領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。已知直接或間接調(diào)節(jié)分解代謝物阻抑的試劑的使用，例如環(huán)狀腺苷2＇3＇-一磷酸也可以摻入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)。
用于發(fā)酵的合適pH范圍為pH5.0-pH9.0，其中pH6.0-pH8.0作為初始條件是優(yōu)選的。
發(fā)酵可以在需氧或厭氧條件下進行，其中厭氧或微需氧條件是優(yōu)選的。
在發(fā)酵培養(yǎng)基中生產(chǎn)的1-丁醇量可以使用本領(lǐng)域已知的許多方法來測定，例如，高效液相層析(HPLC)或氣相層析(GC)。
工業(yè)分批和連續(xù)發(fā)酵 本方法使用分批發(fā)酵法。傳統(tǒng)分批發(fā)酵是其中培養(yǎng)基組成在發(fā)酵開始時設(shè)定，且在發(fā)酵期間不實施人工改變的封閉系統(tǒng)。因此，在發(fā)酵開始時，用所需一種或多種生物接種培養(yǎng)基，且允許發(fā)酵發(fā)生而不向系統(tǒng)中添加任何東西。然而，一般地“分批”發(fā)酵是就碳源添加而言的分批，且通常在控制因素例如pH和氧濃度方面進行嘗試。在分批系統(tǒng)中，系統(tǒng)的代謝物和生物量組成不斷改變直至發(fā)酵停止時。在分批培養(yǎng)中，細胞適度(moderate)通過靜態(tài)滯后期至高生長對數(shù)期，且最后至其中生長速率減小或停止的穩(wěn)定期。如果未處理，那么穩(wěn)定期的細胞將最終死亡。對數(shù)期的細胞一般負責終產(chǎn)物或中間物的大量生產(chǎn)。
關(guān)于標準分批系統(tǒng)的變化是補料分批系統(tǒng)(Fed-Batch system)。補料分批發(fā)酵方法也適合于本發(fā)明，且除了底物隨發(fā)酵進展以增量添加之外，包含一般的分批系統(tǒng)。當分解代謝物阻抑傾向于抑制細胞代謝且希望在培養(yǎng)基中具有有限量的底物時，補料分批系統(tǒng)是有用的。補料分批系統(tǒng)中的實際底物濃度測量是困難的，且因此基于可測量因素例如pH、溶解氧和廢氣例如CO2的分壓變化來估計。分批和補料分批發(fā)酵是本領(lǐng)域常見和眾所周知的，并且例子可以在下述參考文獻中找到Thomas D.Brock in BiotechnologyA Textbook of IndustrialMicrobiology，第2版(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36227，(1992)，所述參考文獻引入本文作為參考。
盡管本發(fā)明以分批模式來進行，但預(yù)期該方法將適應(yīng)于連續(xù)發(fā)酵法。連續(xù)發(fā)酵是其中向生物反應(yīng)器中連續(xù)添加確定成分發(fā)酵培養(yǎng)基，且同時取出等量條件培養(yǎng)基用于加工的開放系統(tǒng)。連續(xù)發(fā)酵一般使培養(yǎng)物維持在恒定高密度，其中細胞主要處于對數(shù)生長期。
連續(xù)發(fā)酵允許調(diào)節(jié)影響細胞生長或終產(chǎn)物濃度的一種因素或許多因素。例如，一種方法將使限制營養(yǎng)物例如碳源或氮水平維持在固定比率，且允許所有其他參數(shù)保持適度。在其他系統(tǒng)中，影響生長的許多因素可以不斷改變，而通過培養(yǎng)基濁度測量的細胞濃度保持恒定。連續(xù)系統(tǒng)努力維持穩(wěn)定狀態(tài)生長條件，且因此由于培養(yǎng)基排出的細胞喪失必須針對發(fā)酵中的細胞生長速率進行平衡。對于連續(xù)發(fā)酵方法調(diào)節(jié)營養(yǎng)物和生長因子的方法以及使產(chǎn)物發(fā)酵速率達到最大的技術(shù)是工業(yè)微生物學領(lǐng)域眾所周知的，且各種方法由Brock同上詳細描述。
預(yù)期本發(fā)明可以使用分批、補料分批或連續(xù)方法進行實踐，且任何已知發(fā)酵模式都將是合適的。此外，預(yù)期細胞可以作為全細胞催化劑固定化在底物上，且實施用于1-丁醇生產(chǎn)的發(fā)酵條件。
從發(fā)酵培養(yǎng)基分離1-丁醇的方法 生物生產(chǎn)的1-丁醇可以使用本領(lǐng)域已知方法從發(fā)酵培養(yǎng)基進行分離。例如，固體可以通過離心、過濾、傾析等從發(fā)酵培養(yǎng)基中取出。隨后，1-丁醇可以使用例如蒸餾、液液提取、或基于膜的分離的方法從發(fā)酵培養(yǎng)基分離，所述發(fā)酵培養(yǎng)基已如上所述進行處理以取出固體。因為1-丁醇與水形成低沸點、共沸混合物，所以蒸餾只能用于使混合物分離直至其共沸組成。蒸餾可以與另一種分離方法組合使用，以獲得大約在共沸混合物的分離?？梢耘c蒸餾組合使用以分離和純化1-丁醇的方法包括但不限于，傾析、液液提取、吸附、和基于膜的技術(shù)。此外，1-丁醇可以使用共沸蒸餾使用共沸劑進行分離(參見例如Doherty和Malone，Conceptual Design of Distillation Systems，McGraw Hill，New York，2001)。
1-丁醇-水混合物形成不均態(tài)共沸混合物，從而使得蒸餾可以與傾析組合使用以分離和純化1-丁醇。在這種方法中，將包含1-丁醇的發(fā)酵液體培養(yǎng)基蒸餾至接近共沸組成。隨后，將共沸混合物濃縮，且通過傾析使1-丁醇與發(fā)酵培養(yǎng)基分開。傾析的水相可以作為回流送回第一個蒸餾柱。富含1-丁醇的傾析的有機相可以通過在第二個蒸餾柱中蒸餾進一步得到純化。
1-丁醇還可以使用液液提取與蒸餾組合從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離。在這種方法中，1-丁醇使用液液提取用合適的溶劑從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中提取。含1-丁醇的有機相隨后進行蒸餾以使1-丁醇與溶劑分開。
蒸餾與吸附組合也可以用于從發(fā)酵培養(yǎng)基分離1-丁醇。在這種方法中，將包含1-丁醇的發(fā)酵液體培養(yǎng)基蒸餾至接近共沸組成，且隨后剩余的水通過使用吸附劑例如分子篩去除(Aden等人LignocellulosicBiomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-CurrentDilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover，Report NREL/TP-510-32438，National Renewable Energy Laboratory，June 2002)。
此外，蒸餾與全蒸發(fā)組合可以用于從發(fā)酵培養(yǎng)基分離和純化1-丁醇。在這種方法中，將包含1-丁醇的發(fā)酵液體培養(yǎng)基蒸餾至接近共沸組成，且隨后剩余的水經(jīng)由全蒸發(fā)通過親水膜去除(Guo等人，J.Membr.Sci.245，199-210(2004))。
實施例 本發(fā)明在下述實施例中進一步限定。應(yīng)當理解這些實施例在指出本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的同時，僅作為舉例說明而給出。由于上文討論和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不背離其精神和范圍的情況下，可以進行本發(fā)明的各種變化和修飾以使其適應(yīng)各種用途和條件。
一般方法 實施例中使用的標準重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的，且由下述參考文獻描述Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory PressCold Spring Harbor，(1989)(Maniatis)，T.J.Silhavy，M.L.Bennan和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1984)，和Ausubel，F(xiàn).M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，由GreenePublishing Assoc and Wiley-lnterscience出版(1987)。
適合于細菌培養(yǎng)物維持和生長的材料和方法是本領(lǐng)域眾所周知的。適合于在下述實施例中使用的技術(shù)可以如下述參考文獻中所述找到Manual of Methods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，NoelR.Krieg和G.Briggs Phillips，eds)，American Society for Microbiology，Washington，DC.(1994))或Thomas D.Brock in BiotechnologyATextbook of Industrial Microbiology，第2版，Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA(1989)。除非另有說明，用于細菌細胞生長和維持的所有試劑、限制酶和材料都得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，Wl)、BD Diagnostic Systems(Sparks，MD)、Life Technologies(Rockville，MD)、或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。
在下述實施例中用于克隆的寡核苷酸引物在表4中給出。用于測序或篩選克隆的基因的引物在表5中給出。所有寡核苷酸引物都由Sigma-Genosys(Woodlands，TX)合成。
表4 寡核苷酸克隆引物 表5 測序和PCR篩選引物 用于測定培養(yǎng)基中的1-丁醇濃度的方法 培養(yǎng)基中的1-丁醇濃度可以通過本領(lǐng)域已知的許多方法進行測定。例如，具體高效液相層析(HPLC)法使用購自Waters Corporation(Milford，MA)的Shodex SH-1011柱與Shodex SH-G保護柱，其具有折射率(RI)檢測。層析分離使用流速為0.5mL/分鐘的0.01M H2SO4作為流動相和50℃的柱溫來完成。1-丁醇在使用的條件下具有52.8分鐘的保留時間。可替代地，氣相層析(GC)法是可用的。例如，具體GC法使用HP-INNOWax柱(30m x 0.53mm id，1μm膜厚度，AgilentTechnologies，Wilmington，DE)，其具有火焰離子化檢測器(FID)。載氣是流速為4.5mL/分鐘的氦，使用恒定排出壓力于150℃測量；注射器分流在200℃時為125；烤箱溫度為45℃1小時，以10℃/分鐘45-220℃，和220℃5分鐘；和于240℃使用FID檢測，其具有26mL/分鐘氦補充氣體。1-丁醇的保留時間為5.4分鐘。使用Varian CP-WAX58(FFAP)CB柱(25m x 0.25mm id X 0.2μm膜厚度，Varian，Inc.，Palo Alto，CA)的類似GC法也可以使用。
縮寫含義如下“s”表示秒，“min”表示分鐘，“h”表示小時，“psi”表示磅/平方英寸，“nm”表示納米，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“mm”表示毫米，“nm”表示納米，“mM”表示毫摩爾濃度(millimolar)，“M”表示摩爾濃度(molar)，“mmol”表示毫摩爾，“μmole”表示微摩爾，“g”表示克，“μg”表示微克和“ng”表示納克，“PCR”表示聚合酶鏈反應(yīng)，“OD”表示光密度，“OD600”表示在600nm波長處測量的光密度，“OD550”表示在550nm波長處測量的光密度，“kDa”表示千道爾頓，“g”表示重力加速度，“rpm”表示每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，“bp”表示堿基對，“kbp”表示千堿基對，“％w/v”表示重量/體積百分比，“％v/v”表示體積/體積百分比，“HPLC”表示高效液相層析，且“GC”表示氣相層析。
實施例1 乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的克隆和表達 這個實施例的目的是在大腸桿菌中表達乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶，在本文中也稱為乙酰乙酰輔酶A硫解酶。乙酰乙酰輔酶A硫解酶基因thlA從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)克隆且在大腸桿菌中表達。thlA基因使用PCR從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA擴增，從而導致產(chǎn)生1.2kbp產(chǎn)物。
來自丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)的基因組DNA購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，或如下所述從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)培養(yǎng)物分離。
來自丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)的基因組DNA由厭氧生長的培養(yǎng)物制備。梭菌屬菌株在塞好和卷曲的100mL Bellco血清瓶(BellcoGlass Inc.，Vineland，NJ)的10mL梭菌生長培養(yǎng)基(Lopez-Contreras等人，Appl.Env.Microbiol.69(2)，869-877(2003))中，在厭氧室中于30℃生長。接種物是來自2X YTG板(Kishii，等人，AntimicrobialAgents & Chemotherapy，47(1)，77-81(2003))在2.5L MGCAnaeroPakTM(Mitsubishi Gas Chemical America Inc，New York，NY)中于37℃生長的單個菌落。
基因組DNA使用Gentra

試劑盒(Gentra Systems，Inc.，Minneapolis，MN；目錄號D-6000A)，使用制造商說明書的修改(Wong等人，Current Microbiology，32，349-356(1996))進行制備。thlA基因通過PCR使用引物N7和N8(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因組DNA進行擴增，所述引物N7和N8分別作為SEQ ID NO21和22給出。其他PCR擴增試劑在制造商的試劑盒例如Kod HiFi DNAPolymerase(Novagen Inc.，Madison，WI；目錄號71805-3)中提供，且根據(jù)制造商的規(guī)程使用。擴增在DNA Thermocycler GeneAmp 9700(PE Applied Biosystems，F(xiàn)oster city，CA)中進行。
對于表達研究，使用Gateway克隆技術(shù)(Invitrogen Co rp.，Carlsbad，CA)。進入載體(entry vector)pENTR/SD/D-TOPO允許定向克隆且為目的基因提供SD序列。目的載體pDEST14使用T7啟動子用于表達無標簽的基因。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個堿基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內(nèi)，以產(chǎn)生質(zhì)粒pENTRSDD-TOPOthlA。將pENTR構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10(Invitrogen)細胞內(nèi)，且根據(jù)制造商的建議進行鋪平板。轉(zhuǎn)化體生長過夜，且使用QIAprep Spin Miniprep試劑盒(Qiagen，Valencia，CA；目錄號27106)根據(jù)制造商的建議制備質(zhì)粒DNA。提交克隆用于由M13正向和反向引物(參見表5)測序，所述M13正向和反向引物分別作為SEQ ID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。需要另外的測序引物N7SeqF1和N7SeqR1(參見表5)以對PCR產(chǎn)物完全測序，所述N7SeqF1和N7SeqR1分別作為SEQ IDNOs47和48給出。關(guān)于這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預(yù)測氨基酸序列分別作為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2給出。
為了生成表達克隆，通過重組將thlA基因轉(zhuǎn)移至pDEST14載體以產(chǎn)生pDEST14thlA。將pDEST14thlA載體轉(zhuǎn)化到BL21-AI細胞內(nèi)。將轉(zhuǎn)化體接種到補加了50μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基內(nèi)且生長過夜。等分試樣的過夜培養(yǎng)物用于接種補加了50μg/mL氨芐青霉素的50mLLB。培養(yǎng)物于37℃伴隨振蕩溫育直至OD600達到0.6-0.8。將培養(yǎng)物分成2個25-mL培養(yǎng)物，且將阿拉伯糖加入瓶之一至0.2重量％的終濃度。陰性對照瓶不用阿拉伯糖誘導。瓶于37℃伴隨振蕩溫育4小時。細胞通過離心進行收獲，且將細胞沉淀重懸浮于50mM MOPS，pH7.0緩沖液中。細胞通過超聲處理或通過弗氏壓碎器來破壞。將全細胞溶解產(chǎn)物離心，從而產(chǎn)生上清液或無細胞提取物和沉淀或不溶性級分。將等分試樣的每種級分(全細胞溶解產(chǎn)物、無細胞提取物和不溶性級分)重懸浮于SDS(MES)加樣緩沖液(Invitrogen)中，加熱至85℃ 10分鐘，且實施SDS-PAGE分析(NuPAGE 4-12％Bis-Tris Gel，目錄號NP0322Box，Invitrogen)。如由核酸序列推導的預(yù)期分子量約41kDa的蛋白質(zhì)，存在于誘導的培養(yǎng)物中但不存在于未誘導的對照中。
無細胞提取物中的乙酰乙酰輔酶A硫解酶活性通過監(jiān)控303nm處吸光度中的減少作為Mg2+-乙酰乙酰輔酶A復(fù)合物降解來測量。標準測定條件為100mM Tris-HCl pH8.0，1mM DTT(二硫蘇糖醇)和10mMMgCl2。使混合物(cocktail)于37℃平衡5分鐘；隨后加入無細胞提取物。反應(yīng)用添加0.05mM乙酰乙酰輔酶A加0.2mM輔酶A來起始。蛋白質(zhì)濃度通過Bradford方法或通過Bicinchoninic Kit(Sigma，目錄號BCA-1)來測量。牛血清清蛋白(Bio-Rad，Hercules，CA)在2種情況下用作標準。在一種一般測定中，與未誘導的培養(yǎng)物中的0.27μmolmg-1min-1比較，誘導的培養(yǎng)物中的ThlA蛋白質(zhì)比活性測定為16.0μmolmg-1min-1。
實施例2 乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶的克隆和表達 這個實施例的目的是在大腸桿菌中表達乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶，在本文中也稱為乙酰乙酰輔酶A硫解酶。乙酰乙酰輔酶A硫解酶基因thlB從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)克隆且在大腸桿菌中表達。thlB基因使用PCR從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA擴增。
thlB基因以與實施例1中所述的thlA基因相同的方式克隆和表達。丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA通過PCR使用引物N15和N16(參見表4)來擴增，所述引物N15和N16分別作為SEQ ID NOs27和28給出，從而產(chǎn)生1.2kbp產(chǎn)物。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個堿基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內(nèi)，以產(chǎn)生質(zhì)粒pENTRSDD-TOPOthlB。提交克隆用于由M13正向和反向引物測序，所述M13正向和反向引物分別作為SEQID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。需要另外的測序引物N15SeqF1和N16SeqR1(參見表5)以對PCR產(chǎn)物完全測序，所述N15SeqF1和N16SeqR1分別作為SEQ ID NOs49和50給出。關(guān)于這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預(yù)測氨基酸序列分別作為SEQ ID NO3和SEQ ID NO4給出。
為了生成表達克隆，通過重組將thlB基因轉(zhuǎn)移至pDEST14(Invitrogen)載體以產(chǎn)生pDEST14thlB。將pDEST14thlB載體轉(zhuǎn)化到BL21-AI細胞內(nèi)，且通過添加阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。如由核酸序列推導的預(yù)期分子量約42kDa的蛋白質(zhì)，存在于誘導的培養(yǎng)物中但不存在于未誘導的對照中。酶測定如實施例1中所述進行。在一種一般測定中，與未誘導的培養(yǎng)物中的0.28μmol mg-1min-1比較，誘導的培養(yǎng)物中的ThlB蛋白質(zhì)比活性測定為14.9μmol mg-1min-1。
實施例3 3-羥丁酰輔酶A脫氫酶的克隆和表達 這個實施例的目的是從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)克隆hbd基因且在大腸桿菌中表達它。hbd基因使用PCR從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因組DNA擴增。
hbd基因使用實施例1中所述方法進行克隆和表達。hbd基因通過PCR使用引物N5和N6(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物N5和N6分別作為SEQ ID NO19和20給出，從而產(chǎn)生881bp產(chǎn)物。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個堿基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內(nèi)，以產(chǎn)生質(zhì)粒pENTRSDD-TOPOhbd。提交克隆用于由M13正向和反向引物測序，所述M13正向和反向引物分別作為SEQ ID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。需要另外的測序引物N5SeqF2和N6SeqR2(參見表5)以對PCR產(chǎn)物完全測序，所述N5SeqF2和N6SeqR2分別作為SEQ ID NOs51和52給出。關(guān)于這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預(yù)測氨基酸序列分別作為SEQ ID NO5和SEQ ID NO6給出。
為了生成表達克隆，通過重組將hbd基因轉(zhuǎn)移至pDEST 14(Invitrogen)載體以產(chǎn)生pDEST14hbd。如實施例1中所述，將pDEST14hbd載體轉(zhuǎn)化到BL21-AI細胞內(nèi)，且通過添加阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。如由核酸序列推導的預(yù)期分子量約31kDa的蛋白質(zhì)，存在于誘導的培養(yǎng)物中但不存在于未誘導的對照中。
如通過340nm處吸光度中的減少測量的，通過測量NADH氧化率來測定羥丁酰輔酶A脫氫酶活性。標準測定混合物包含50mM MOPS，pH7.0，1mM DTT和0.2mM NADH。使混合物于37℃平衡5分鐘，且隨后加入無細胞提取物。反應(yīng)通過添加底物0.1mM乙酰乙酰輔酶A來起始。在一種一般測定法中，與未誘導的培養(yǎng)物中的0.885μmol mg-1min-1比較，誘導的培養(yǎng)物中的BHBD蛋白質(zhì)比活性測定為57.4μmolmg-1min-1。
實施例4 巴豆酸酶的克隆和表達 這個實施例的目的是從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)克隆crt基因且在大腸桿菌中表達它。crt基因使用PCR從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA擴增。
crt基因使用實施例1中所述方法進行克隆和表達。crt基因通過PCR使用引物N3和N4(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物N3和N4分別作為SEQ ID NO17和18給出，從而產(chǎn)生794bp產(chǎn)物。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個堿基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內(nèi)，以產(chǎn)生質(zhì)粒pENTRSDD-TOPOcrt。提交克隆用于由M13正向和反向引物測序，所述M13正向和反向引物分別作為SEQ ID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。關(guān)于這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預(yù)測氨基酸序列分別作為SEQ IDNO7和SEQ ID NO8給出。
為了生成表達克隆，通過重組將crt基因轉(zhuǎn)移至pDEST 14(Invitrogen)載體以產(chǎn)生pDEST14crt。如實施例1中所述，將pDEST14crt載體轉(zhuǎn)化到BL21-AI細胞內(nèi)，且通過添加阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。如由核酸序列推導的預(yù)期分子量約28kDa的蛋白質(zhì)，存在于誘導的培養(yǎng)物中的量比未誘導的對照中的多得多。
巴豆酸酶活性如Stern(Methods Enzymol.1，559-566，(1954))所述進行測定。在一種一般測定中，與未誘導的培養(yǎng)物中的47μmolmg-1min-1比較，誘導的培養(yǎng)物中的巴豆酸酶蛋白質(zhì)比活性測定為444μmol mg-1min-1。
實施例5 丁酰輔酶A脫氫酶的克隆和表達 這個實施例的目的是在大腸桿菌中表達丁酰輔酶A脫氫酶，在本文中也稱為反式-2-烯酰輔酶A還原酶。CAC0462基因，推定的反式-2-烯酰輔酶A還原酶同源物從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)克隆且在大腸桿菌中表達。CAC0462基因使用PCR從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA擴增。
CAC0462基因使用實施例1中所述方法進行克隆和表達。CAC0462基因通過PCR使用引物N17和N21(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物N17和N21分別作為SEQ ID NO29和30給出，從而產(chǎn)生1.3kbp產(chǎn)物。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個堿基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內(nèi)，以產(chǎn)生質(zhì)粒pENTRSDD-TOPOCAC0462。提交克隆用于由M13正向和反向引物測序，所述M13正向和反向引物分別作為SEQ ID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。需要另外的測序引物N22SeqF1(SEQ ID NO53)、N22SeqF2(SEQ ID NO54)、N22SeqF3(SEQ ID NO55)、N23SeqR1(SEQ ID NO56)、N23SeqR2(SEQID NO57)、和N23SeqR3(SEQ ID NO58)(參見表5)以對PCR產(chǎn)物完全測序。關(guān)于這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預(yù)測氨基酸序列分別作為SEQ ID NO9和SEQ ID NO10給出。
為了生成表達克隆，通過重組將CAC0462基因轉(zhuǎn)移至pDEST 14(Invitrogen)載體以產(chǎn)生pDEST14CAC0462。如實施例1中所述，將pDEST14CAC0462載體轉(zhuǎn)化到BL21-AI細胞內(nèi)，且通過添加阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。通過SDS-PAGE的分析顯示在陰性對照或誘導的培養(yǎng)物中沒有預(yù)期分子量的超表達的蛋白質(zhì)。丙酮丁醇梭菌CAC0462基因使用許多罕見的大腸桿菌密碼子。為了避免密碼子選擇問題，將pRARE質(zhì)粒(Novagen)轉(zhuǎn)化到具有pDEST14CAC0462載體的BL21-A1細胞內(nèi)。用攜帶pRARE載體的培養(yǎng)物重復(fù)使用阿拉伯糖誘導的表達研究。預(yù)期分子量約46kDa的蛋白質(zhì)存在于誘導的培養(yǎng)物中但不存在于未誘導的對照中。
反式-2-烯酰輔酶A還原酶活性如Hoffmeister等人(J.Biol.Chem.280，4329-4338(2005))所述進行測定。在一種一般測定中，與未誘導的培養(yǎng)物中的0.0128μmol mg-1min-1比較，誘導的培養(yǎng)物中的TERCAC0462蛋白質(zhì)比活性測定為0.694μmol mg-1min-1。
實施例6 丁醛脫氫酶(乙酰化)的克隆和表達 這個實施例的目的是從拜氏梭菌(ATCC 35702)克隆ald基因且在大腸桿菌中表達它。ald基因使用PCR從拜氏梭菌(ATCC 35702)基因組DNA擴增。
ald基因使用實施例1中所述方法進行克隆和表達。ald基因通過PCR使用引物N27F1和N28 R1(參見表4)從拜氏梭菌(ATCC 35702)基因組DNA(如實施例1中所述由厭氧生長的培養(yǎng)物制備)進行擴增，所述引物N27F1和N28 R1分別作為SEQ ID NO31和32給出，從而產(chǎn)生1.6kbp產(chǎn)物。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個堿基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內(nèi)，以產(chǎn)生質(zhì)粒pENTRSDD-TOPOald。提交克隆用于由M13正向和反向引物測序，所述M13正向和反向引物分別作為SEQ ID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。需要另外的測序引物N31SeqF2(SEQ ID NO59)、N31SeqF3(SEQ ID NO60)、N31SeqF4(SEQ ID NO61)、N32SeqR1(SEQ ID NO72)、N31SeqR2(SEQID NO62)、N31SeqR3(SEQ ID NO63)、N31SeqR4(SEQ ID NO64)、和N31SeqR5(SEQ ID NO65)(參見表5)以對PCR產(chǎn)物完全測序。關(guān)于這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預(yù)測氨基酸序列分別作為SEQ ID NO11和SEQ ID NO12給出。
為了生成表達克隆，通過重組將ald基因轉(zhuǎn)移至pDEST14(Invitrogen)載體以產(chǎn)生pDEST14ald。如實施例1中所述，將pDEST14ald載體轉(zhuǎn)化到BL21-AI細胞內(nèi)，且通過添加阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。如由核酸序列推導的預(yù)期分子量約51kDa的蛋白質(zhì)，存在于誘導的培養(yǎng)物中但不存在于未誘導的對照中。
如Husemann等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.31435-444(1989))所述，如通過340nm處吸光度中的增加測量的，通過監(jiān)控NADH的形成來測定?；┟摎涿富钚?。在一種一般測定中，與未誘導的培養(yǎng)物中的0.01μmol mg-1min-1比較，誘導的培養(yǎng)物中的Ald蛋白質(zhì)比活性測定為0.106μmol mg-1min-1。
實施例7 丁醇脫氫酶的克隆和表達 這個實施例的目的是從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)克隆bdhB基因且在大腸桿菌中表達它。bdhB基因使用PCR從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因組DNA擴增。
bdhB基因使用實施例1中所述方法進行克隆和表達。bdhB基因通過PCR使用引物N11和N12(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物N11和N12分別作為SEQ ID NO25和26給出，從而產(chǎn)生1.2kbp產(chǎn)物。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個堿基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內(nèi)，以產(chǎn)生質(zhì)粒pENTRSDD-TOPObdhB。翻譯起始密碼子也通過引物序列從“GTG”變成“ATG”。提交克隆用于由M13正向和反向引物測序，所述M13正向和反向引物分別作為SEQ ID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。需要另外的測序引物N11SeqF1(SEQ ID NO66)、N11SeqF2(SEQ ID NO67)、N12SeqR1(SEQ ID NO68)、和N12SeqR2(SEQ ID NO69)(參見表5)以對PCR產(chǎn)物完全測序。關(guān)于這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預(yù)測氨基酸序列分別作為SEQ ID NO13和SEQID NO14給出。
為了生成表達克隆，通過重組將bdhB基因轉(zhuǎn)移至pDEST14(Invitrogen)載體以產(chǎn)生pDEST14bdhB。如實施例1中所述，將pDEST14bdhB載體轉(zhuǎn)化到BL21-AI細胞內(nèi)，且通過添加阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。如由核酸序列推導的預(yù)期分子量約43kDa的蛋白質(zhì)，存在于誘導的培養(yǎng)物但不存在于未誘導的對照中。
如Husemann和Papoutsakis同上所述，如通過340nm處吸光度中的減少測量的，由NADH的氧化率來測定丁醇脫氫酶活性。在一種一般測定中，與未誘導的培養(yǎng)物中的0.022μmol mg-1min-1比較，誘導的培養(yǎng)物中的BdhB蛋白質(zhì)比活性測定為0.169μmol mg-1min-1。
實施例8 丁醇脫氫酶的克隆和表達 這個實施例的目的是從丙酮丁醇梭菌824克隆bdhA基因且在大腸桿菌中表達它。bdhA基因使用PCR從丙酮丁醇梭菌824基因組DNA擴增。
bdhA基因使用實施例1中所述方法進行克隆和表達。bdhA基因通過PCR使用引物N9和N10(參見表4)從丙酮丁醇梭菌824基因組DNA進行擴增，所述引物N9和N10分別作為SEQ ID NO23和24給出，從而產(chǎn)生1.2kbp產(chǎn)物。正向引物摻入緊鄰翻譯起始密碼子的4個堿基(CACC)，以允許定向克隆到pENTR/SD/D-TOPO(Invitrogen)內(nèi)，以產(chǎn)生質(zhì)粒pENTRSDD-TOPObdhA?？寺》謩e作為SEQ ID NOs45和46給出，以證實基因以正確方向插入且證實序列。需要另外的測序引物N9SeqF1(SEQ ID NO70)和N10SeqR1(SEQ ID NO71)(參見表5)以對PCR產(chǎn)物完全測序。關(guān)于這種基因的可讀框(ORF)的核苷酸序列以及酶的預(yù)測氨基酸序列分別作為SEQ ID NO15和SEQ ID NO16給出。
為了生成表達克隆，通過重組將bdhA基因轉(zhuǎn)移至pDEST14(Invitrogen)載體以產(chǎn)生pDEST14bdhA。如實施例1中所述，將pDEST14bdhA載體轉(zhuǎn)化到BL21-AI細胞內(nèi)，且通過添加阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。如由核酸序列推導的預(yù)期分子量約43kDa的蛋白質(zhì)，存在于誘導的培養(yǎng)物但不存在于未誘導的對照中。
如Husemann和Papoutsakis同上所述，如通過340nm處吸光度中的減少測量的，由NADH的氧化率來測定丁醇脫氫酶活性。在一種一般測定中，與未誘導的培養(yǎng)物中的0.028μmol mg-1min-1比較，誘導的培養(yǎng)物中的BdhA蛋白質(zhì)比活性測定為0.102μmol mg-1min-1。
實施例9 關(guān)于1-丁醇生物合成途徑中的基因的轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建-下游(lower)途徑 為了構(gòu)建包含編碼1-丁醇生物合成途徑中6個步驟的基因的轉(zhuǎn)化載體，將編碼途徑中6個步驟的基因分成2個操縱子。上游途徑包含由乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、3-羥丁酰輔酶A脫氫酶、巴豆酸酶和丁酰輔酶A脫氫酶催化的前4個步驟。下游途徑包含由丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶催化的后2個步驟。
這個實施例的目的是構(gòu)建下游途徑操縱子。上游途徑操縱子的構(gòu)建在實施例10中描述。
個別基因通過PCR使用引物進行擴增，所述引物摻入限制位點以用于稍后克隆，且正向引物包含最優(yōu)化的大腸桿菌核糖體結(jié)合位點(AAAGGAGG)。將PCR產(chǎn)物TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO載體內(nèi)且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞(Invitrogen)內(nèi)。質(zhì)粒DNA由TOPO克隆制備且驗證基因序列。限制酶和T4DNA連接酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)根據(jù)制造商的建議使用。對于克隆實驗，限制片段通過凝膠電泳使用QIAquick Gel Extraction試劑盒(Qiagen)進行純化。
序列證實后，將基因亞克隆到作為克隆平臺的修飾的pUC19載體內(nèi)。pUC19載體通過HindIII/SapI消化進行修飾，從而產(chǎn)生pUC19dHS。消化去除鄰近于MCS(多克隆位點)的lac啟動子，從而防止操縱子在載體中轉(zhuǎn)錄。
ald基因通過PCR使用引物N58和N59(參見表4)從拜氏梭菌ATCC 35702基因組DNA進行擴增，所述引物N58和N59分別作為SEQ ID NO41和42給出，從而產(chǎn)生1.5kbp產(chǎn)物。正向引物摻入限制位點AvaI和BstEII以及RBS(核糖體結(jié)合位點)。反向引物摻入HpaI限制位點。將PCR產(chǎn)物克隆到pCRBlunt II-TOPO內(nèi)，從而產(chǎn)生pCRBluntII-ald。質(zhì)粒DNA由TOPO克隆制備，且用下述引物驗證基因序列M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N31SeqF2(SEQ ID NO59)、N31SeqF3(SEQ ID NO60)、N31SeqF4(SEQ ID NO61)、N32SeqR1(SEQ ID NO72)、N31SeqR2(SEQID NO62)、N31SeqR3SEQ ID NO63)、N31SeqR4(SEQ ID NO64)、和N31SeqR5(SEQ ID NO65)(參見表5)。
bdhB基因通過PCR使用引物N64和N65(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物N64和N65分別作為SEQ ID NO43和44給出，從而產(chǎn)生1.2kbp產(chǎn)物。正向引物摻入HpaI限制位點和RBS。反向引物摻入PmeI和SphI限制位點。將PCR產(chǎn)物克隆到pCRBlunt II-TOPO內(nèi)，從而產(chǎn)生pCRBluntII-bdhB。質(zhì)粒DNA由TOPO克隆制備，且用下述引物驗證基因序列M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N11SeqF1(SEQID NO66)、N11SeqF2(SEQ ID NO67)、N12SeqR1(SEQ ID NO68)、和N12SeqR2(SEQ ID NO69)(參見表5)。
為了構(gòu)建下游途徑操縱子，使來自pCRBluntII-bdhB的1.2kbp SphI和HpaI片段，來自pCRBluntII-ald的1.4kbp HpaI和SphI片段，以及來自AvaI和SphI消化的pUC19dHS的大片段連接在一起。三向連接產(chǎn)生pUC19dHS-ald-bdhB。
pUC19dHS-ald-bdhB載體用BstEII和PmeI進行消化，從而釋放克隆到pBenBP內(nèi)的2.6kbp片段，所述pBenBP是大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體。質(zhì)粒pBenBP通過pBE93載體修飾產(chǎn)生，所述pBE93由Nagarajan，WO93/24631(實施例4)描述。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)中性蛋白酶啟動子(NPR)、信號序列和phoA基因用NcoI/HindIII消化從pBE93中去除。NPR啟動子通過引物BenF和BenBPR從pBE93進行PCR擴增，所述引物BenF和BenBPR分別由SEQ ID NO73和75給出。引物BenBPR摻入啟動子下游的BstEII、PmeI和HindIII位點。PCR產(chǎn)物用NcoI和HindIII進行消化，且將片段克隆到載體pBE93的相應(yīng)位點內(nèi)以產(chǎn)生pBenBP。將下游操縱子片段亞克隆到pBenBP中的BstEII和PmeI位點內(nèi)，從而產(chǎn)生pBen-ald-bdhB。
使用上述方法對粗提取物來進行關(guān)于丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶活性的測定。2種酶活性均在超過包含空載體的對照菌株的水平上得到證實。
實施例10(預(yù)示的) 關(guān)于1-丁醇生物合成途徑中的基因的轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建-上游途徑 這個預(yù)示的實施例的目的是描述如何裝配上游途徑操縱子。一般方法與實施例9中所述的相同。
thlA基因通過PCR使用引物對N44和N45(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因組DNA進行擴增，所述引物對N44和N45分別作為SEQ ID NO33和34給出，從而產(chǎn)生1.2kbp產(chǎn)物。正向引物摻入SphI限制位點和核糖體結(jié)合位點(RBS)。反向引物摻入AscI和PstI限制位點。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR4Blunt-TOPO內(nèi)，從而產(chǎn)生pCR4Blunt-TOPO-thlA。質(zhì)粒DNA由TOPO克隆制備，且用下述引物驗證基因序列M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ IDNO46)、N7SeqF1(SEQ ID NO47)、和N7SeqR1(SEQ ID NO48)(參見表5)。
hbd基因通過PCR使用引物對N42和N43(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物對N42和N43分別作為SEQ ID NO35和36給出，從而產(chǎn)生0.9kbp產(chǎn)物。正向引物摻入SalI限制位點和RBS。反向引物摻入SphI限制位點。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR4Blunt-TOPO內(nèi)，從而產(chǎn)生pCR4Blunt-TOPO-hbd。質(zhì)粒DNA由TOPO克隆制備，且用下述引物驗證基因序列M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N5SeqF2(SEQID NO51)、和N6SeqR2(SEQ ID NO52)(參見表5)。
CAC0462基因?qū)τ谠谧鳛榈谝凰拗鞯拇竽c桿菌和作為第二宿主的枯草芽孢桿菌中的表達進行密碼子最優(yōu)化。作為SEQ ID NO76給出的稱為CaTER的新基因由Genscript Corp(Piscataway，NJ)合成?；駽aTER作為BamHI-SalI片段克隆到pUC57載體中且包括RBS，從而產(chǎn)生質(zhì)粒pUC57-CaTER。
crt基因通過PCR使用引物對N38和N39(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物對N38和N39分別作為SEQ ID NO39和40給出，從而產(chǎn)生834bp產(chǎn)物。正向引物摻入EcoRI和MluI限制位點和RBS。反向引物摻入BamHI限制位點。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR4Blunt-TOPO內(nèi)，從而產(chǎn)生pCR4Blunt-TOPO-crt。質(zhì)粒DNA由TOPO克隆制備，且用引物M13正向(SEQ ID NO45)和M13反向(SEQ ID NO46)(參見表5)驗證基因序列。
序列證實后，將基因亞克隆到作為克隆平臺的修飾的pUC19載體內(nèi)。pUC19載體通過SphI/SapI消化進行修飾，從而產(chǎn)生pUC19dSS。消化去除鄰近于MCS的lac啟動子，從而防止操縱子在載體中轉(zhuǎn)錄。
為了構(gòu)建上游途徑操縱子，pCR4 Blunt-TOPO-crt用EcoRI和BamHI進行消化，從而釋放0.8kbp crt片段。pUC19dSS載體也用EcoRI和BamHI進行消化，從而釋放2.0kbp載體片段。crt片段和載體片段使用T4 DNA連接酶(New England Biolabs)連接在一起，以形成pUC19dSS-crt。CaTER基因通過用BamHI和SalI消化pUC57-CaTER從而釋放1.2kbp CaTER片段，插入pCU19dSS-crt內(nèi)。pUC19dSS-crt用BamHI和SalI進行消化，且使大載體片段與CaTER片段連接，從而產(chǎn)生pUC19dSS-crt-CaTER。為了完成操縱子，連接來自pCR4Blunt-TOPO-hbd的884 bp SalI和SphI片段，來自pCR4Blunt-TOPO-thlA的1.2 kb SphI和PstI thlA片段，以及來自pUC19dSS-crt-CaTER的SalI和PstI消化的大片段。三向連接產(chǎn)物是pUC19dSS-crt-CaTER-hbd-thlA。
pUC19dSS-crt-CaTER-hbd-thlA載體用MluI和AscI進行消化，從而釋放克隆到pBE93衍生物(Caimi，WO 2004/018645，第39-40頁)內(nèi)的4.1kbp片段，所述pBE93衍生物是大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體，稱為pBenMA。質(zhì)粒pBenMA通過pBE93載體修飾產(chǎn)生。解淀粉芽孢桿菌中性蛋白酶啟動子(NPR)、信號序列和phoA基因用NcoI/HindIII消化從pBE93中去除。NPR啟動子通過引物BenF和BenMAR從pBE93進行PCR擴增，所述引物BenF和BenMAR分別由SEQ ID NO73和74給出。引物BenMAR摻入啟動子下游的MluI、AscI和HindIII位點。PCR產(chǎn)物用NcoI和HindIII進行消化，且將片段克隆到載體pBE93的相應(yīng)位點內(nèi)，從而產(chǎn)生pBenMA。將上游操縱子片段亞克隆到pBenMA中的MluI和AscI位點內(nèi)，從而產(chǎn)生pBen-crt-hbd-CaTER-thlA。
實施例11(預(yù)示的) 1-丁醇生物合成途徑在大腸桿菌中的表達 這個預(yù)示的實施例的目的是描述如何在大腸桿菌中表達1-丁醇生物合成途徑。
將分別如實施例10和9中所述構(gòu)建的質(zhì)粒pBen-crt-hbd-CaTER-thlA和pBen-ald-bdhB轉(zhuǎn)化到大腸桿菌NM522(ATCC47000)內(nèi)，且每個操縱子中的基因表達通過SDS-PAGE分析、酶測定和蛋白質(zhì)印跡分析來監(jiān)控。對于蛋白質(zhì)印跡，抗體針對經(jīng)由Sigma-Genosys(The Woodlands，TX)的合成肽產(chǎn)生。所有基因的表達證實后，用EcoRI和PmeI消化pBen-ald-bdhB，以釋放NPR啟動子-ald-bdhB片段。將EcoRI消化的片段使用DNA聚合酶的克列諾(Klenow)片段(New England Biolabs，目錄號M0210S)平端化。質(zhì)粒pBen-crt-hbd-CaTER-thlA用PvuII進行消化，以產(chǎn)生線性化平端載體片段。使載體與NPR-ald-bdhB片段連接，從而產(chǎn)生p1B1 O.1和p1B1O.2，包含其中NPR啟動子-ald-bdhB片段為相反方向的完整1-丁醇生物合成途徑。將質(zhì)粒p1B1 O.1和p1B1 O.2轉(zhuǎn)化到大腸桿菌NM522內(nèi)，且如前所述監(jiān)控基因表達。
將大腸桿菌菌株NM522/p1B1 O.1或NM522/p1B1 O.1接種到包含50mL培養(yǎng)基的250mL搖瓶內(nèi)，且于250rpm和35℃振蕩。培養(yǎng)基由下述組成葡萄糖，5g/L；MOPS，0.05M；硫酸銨0.01M；一代磷酸鉀，0.005M；S10金屬混合物，1％(v/v)；酵母提取物，0.1％(w/v)；酪蛋白氨基酸，0.1％(w/v)；硫胺素，0.1mg/L；脯氨酸，0.05mg/L；和生物素0.002mg/L，且用KOH滴定至pH7.0。S10金屬混合物包含MgCl2，200mM；CaCl2，70mM；MnCl2，5mM；FeCl3，0.1mM；ZnCl2，0.1mM；鹽酸硫胺素，0.2mM；CuSO4，172μM；CoCl2，253μM；和Na2MoO4，242μM。18-24小時后，如一般方法部分中所述，1-丁醇通過HPLC或GC分析來檢測。
實施例12(預(yù)示的) 1-丁醇生物合成途徑在枯草芽孢桿菌中的表達 這個預(yù)示的實施例的目的是描述如何在枯草芽孢桿菌中表達1-丁醇生物合成途徑。使用與實施例11中所述相同的方法。
使用分別如實施例10和9中所述構(gòu)建的上游和下游操縱子。將質(zhì)粒p1B1 O.1和p1B1O.2轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌BE1010(J.Bacteriol.1732278-2282(1991))內(nèi)，且如實施例11中所述監(jiān)控每個操縱子中的基因表達。
將枯草芽孢桿菌菌株BE1010/p1B1 O.1或BE1010/p1B1 O.2接種到包含50mL培養(yǎng)基的250mL搖瓶內(nèi)，且于250rpm和35℃振蕩18小時。培養(yǎng)基由下述組成葡萄糖，5g/L；MOPS，0.05M；谷氨酸，0.02M；硫酸銨0.01M；一代磷酸鉀緩沖液，0.005M；S10金屬混合物(如實施例11中所述)，1％(v/v)；酵母提取物，0.1％(w/v)；酪蛋白氨基酸，0.1％(w/v)；色氨酸，50mg/L；甲硫氨酸，50mg/L；和賴氨酸，50mg/L，且用KOH滴定至pH7.0。18-24小時后，如一般方法部分中所述，1-丁醇通過HPLC或GC分析來檢測。
實施例13 使用重組大腸桿菌從葡萄糖生產(chǎn)1-丁醇 這個實施例描述了1-丁醇在大腸桿菌中的生產(chǎn)。編碼1-丁醇生物合成途徑6個步驟的基因的表達分成3個操縱子。上游途徑包含在1個操縱子中由thlA、hbd、crt和EgTER編碼的前4個步驟。由ald編碼的下一個步驟由第2個操縱子提供。由yqhD編碼的途徑中的最后1個步驟在第3個操縱子中提供。1-丁醇生產(chǎn)在包含3個操縱子的大腸桿菌菌株中證實。
除非上下文另有說明，這個實施例中描述的克隆引物通過其SEQID NO參考表4，且測序和PCR篩選引物通過其SEQ ID NO參考表5。
乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶。thlA基因通過PCR使用引物對N44和N45(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因組DNA進行擴增，所述引物對N44和N45分別作為SEQ ID NO33和34給出，從而產(chǎn)生1.2kbp產(chǎn)物。正向引物摻入SphI限制位點和核糖體結(jié)合位點(RBS)。反向引物摻入AscI和PstI限制位點。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR4Blunt-TOPO(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)內(nèi)，從而產(chǎn)生pCR4Blunt-TOPO-thlA。質(zhì)粒DNA由TOPO克隆制備，且基因序列用下述引物驗證M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N7SeqF1(SEQ ID NO47)、和N7SeqR1(SEQ ID NO48)(參見表5)。
3-羥丁酰輔酶A脫氫酶。hbd基因通過PCR使用引物對N42和N43(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)基因組DNA進行擴增，所述引物對N42和N43分別作為SEQ ID NO35和36給出，從而產(chǎn)生0.9kbp產(chǎn)物。正向引物摻入SalI限制位點和RBS。反向引物摻入SphI限制位點。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR4Blunt-TOPO內(nèi)，從而產(chǎn)生pCR4Blunt-TOPO-hbd。質(zhì)粒DNA由TOPO克隆制備，且基因序列用下述引物驗證M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、N5SeqF2(SEQ ID NO51)、和N6SeqR2(SEQ ID NO52)(參見表5)。
巴豆酸酶。crt基因通過PCR使用引物對N38和N39(參見表4)從丙酮丁醇梭菌(ATCC824)基因組DNA進行擴增，所述引物對N38和N39分別作為SEQ ID NO39和40給出，從而產(chǎn)生834bp產(chǎn)物。正向引物摻入EcoRI和MluI限制位點和RBS。反向引物摻入BamHI限制位點。將PCR產(chǎn)物克隆到pCR4Blunt-TOPO內(nèi)，從而產(chǎn)生pCR4Blunt-TOPO-crt。質(zhì)粒DNA由TOPO克隆制備，且基因序列用引物M13正向(SEQ ID NO45)和M13反向(SEQ ID NO46)(參見表5)驗證。
丁酰輔酶A脫氫酶(反式-2-烯酰輔酶A還原酶)。CAC0462基因針對作為第一宿主的大腸桿菌和作為第二宿主的枯草芽孢桿菌中的增強的密碼子選擇進行合成。合成新基因(CaTER，SEQ ID NO76)且在pUC57載體中作為BamHI-SalI片段由Genscript Corporation(Piscataway，NJ)克隆，且包括RBS。
來自小眼蟲(TER，GenBank No.Q5EU90)的關(guān)于丁酰輔酶A脫氫酶的備選基因針對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的增強的密碼子選擇進行合成?；蛴蒅enScript Corporation合成和克隆到pUC57內(nèi)，從而產(chǎn)生pUC57::EgTER。引物N85和N86(分別為SEQ ID NO80和81)連同作為模板DNA的pUC57::EgTER，提供包含來自pUC57::EgTER DNA的1224bp的PCR片段。1224bp序列作為SEQ IDNO77給出，其中bp1-1218是EgTER(opt)的編碼序列(cds)。EgTER(opt)是密碼子最優(yōu)化的TER基因，從而缺乏正常的線粒體前序列，以便在大腸桿菌中起作用(Hoffmeister等人，J.Biol.Chem.2804329(2005))。
將EgTER(opt)克隆到pCR4Blunt-TOPO內(nèi)，并且其序列用引物M13正向(SEQ ID NO45)和M13反向(SEQ ID NO46)證實。需要另外的測序引物N62SeqF2(SEQ ID NO114)、N62SeqF3(SEQID NO115)、N62SeqF4(SEQ ID NO116)、N63SeqR1(SEQ IDNO117)、N63SeqR2(SEQ ID NO118)、N63SeqR3(SEQ ID NO119)和N63SeqR4(SEQ ID NO120)以對PCR產(chǎn)物完全測序。1.2kbpEgTER(opt)序列隨后用HincII和PmeI切割，并且克隆到用HincII線性化的pET23+(Novagen)內(nèi)。EgTER(opt)基因?qū)τ趩幼拥姆较蛲ㄟ^用引物T7Primer和N63SeqR2(分別為SEQ ID NO82和118)的菌落PCR篩選證實。將所得到的質(zhì)粒pET23+::EgTER(opt)轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)(Novagen)內(nèi)用于表達研究。
反式-2-烯酰輔酶A還原酶活性如Hoffmeister等人，J.Biol.Chem.280，4329(2005)所述進行測定。在一般測定中，與未誘導的培養(yǎng)物中的0.547μmol mg-1min-1比較，誘導的BL21(DE3)/pET23+::EgTER(opt)培養(yǎng)物中的EgTER(opt)蛋白質(zhì)比活性測定為1.9μmol mg-1min-1。
隨后將EgTER(opt)基因克隆到在trc啟動子控制下的pTrc99a載體內(nèi)。EgTER(opt)基因作為1287-bpBamHI/SalI片段從pET23+::EgTER(opt)分離。4.2kbp載體pTrc99a用BamHI/SalI線性化。使載體與片段連接，從而產(chǎn)生5.4kbp pTrc99a-EgTER(opt)。陽性克隆通過用引物Trc99aF和N63SeqR3(分別為SEQ ID NO83和119)的菌落PCR來證實，從而產(chǎn)生0.5kb產(chǎn)物。
包含編碼乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(thlA)、3-羥丁酰輔酶A脫氫酶(hbd)、巴豆酸酶(crt)、和丁酰輔酶A脫氫酶(反式-2-烯酰輔酶A還原酶，EgTER(opt))基因的質(zhì)粒pTrc99a-E-C-H-T構(gòu)建。為了起始包含上游途徑(EgTER(opt)、crt、hbd和thlA)的4基因操縱子的構(gòu)建，pCR4Blunt-TOPO-crt用EcoRI和BamHI進行消化，從而釋放0.8kbp crt片段。pUC19dSS載體(在實施例10中描述)同樣用EcoRI和BamHI進行消化，從而釋放2.0kbp載體片段。crt片段和載體片段使用T4DNA連接酶(New England Biolabs)連接在一起，以形成pUC19dSS-crt。CaTER基因通過用BamHI和SalI消化pUC57-CaTER從而釋放1.2kbp CaTER片段，插入pCU19dSS-crt內(nèi)。pUC19dSS-crt用BamHI和SalI進行消化，且使大載體片段與CaTER片段連接，從而產(chǎn)生pUC19dSS-crt-CaTER。為了完成操縱子，連接來自pCR4Blunt-TOPO-hbd的884bp SalI和SphI片段，來自pCR4Blunt-TOPO-thlA的1.2kb SphI和PstI thlA片段，以及來自pUC19dSS-crt-CaTER的SalI和PstI消化的大片段。三向連接的產(chǎn)物是所謂的pUC19dSS-crt-CaTER-hbd-thlA或pUC19dss::Operonl。
從pTrc99a-EgTER(opt)獲得的丁酰輔酶A脫氫酶活性比來自CaTER構(gòu)建體的更高，因此，構(gòu)建來源于pTrc99a-EgTER(opt)的操縱子。CaTER基因通過用BamHI/SalI消化，且將5327-bp載體片段凝膠純化，從pUC19dss::Operonl中取出。載體用克列諾處理且重新連接，從而產(chǎn)生pUC19dss::Operon1ΔCaTer。2934-bp crt-hbd-thlA(C-H-T)片段隨后作為EcoRI/PstI片段從pUC19dssOperon1 ΔCaTer分離。C-H-T片段用克列諾處理以使末端變?yōu)槠筋^的。使平端化載體與平端化C-H-T片段連接，以產(chǎn)生pTrc99a-E-C-H-T。菌落PCR反應(yīng)用引物N62SeqF4和N5SeqF4(分別為SEQ ID NO116和84)進行，以證實插入片段的方向。
包含編碼丁醛脫氫酶(ald和ald(opt))的基因的質(zhì)粒pBHR T7-ald和pBHR-Ptrc-ald(opt)的構(gòu)建。將PT7-ald操縱子從pDEST14-ald(實施例6)亞克隆到廣宿主范圍質(zhì)粒pBHR1(MoBitec，Goettingen，德國)內(nèi)，以產(chǎn)生pBHR1 PT7-ald。pBHR1質(zhì)粒與pUC19或pBR322質(zhì)粒相容，因此pBHR1 PT7-ald可以與攜帶上游途徑操縱子的pUC19或pBR322衍生物組合使用，以用于在大腸桿菌中的1-丁醇生產(chǎn)。pDEST14-ald質(zhì)粒用BglII進行消化，且用DNA聚合酶的克列諾片段處理，以產(chǎn)生平端。質(zhì)粒隨后用EcoRI進行消化，且將2,245bp PT7-ald片段凝膠純化。質(zhì)粒pBHR1用ScaI和EcoRI進行消化，且將4,883bp片段凝膠純化。使PT7-ald片段與pBHR1載體連接，從而產(chǎn)生pBHRT7-ald。使用引物T-ald(BamHI)和B-ald(EgTER)(分別為SEQ IDNO85和86)的轉(zhuǎn)化體的菌落PCR擴增證實預(yù)期的1.4kb PCR產(chǎn)物。pBHR T7-ald克隆使用EcoRI和DrdI的限制酶切作圖證實預(yù)期的4,757和2,405bp片段。
對于丁醛脫氫酶活性測定，如實施例1中所述，將質(zhì)粒pBHR T7-ald轉(zhuǎn)化到BL21StarTM(DE3)細胞(Invitrogen)內(nèi)，且通過添加L-阿拉伯糖誘導來自T7啟動子的表達。如實施例6中所述，如通過340nm處吸光度中的增加測量的，通過監(jiān)控NADH的形成來測定酰化醛脫氫酶活性。
關(guān)于來自拜氏梭菌ATCC 35702的ald基因的備選DNA序列由GenScript Corporation(Biscataway，NJ)合成(對于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中的密碼子選擇最優(yōu)化)且克隆到pUC57內(nèi)，從而產(chǎn)生質(zhì)粒pUC57-ald(opt)。pUC57-ald(opt)用SacI和SalI進行消化，以釋放包含密碼子最優(yōu)化基因、ald(opt)和已用于大腸桿菌的RBS的1498bp片段。1498bp片段的序列作為SEQ ID NO78給出。
pTrc99a用SacI和SalI進行消化，從而產(chǎn)生4153bp載體片段，使所述載體片段與1498bp ald(opt)片段連接，以產(chǎn)生pTrc-ald(opt)。合成基因ald(opt)的表達在IPTG誘導型Ptrc啟動子的控制下。
將Ptrc-ald(opt)操縱子亞克隆到廣宿主范圍質(zhì)粒pBHR1(MoBitec)內(nèi)，以與上述上游途徑質(zhì)粒相容。Ptrc-ald(opt)片段用在相應(yīng)引物內(nèi)摻入BspEI和ScaI限制位點的T-Ptrc(BspEI)和B-aldopt(ScaI)(分別為SEQ ID NO87和88)從pTrc99A::ald(opt)進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物用BspEI和ScaI進行消化。質(zhì)粒pBHR1用ScaI和BspEI進行消化，且將4,883bp片段凝膠純化。使Ptrc-ald(opt)片段與pBHR1載體連接，從而產(chǎn)生pBHR-PcatPtrc-ald(opt)。pBHR-PcatPtrc-ald(opt)克隆使用ScaI和BspEI的限制酶切作圖證實預(yù)期的4,883和1,704bp片段。為了去除質(zhì)粒攜帶的cat啟動子(Pcat)區(qū)域，質(zhì)粒pBHR-PcatPtrc-ald(opt)用BspEI和AatII進行消化，且將6,172bp片段凝膠純化。T-BspEIAatII和B-BspEIAatII(分別為SEQ ID NOs89和90)在包含50mM NaCl、10mM Tris-HCl和10mM MgCl2(pH7.9)的溶液中混合至100μM的終濃度，且通過于75℃溫育5分鐘并緩慢冷卻至室溫進行雜交。使雜交的寡核苷酸與6,172bp片段連接，從而產(chǎn)生pBHR-Ptrc-ald(opt)。
表達丁醇脫氫酶(yqhD)的大腸桿菌菌株的構(gòu)建。大腸桿菌包含鑒定為1，3-丙二醇脫氫酶(美國專利號6,514,733)的天然基因(yqhD)。yqhD基因與梭菌屬中的基因adhB具有40％的同一性，所述adhB基因是可能的NADH依賴性丁醇脫氫酶。yqhD基因在大腸桿菌菌株MG1655 1.6yqhD::Cm(WO 2004/033646)中使用λ Red技術(shù)(Datsenko和Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.976640(2000))，置于葡糖異構(gòu)酶啟動子1.6GI(SEQ ID NO91)變體的組成型表達控制下。類似地，天然啟動子用1.5GI啟動子(WO 2003/089621)(SEQ ID NO92)替換，從而產(chǎn)生菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm，因此用1.5GI啟動子替換MG 1655 1.6yqhD::Cm的1.6GI啟動子。
P1溶解產(chǎn)物由MG1655 1.5GI yqhD::Cm制備，且將盒移動至表達菌株MG1655(DE3)和BL21(DE3)(Invitrogen)，從而分別產(chǎn)生MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm和BL21(DE3)1.5GI-yqhD::Cm，所述MG1655(DE3)由大腸桿菌菌株MG1655和λDE3溶原化試劑盒(Invitrogen)制備。
來自重組大腸桿菌的1-丁醇生產(chǎn)的證實。大腸桿菌菌株MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm用質(zhì)粒pTrc99a-E-C-H-T和pBHR T7-ald轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生菌株MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHRT7-ald。2個獨立分離物最初在包含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中生長。細胞用于接種包含15、50和150mL的TM3a/葡萄糖培養(yǎng)基(含合適的抗生素)的搖瓶(約175mL總體積)，以分別代表高、中和低氧條件。TM3a/葡萄糖培養(yǎng)基包含(每升)10g葡萄糖、13.6g KH2PO4、2.0g檸檬酸一水化物、3.0g(NH4)2SO4、2.0g MgSO4·7H2O、0.2g CaCl2·2H2O、0.33g檸檬酸鐵銨、1.0mg鹽酸硫胺素、0.50g酵母提取物、和10mL痕量元素溶液，用NH4OH調(diào)節(jié)至pH6.8。所述痕量元素溶液包含檸檬酸·H2O(4.0g/L)、MnSO4·H2O(3.0g/L)、NaCl(1.0g/L)、FeSO4·7H2O(0.10g/L)、CoCl2·6H2O(0.10g/L)、ZnSO4·7H2O(0.10g/L)、CuSO4·5H2O(0.010g/L)、H3BO3(0.010g/L)、和Na2MoO4·2H2O(0.010g/L)。瓶以≤0.01單位的起始OD600接種，且于34℃伴隨300rpm振蕩溫育。包含15和50mL培養(yǎng)基的瓶蓋上通氣蓋；包含150mL的瓶蓋上非通氣蓋，以使氣體交換最小化。添加IPTG至0.04mM的終濃度；添加時瓶的OD600≥0.4單位。
誘導后約15小時，如一般方法部分中所述，等分試樣的液體培養(yǎng)基通過具有折射率(RI)檢測的HPLC(Shodex Sugar SH1011柱)，和具有火焰離子化檢測(FID)的GC(Varian CP-WAX 58(FFAP)CB柱，25m x 0.25mm id X 0.2μm膜厚度)分析1-丁醇含量。1-丁醇測定結(jié)果在表6中給出。
表6 通過大腸桿菌菌株MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的1-丁醇生產(chǎn)。
-值由HPLC分析測定。
-菌株后綴“a”和“b”指示獨立分離物。
MG 1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的2個獨立分離物以相同方式測試1-丁醇生產(chǎn)，只是除了培養(yǎng)基包含5g/L酵母提取物。結(jié)果顯示于表7中。
表7 通過大腸桿菌菌株MG1655(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的1-丁醇生產(chǎn)。
-定量值由HPLC分析測定。
-“-”＝未檢測。
-菌株后綴“a”和“b”指示獨立分離物。
大腸桿菌BL21(DE3)1.5GI-yqhD::Cm用質(zhì)粒pTrc99a-E-C-H-T和pBHR T7-ald轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生菌株BL21(DE3)1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald。如上所述準確地測試2個獨立分離物的1-丁醇生產(chǎn)。結(jié)果在表8和9中給出。
表8 通過大腸桿菌菌株BL21(DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的1-丁醇生產(chǎn)。
-定量值由HPLC分析測定。
-“-”指示未檢測。
“+”指示通過GC的陽性、定性鑒定，所述GC具有比HPLC更低的檢出限。
-菌株后綴“a”和“b”指示獨立分離物。
表9 通過大腸桿菌菌株BL21(DE3) 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR T7-ald的1-丁醇生產(chǎn)。
-定量值由HPLC分析測定。
-“-”指示未檢測。
“+”指示通過GC的陽性、定性鑒定，所述GC具有比HPLC更低的檢出限。
-菌株后綴“a”和“b”指示獨立分離物。
大腸桿菌菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm用質(zhì)粒pTrc99a-E-C-H-T和pBHR-Ptrc-ald(opt)轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)。2個分離物最初在包含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中生長。細胞用于接種包含50和150mL的TM3a/葡萄糖培養(yǎng)基(含合適的抗生素)的搖瓶(約175mL總體積)。瓶以≤0.04單位的起始OD550接種，且如上所述溫育，含和不含誘導。添加IPTG至0.4mM的終濃度；添加時瓶的OD550為0.6-1.2單位。在這種情況下，誘導對于1-丁醇途徑基因表達不是必要的，這是因為IPTG誘導型啟動子的泄漏程度和1.5GI啟動子的組成型性質(zhì)；然而，誘導提供廣泛范圍的表達。
誘導后約15小時，如上所述，等分試樣的液體培養(yǎng)基通過具有火焰離子化檢測的GC分析1-丁醇含量。結(jié)果在表10中給出。對于重組大腸桿菌菌株，在所有情況下產(chǎn)生1-丁醇；在分開的實驗中，野生型大腸桿菌菌株顯示不產(chǎn)生可檢測的1-丁醇(數(shù)據(jù)未顯示)。
表10 通過大腸桿菌菌株MG16551.5GI-yqhD::Cm/ pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)的1-丁醇生產(chǎn)。
-菌株后綴“a”和“b”指示獨立分離物。
實施例14 使用重組枯草芽孢桿菌從葡萄糖生產(chǎn)1-丁醇 這個實施例描述了1-丁醇在枯草芽孢桿菌中的生產(chǎn)。編碼6種酶活性的1-生物合成途徑的6種基因分成2個操縱子用于表達。將該途徑的前3種基因(thl、hbd和crt)整合到枯草芽孢桿菌BE1010染色體內(nèi)(Payne和Jackson，J.Bacteriol.1732278-2282(1991))。將后3種基因(EgTER、ald和bdhB)克隆到表達質(zhì)粒內(nèi)，且轉(zhuǎn)化到攜帶整合的1-丁醇基因的芽孢桿菌屬菌株內(nèi)。
除非上下文另有說明，這個實施例中描述的克隆引物通過其SEQID NO參考表4，且測序和PCR篩選引物通過其SEQ ID NO參考表5。
整合質(zhì)粒。質(zhì)粒pFP988是芽孢桿菌屬整合載體，它包含來自pBR322的大腸桿菌復(fù)制子、用于在大腸桿菌中進行選擇的氨芐青霉素抗生素標記和與芽孢桿菌屬染色體中sacB基因同源的2個部分，所述2個同源部分通過同源重組指導載體和間插序列整合。在sacB同源區(qū)之間是可以指導克隆的基因合成和分泌的Pamy啟動子和信號序列，His-標簽和作為用于芽孢桿菌屬的選擇標記的紅霉素。Pamy啟動子和信號序列來自解淀粉芽孢桿菌α淀粉酶。啟動子區(qū)還包含lacO序列用于通過lacI阻抑蛋白調(diào)節(jié)表達。pFP988(6509bp)序列作為SEQ ID NO79給出。
因為1-丁醇途徑基因?qū)⒃诩毎|(zhì)中表達，所以缺失淀粉酶信號序列。質(zhì)粒pFP988使用引物Pamy/lacO F和Pamy/lacO R進行擴增，從而產(chǎn)生包含Pamy/lacO啟動子的317bp(0.3kbp)產(chǎn)物。Pamy/lacO F引物的5＇末端摻入BsrGI限制位點隨后為EcoRI位點。Pamy/lacO R引物的5＇末端摻入BsrGI限制位點隨后為PmeI限制位點。將PCR產(chǎn)物TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO內(nèi)，從而產(chǎn)生pCR4Blunt-TOPO-Pamy/lacO。質(zhì)粒DNA由過夜培養(yǎng)物制備，且提交用于由M13正向和M13反向引物(分別為SEQ ID NOs45和46)測序，以確保沒有突變已引入啟動子內(nèi)。pCR4Blunt-TOPO-Pamy/lacO克隆用BsrGI進行消化，且將0.3kbp產(chǎn)物凝膠純化。載體pFP988用BsrGI進行消化，從而導致產(chǎn)生來自5＇sacB同源區(qū)的11bp缺失以及Pamy/lacO啟動子和信號序列和His標簽的去除。將6kbp BsrGI消化的載體凝膠純化且與Pamy/lacO BsrGI插入片段連接。所得到的質(zhì)粒用引物Pamy SeqF2和Pamy SeqR篩選，以確定啟動子的方向。正確克隆使Pamy/lacO啟動子恢復(fù)其原始方向且命名為pFP988Dss。
具有基因thl-crt的盒通過SOE(重疊延伸剪接)來構(gòu)建?；蚴褂媚０錺UC19dss::Operonl進行擴增。thl引物是Top TF和Bot TR，從而擴增0.9kbp產(chǎn)物。crt引物是Top CF和Bot CR，從而擴增1.3kbp產(chǎn)物。2種基因通過SOE用使用引物Top TF和Bot CR的PCR擴增進行連接，從而產(chǎn)生2.1kbp產(chǎn)物，將所述2.1kbp產(chǎn)物TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO內(nèi)，從而產(chǎn)生pCR4Blunt-TOPO-T-C。提交克隆用于測序以證實序列。質(zhì)粒pCR4Blunt-TOPO-T-C用BstEII和PmeI進行消化，從而釋放凝膠純化的2.1kbp片段。插入片段用克列諾聚合酶處理，以使BstEII位點變成平頭的。載體pFP988Dss用PmeI進行消化，且用牛小腸堿性磷酸酶(New England BioLabs)處理以防止自身連接。使2.1kbp thl-crt片段與消化的pFP988Dss連接，且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化體通過PCR擴增篩選0.7kbp產(chǎn)物，所述PCR擴增使用Pamy SeqF2和N7SeqR2，正確產(chǎn)物命名為pFP988Dss-T-C。
thl-crt盒的構(gòu)建在2種基因之間產(chǎn)生獨特的SalI和SpeI位點。為了向盒中添加hbd基因，從pCR4Blunt-TOPO-hbd亞克隆作為0.9kbpSalI/SpeI片段的hbd基因。載體pFP988Dss-T-C用SalI和SpeI進行消化，且將8kbp載體片段凝膠純化。使載體與hbd插入片段連接，且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化體通過PCR擴增篩選3.0kbp片段，所述PCR擴增使用Pamy SeqF和N3SeqF3。所得到的質(zhì)粒命名為pFP988Dss-T-H-C。
Pamy啟動子隨后替換為來自質(zhì)粒pMUTIN4的Pspac啟動子(Vagner等人，Microbiol.1443097-3104(1998))。Pspac啟動子從pMUTIN4使用引物Spac F和Spac R作為0.4kbp產(chǎn)物擴增，且TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO內(nèi)。轉(zhuǎn)化體通過PCR擴增篩選0.5kbp插入片段的存在，所述PCR擴增使用M13正向和M13反向引物。提交陽性克隆用于由相同引物測序。質(zhì)粒pCR4Blunt-TOPO-Pspac用SmaI和XhoI進行消化，且將0.3kbp片段凝膠純化。載體pFP988Dss-T-H-C用SmaI和XhoI進行消化，且9kbp載體通過凝膠純化來分離。使消化的載體與Pspac插入片段連接，且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化體通過使用引物SpacF Seq和N7SeqR2的PCR擴增進行篩選。陽性克隆產(chǎn)生0.7kbp產(chǎn)物。質(zhì)粒DNA由陽性克隆制備，且通過用引物SpacF Seq和N3SeqF2的PCR擴增進一步篩選。陽性克隆產(chǎn)生3kbpPCR產(chǎn)物，且命名為pFP988DssPspac-T-H-C。
整合到枯草芽孢桿菌BE1010內(nèi)，以形成包含外源thl、hbd和crt基因的枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28。枯草芽孢桿菌BE1010的感受態(tài)細胞如Doyle等人，J.Bacteriol.144957-966(1980)中所述進行制備。感受態(tài)細胞通過離心進行收獲，且將細胞沉淀重懸浮于小體積的細胞上清液中。向1體積感受態(tài)細胞中加入2體積SPII-EGTA培養(yǎng)基(Methods for General and Molecular Bacteriology，P.Gerhardt等人，Eds，American Society for Microbiology，Washington，DC(1994))。將等分試樣的0.3mL細胞分配到試管內(nèi)，且將質(zhì)粒pFP988DssPspac-T-H-C加入管中。細胞于37℃伴隨振蕩溫育30分鐘，這之后向每個管中加入0.1mL 10％酵母提取物，且將細胞再溫育60分鐘。轉(zhuǎn)化體在LB紅霉素板上進行鋪平板用于選擇，其中使用雙重瓊脂覆層法(Methods for General and Molecular Bacteriology，同上)。轉(zhuǎn)化體通過使用引物Pamy SeqF和N5SeqF3的PCR擴增進行最初篩選。擴增預(yù)期2kbp PCR產(chǎn)物的陽性克隆通過PCR擴增進一步篩選。如果盒插入染色體內(nèi)已經(jīng)由雙交換事件發(fā)生，那么引物組sacB Up和N7SeqR2以及引物組sacB Dn和N4SeqR3將分別擴增1.7kbp和a2.7kbp產(chǎn)物。陽性克隆被鑒定且命名為枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28。
EgTER、ald和bdhB基因的質(zhì)粒表達。剩余的3種1-丁醇基因由質(zhì)粒pHT01(MoBitec)表達。質(zhì)粒pHT01是經(jīng)由θ機制復(fù)制的芽孢桿菌屬-大腸桿菌穿梭載體。克隆的蛋白質(zhì)由與lacO序列融合的GroEL啟動子表達。lacO下游是來自gsiB基因的有效RBS，隨后為MCS。ald基因通過PCR用引物AF BamHI和AR Aat2使用pUC19dHS-ald-bdhB(在實施例9中描述)作為模板進行擴增，從而產(chǎn)生1.4kbp產(chǎn)物。將產(chǎn)物TOPO克隆到pCR4-TOPO內(nèi)且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化體用M13正向和M13反向引物進行篩選。陽性克隆擴增1.6kbp產(chǎn)物。提交克隆用于由下述引物測序M13正向和M13反向、N31SeqF2、N31SeqF3、N32SeqR2、N32SeqR3和N32SeqR4。質(zhì)粒命名為pCR4TOPO-B/A-ald。
載體pHT01和質(zhì)粒pCR4TOPO-B/A-ald都用BamHI和AatII進行消化。使7.9kbp載體片段與1.4kbp ald片段連接在一起，以產(chǎn)生pHT01-ald。將連接物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)，且轉(zhuǎn)化體通過PCR擴增篩選1.3kbp產(chǎn)物，所述PCR擴增使用引物N31SeqF1和HT R。
為了給pHT01載體添加途徑的最后2個步驟，設(shè)計2種克隆方案。對于2種方案，EgTER和bdhB通過SOE一起擴增。隨后，將EgTER-bdh片段克隆到pHT01-ald內(nèi)，從而產(chǎn)生pHT01-ald-EB，或克隆到pCR4-TOPO-B/A-ald內(nèi)，從而產(chǎn)生pCR4-TOPO-ald-EB。隨后將來自TOPO載體的ald-EgTer-bdhB片段克隆到pHT01內(nèi)，從而產(chǎn)生pHT01-AEB。
EgTER-bdhB片段使用引物正向1(E)和反向2(B)進行PCR擴增，其中使用作為SEQ ID NO208給出的模板DNA。將所得到的2.5kbp PCR產(chǎn)物TOPO克隆到pCR4Blunt-TOPO內(nèi)，從而產(chǎn)生pCR4Blunt-TOPO-E-B。將TOPO反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)。菌落用M13正向和M13反向引物通過PCR擴增進行篩選。陽性克隆產(chǎn)生2.6kbp產(chǎn)物。提交pCR4Blunt-TOPO-E-B的克隆用于由下述引物測序M 13正向和反向，N62SeqF2、N62SeqF3、N62SeqF4、N63SeqR1、N63SeqR2、N63SeqR3、N11Seq F1和N11Seq F2、N12SeqR1和N12SeqR2。
質(zhì)粒pCR4Blunt-TOPO-E-B用HpaI和AatII進行消化，以釋放2.4kbp片段。E-B片段用克列諾聚合酶處理以使末端變成平頭的，且隨后進行凝膠純化。質(zhì)粒pHT01-ald用AatII進行消化，且用克列諾聚合酶處理，以使末端變成平頭的。載體隨后用牛小腸堿性磷酸酶處理且進行凝膠純化。使E-B片段與線性化載體pHT01-ald連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)，且在包含100μg/mL氨芐青霉素的LB板上選擇。轉(zhuǎn)化體通過使用引物N3SeqF1和N63SeqR1進行PCR擴增以產(chǎn)生2.4kbp產(chǎn)物來篩選。將所得到的質(zhì)粒pHT01-ald-EB轉(zhuǎn)化到JM103細胞recA+大腸桿菌菌株內(nèi)。由recA+菌株制備的質(zhì)粒形成比recA-菌株更多的多聚體。使用質(zhì)粒多聚體而不是單體的枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化更有效(Methods for General and Molecular Bacteriology，同上)。質(zhì)粒DNA由JM103制備且轉(zhuǎn)化到感受態(tài)枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28內(nèi)，從而形成菌株枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28/pHT01-ald-EB。感受態(tài)細胞如先前所述進行制備和轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化體在包含5μg/mL氯霉素的LB板上進行選擇，且通過菌落PCR篩選1.3kbp產(chǎn)物，所述菌落PCR使用引物N31SeqF1和N63SeqR4。
在可替代的克隆策略中，pCR4Blunt-TOPO-E-B用HpaI和AatII進行消化，從而釋放凝膠純化的2.4kbp片段。質(zhì)粒pCR4-TOPO-B/A-ald用HpaI和AatII進行消化，且將5.4kbp載體片段凝膠純化。使來自pCR4-TOPO-B/A-ald的載體片段與HpaI-AatII E-B片段連接，從而產(chǎn)生pCR4-TOPO-ald-EB。將連接物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)，且所得到的轉(zhuǎn)化體通過PCR擴增篩選2.1kbp產(chǎn)物，所述PCR擴增使用引物N11SeqF2和N63SeqR4。質(zhì)粒pCR4-TOPO-ald-EB用BamHI和AatII和SphI進行消化。BamHI/AatII消化釋放凝膠純化的3.9kbp ald-EB片段。SphI消化的目的是將剩余載體切割成較小片段，從而使得它不能在凝膠上與ald-EB插入片段共遷移。載體pHT01用BamHI和AatII進行消化，且將7.9kbp載體片段凝膠純化。使載體與ald-EB插入片段連接，以形成質(zhì)粒pHT01-AEB，且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)。菌落通過PCR擴增篩選1.5kbp產(chǎn)物，所述PCR擴增使用引物N62SeqF4和HT R。制備質(zhì)粒且轉(zhuǎn)化到JM103內(nèi)。質(zhì)粒DNA由JM 103制備且轉(zhuǎn)化到感受態(tài)枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28內(nèi)，從而形成菌株枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm # 28/pHT01-AEB。感受態(tài)BE1010細胞如先前所述進行制備和轉(zhuǎn)化。芽孢桿菌屬轉(zhuǎn)化體通過PCR擴增篩選1.3kbp產(chǎn)物，所述PCR擴增使用引物N31SeqF1和N63SeqR4。
來自重組枯草芽孢桿菌的1-丁醇生產(chǎn)的證實。
每種菌株枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28/pHT01-ald-EB和枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm #28/pHT01-AEB的3個獨立分離物接種到包含15mL培養(yǎng)基的搖瓶(約175mL總體積)內(nèi)。也包括缺乏外源1-丁醇、6基因途徑的枯草芽孢桿菌BE1010菌株作為陰性對照。培養(yǎng)基包含(每升)10mL 1M(NH4)2SO4；5mL 1M磷酸鉀緩沖液，pH7.0；100mL 1M MOPS/KOH緩沖液，pH7.0；20mL 1M L-谷氨酸，鉀鹽；10g葡萄糖；各10mL 5g/L L-甲硫氨酸、L-色氨酸和L-賴氨酸；酵母提取物和酪蛋白氨基酸各0.1g；20mL金屬混合物；以及合適的抗生素(5mg氯霉素和紅霉素用于重組菌株)。金屬混合物包含200mMMgCl2、70mM CaCl2、5mM MnCl2、0.1mM FeCl3、0.1mM ZnCl2、0.2mM鹽酸硫胺素、172μM CuSO4、253μM CoCl2、和242μMNa2MoO4。瓶以≤0.1單位的起始OD600接種，用非通氣蓋密封，且于37℃伴隨約200rpm振蕩溫育。
接種后約24小時，如一般方法部分中所述，等分試樣的液體培養(yǎng)基通過具有折射率(RI)檢測的HPLC(Shodex Sugar SH1011柱)，和具有火焰離子化檢測(FID)GC(Varian CP-WAX 58(FFAP)CB柱，0.25mm X 0.2μm X 25m)分析1-丁醇含量。1-丁醇測定結(jié)果在表11中給出。
表11 通過菌株枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28/DHT01-ald-EB和枯草芽孢桿菌ΔsacB::T-H-C::erm#28/DHT01-AEB的1-丁醇生產(chǎn)。
*通過GC測定的濃度。
-菌株后綴“a”、“b”和“c”指示獨立分離物。
實施例15 通過重組大腸桿菌從葡萄糖或蔗糖生產(chǎn)1-丁醇。
為了賦予大腸桿菌MG1655使用蔗糖作為碳源和能源用于1-丁醇生產(chǎn)的能力，將來自質(zhì)粒pScrI(下文描述)的蔗糖利用基因簇(cscBKA)亞克隆到這種生物中的pBHR-Ptrc-ald(opt)(在實施例13中描述)內(nèi)。蔗糖利用基因(cscA、cscK和cscB)編碼作為SEQ ID NO157給出的蔗糖水解酶(CscA)，作為SEQ ID NO158給出的D-果糖激酶(CscK)，和作為SEQ ID NO159給出的蔗糖透性酶(CscB)。為了允許來自其天然啟動子的3種基因的組成型表達，調(diào)節(jié)該基因簇的蔗糖特異性阻抑基因cscR不存在于構(gòu)建體中。
蔗糖利用基因簇cscBKA在質(zhì)粒pBHR-Ptrc-ald(opt)中的克隆和表達。作為SEQ ID NO156給出的蔗糖利用基因簇cscBKA，從蔗糖利用大腸桿菌菌株基因組DNA中分離，所述蔗糖利用大腸桿菌菌株來源于大腸桿菌菌株ATCC 13281?；蚪MDNA用BamHI和EcoRI消化完全。從瓊脂糖凝膠分離平均大小約4kbp的片段，與質(zhì)粒pLitmus28(New England Biolabs，Beverly，MA)連接，隨后用BamHI和EcoRI進行消化。將所得到的DNA轉(zhuǎn)化到超感受態(tài)(ultracompetent)大腸桿菌TOP10F’(Invitrogen，Carlsbad，CA)內(nèi)。轉(zhuǎn)化體在包含1％蔗糖和100μg/mL氨芐青霉素的MacConkey瓊脂板上進行鋪平板，且篩選紫色菌落。從紫色轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，且使用下述引物測序M13正向(SEQ ID NO45)、M13反向(SEQ ID NO46)、scr1(SEQID NO160)、scr2(SEQ ID NO161)、scr3(SEQ ID NO162)和scr4(SEQ ID NO163)。包含cscB、cscK和cscA(cscBKA)基因的質(zhì)粒命名為pScr1。
質(zhì)粒pScrI用XhoI進行消化，且用DNA聚合酶的克列諾片段處理，以產(chǎn)生平端。質(zhì)粒隨后用AgeI進行消化，且將4,179bp cscBKA基因簇片段凝膠純化。質(zhì)粒pBHR-Ptrc-ald(opt)如實施例13中所述制備，且用AgeI和NaeI進行消化。將所得到的6,003bp pBHR-Ptrc-ald(opt)片段凝膠純化。使cscBKA片段與pBHR-Ptrc-ald(opt)連接，從而產(chǎn)生pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB。將質(zhì)粒pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB轉(zhuǎn)化到大腸桿菌NovaXG電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(Novagen，Madison，WI)內(nèi)，且蔗糖利用通過使轉(zhuǎn)化體在包含2％蔗糖和25μg/mL卡那霉素的McConkey瓊脂板上鋪平板來證實。在pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB構(gòu)建體中，蔗糖利用基因作為獨立片段以cscA、cscK和cscB的順序克隆到Ptrc-ald(opt)下游。
可替代地，將蔗糖利用基因以相反方向克隆到pBHR-Ptrc-ald(opt)中。質(zhì)粒pBHR-Ptrc-ald(opt)用ScaI和AgeI進行消化，且將5,971bppBHR-Ptrc-ald(opt)片段凝膠純化。使如上所述制備的4,179bp cscBKA片段與pBHR-Ptrc-ald(opt)片段連接，從而產(chǎn)生pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA。將質(zhì)粒pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌NovaXG電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞(Novagen，Madison，WI)內(nèi)，且蔗糖利用通過使轉(zhuǎn)化體在包含2％蔗糖和25μg/mL卡那霉素的McConkey瓊脂板上鋪平板來證實。在pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA構(gòu)建體中，蔗糖利用基因作為獨立片段以cscB、cscK和cscA的順序克隆到Ptrc-ald(opt)下游。
使用重組大腸桿菌從葡萄糖或蔗糖的1-丁醇生產(chǎn)的證實。大腸桿菌菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm(在實施例13中描述)用質(zhì)粒pTrc99a-E-C-H-T(如實施例13中所述制備)和pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB或pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA轉(zhuǎn)化，以產(chǎn)生2種菌株，MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB#9和MG16551.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscBKA#1。2種菌株的起子培養(yǎng)物通過使細胞在包含25μg/mL卡那霉素和100μg/mL羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞來制備。如實施例13中所述，這些細胞隨后用于接種包含50、70和150mL的TM3a/葡萄糖培養(yǎng)基(含合適的抗生素)的搖瓶(約175mL總體積)，以分別代表高、中和低氧條件。在包含100μg/mL羧芐青霉素的TM3a/葡萄糖培養(yǎng)基中生長的第3種菌株大腸桿菌MG 1655/pScr1，用作陰性對照。對于每種菌株，相同組的瓶用TM3a/蔗糖培養(yǎng)基(含合適的抗生素)制備。TM3a/蔗糖培養(yǎng)基等同于TM3a/葡萄糖培養(yǎng)基，只是除了蔗糖(10g/L)替換葡萄糖。瓶以≤0.03單位的起始OD550接種，且如實施例13中所述溫育。除了陰性對照瓶，當培養(yǎng)物達到OD550 0.2-1.8單位時，向瓶中加入IPTG(終濃度0.04mM)。當培養(yǎng)物OD550增加至少3倍時收獲細胞。
接種后約24小時，如一般方法部分中所述，等分試樣的液體培養(yǎng)基通過具有折射率(RI)檢測的HPLC(Shodex Sugar SH1011柱)，和具有火焰離子化檢測(FID)的GC(HP-INNOWax柱，30m x 0.53mm id，1μm膜厚度)分析1-丁醇含量。
在含葡萄糖和蔗糖的培養(yǎng)基中生長后培養(yǎng)物中的1-丁醇濃度分別在表12和表13中給出。包含1-丁醇生物合成途徑的2種重組大腸桿菌菌株在所有氧條件下從葡萄糖和蔗糖產(chǎn)生1-丁醇，而陰性對照菌株不產(chǎn)生可檢測的1-丁醇。
表12 通過重組大腸桿菌菌株MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt)-cscAKB#9和 MG1655 1.5GI-yqhD::Cm/pTrc99a-E-C-H-T/pBHR-Ptrc-ald(opt) -cscBKA#1從葡萄糖的1-丁醇生產(chǎn) 表13 通過重組大腸桿菌菌株從蔗糖的1-丁醇生產(chǎn)。
實施例16 使用重組枯草芽孢桿菌從蔗糖生產(chǎn)1-丁醇。
這個實施例描述了使用重組枯草芽孢桿菌從蔗糖生產(chǎn)1-丁醇?；旧先鐚嵤├?4中所述檢查枯草芽孢桿菌菌株ΔsacB::T-H-C::erm#28/pHT01-ald-EB(實施例14)的2個獨立分離物的1-丁醇生產(chǎn)。將菌株接種到包含20mL或100mL培養(yǎng)基的搖瓶(約175mL總體積)內(nèi)，以分別模擬高和低氧條件。培養(yǎng)基A完全如實施例14中所述，只是除了葡萄糖替換為5g/L蔗糖。培養(yǎng)基B等同于實施例13中所述的TM3a/葡萄糖培養(yǎng)基，只是除了葡萄糖替換為10g/L蔗糖，且培養(yǎng)基補加了(每L)各10mL 5g/L L-甲硫氨酸、L-色氨酸和L-賴氨酸溶液。瓶以≤0.1單位的起始OD550接種，蓋上通氣蓋，且于34℃伴隨300rpm振蕩溫育。
接種后約24小時，如一般方法部分中所述，等分試樣的液體培養(yǎng)基通過具有FID檢測的GC(HP-INNOWax柱，30m x 0.53mm id，1.0μm膜厚度)分析1-丁醇含量。1-丁醇測定結(jié)果在表14中給出。包含1-丁醇生物合成途徑的重組芽孢桿菌屬菌株在高和低氧條件下在2種培養(yǎng)基中都產(chǎn)生可檢測水平的1-丁醇。
表14 通過枯草芽孢桿菌菌株ΔsacB::T-H-C::erm#28/pHT01-ald-EB從蔗糖生產(chǎn)1-丁醇 1通過GC測定的濃度。
2“+”指示1-丁醇的定性存在。
菌株后綴“a”和“b”指示獨立分離物。
實施例17 使用重組啤酒糖酵母從葡萄糖和蔗糖生產(chǎn)1-丁醇 這個實施例描述了1-丁醇在啤酒糖酵母中的生產(chǎn)。在編碼催化1-丁醇生物合成途徑步驟的酶的6種基因中，將5種克隆到3種相容性酵母2微米(2μ)質(zhì)粒內(nèi)，且在啤酒糖酵母中共表達。“上游途徑”定義為由乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶(thlA，硫解酶)、3-羥丁酰輔酶A脫氫酶(hbd)和巴豆酸酶(crt)催化的前3個酶促步驟。下游途徑定義為該途徑的第4個(丁酰輔酶A脫氫酶，ter)和第5個(丁醛脫氫酶，ald)酶促步驟。1-丁醇途徑的最后1個酶促步驟由醇脫氫酶催化，所述醇脫氫酶可以由內(nèi)源酵母基因例如adhI和adhII編碼。
基因在酵母中的表達一般需要啟動子，隨后為目的基因，和轉(zhuǎn)錄終止子。許多組成型酵母啟動子在構(gòu)建用于編碼1-丁醇生物合成途徑的基因的表達盒中使用，包括FBA、GPD和GPM啟動子。一些誘導型啟動子例如GAL1、GAL10、CUP1也在中間質(zhì)粒構(gòu)建中使用，但不在最終顯示菌株中使用。使用幾種轉(zhuǎn)錄終止子，包括FBAt、GPDt、GPMt、ERG10t、和GAL1t。將編碼1-丁醇生物合成途徑的基因首先亞克隆到酵母質(zhì)粒內(nèi)，側(cè)面為啟動子和終止子，這產(chǎn)生關(guān)于每種基因的表達盒。如下文所述表達盒通過缺口修復(fù)克隆任選與單個載體組合。例如，將編碼上游途徑的3種基因盒亞克隆到酵母2μ質(zhì)粒內(nèi)。ter和ald基因各自在2μ質(zhì)粒中個別表達。所有3種質(zhì)粒在單個酵母菌株中的共轉(zhuǎn)化導致功能性1-丁醇生物合成途徑?？商娲?，編碼啟動子、基因和終止子的幾個DNA片段通過缺口修復(fù)克隆在單個載體中直接組合。
關(guān)于在啤酒糖酵母中構(gòu)建質(zhì)粒和菌株的方法?；窘湍阜肿由飳W規(guī)程包括轉(zhuǎn)化、細胞生長、基因表達、缺口修復(fù)重組等，在Methodsin Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics and Molecular andCell Biology(Part A，2004，Christine Guthrie和Gerald R.Fink(Eds.)，Elsevier Academic Press，San Diego，CA)中描述。
這個實施例中使用的質(zhì)粒是大腸桿菌-啤酒糖酵母穿梭載體pRS423、pRS424、pRS425、和pRS426(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)，所述穿梭載體包含大腸桿菌復(fù)制起點(例如，pMB1)、酵母2μ復(fù)制起點、和用于營養(yǎng)選擇的標記。關(guān)于這4種載體的選擇標記為His3(載體pRS423)、Trp1(載體pRS424)、Leu2(載體pRS425)和Ura3(載體pRS426)。這些載體允許在大腸桿菌和酵母菌株中的菌株繁殖。酵母單倍體菌株BY4741(MATa his3Δ1 leu2Δ0 metl5Δ0 ura3Δ0)(Research Genetics，Huntsville，AL，也可從ATCC 201388獲得)和二倍體菌株BY4743(MATa/alpha his3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0lys2Δ0/LYS2 MET15/metl5Δ0 ura3Δ0/ura3Δ0)(Research Genetics，Huntsville，AL，也可從ATCC 201390獲得)用作基因克隆和表達的宿主。關(guān)于編碼1-丁醇生物合成途徑酶的基因的表達載體的構(gòu)建通過在大腸桿菌中的標準分子克隆技術(shù)，或通過在酵母中的缺口修復(fù)重組法來進行。
缺口修復(fù)克隆方法利用酵母中的高效同源重組。一般地，酵母載體DNA進行消化(例如，在其多克隆位點中)以在其序列中產(chǎn)生“缺口”。產(chǎn)生在5＇和3＇末端包含≥21bp序列的許多目的插入DNA，所述插入DNA與彼此且與載體DNA的5＇和3＇末端連續(xù)重疊。例如，為了構(gòu)建關(guān)于“基因X”的酵母表達載體，選擇酵母啟動子和酵母終止子用于表達盒。啟動子和終止子從酵母基因組DNA擴增，且基因X從其來源生物進行PCR擴增，或從包含基因X序列的克隆載體獲得。在線性化載體的5＇末端和啟動子序列之間、在啟動子和基因X之間、在基因X和終止子序列之間、以及在終止子和線性化載體的3＇末端之間存在至少21bp重疊序列。隨后將“缺口的”載體和插入DNAs共轉(zhuǎn)化到酵母菌株內(nèi)，且在SD極限撤除成分培養(yǎng)基上鋪平板，且選擇菌落用于培養(yǎng)物生長和小量制備(mini preps)質(zhì)粒DNAs。正確插入片段組合的存在可以通過PCR作圖來證實。從酵母分離的質(zhì)粒DNA(濃度通常低)隨后可以轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株例如TOP10內(nèi)，隨后為小量制備和限制酶切作圖，以進一步驗證質(zhì)粒構(gòu)建體。最后構(gòu)建體可以通過序列分析來驗證。陽性質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化體在SD培養(yǎng)基中生長用于執(zhí)行酶測定，以表征由目的基因表達的酶的活性。
酵母培養(yǎng)物在YPD復(fù)合培養(yǎng)基或包含葡萄糖(SD培養(yǎng)基)和合適的化合物混合物的合成極限撤除成分培養(yǎng)基中生長，所述化合物混合物允許質(zhì)粒上的營養(yǎng)選擇標記互補(Methods in Enzymology，第194卷，Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology，2004，PartA，第13-15頁)。SD撤除成分培養(yǎng)基中的糖組分為2％葡萄糖。對于1-丁醇生產(chǎn)，酵母培養(yǎng)物也在含2％蔗糖的合成極限撤除成分培養(yǎng)基(SS培養(yǎng)基)中生長。
對于酶活性分析，將每種菌株的單個菌落在包含SD極限撤除成分培養(yǎng)基的新鮮板上劃線，且于30℃溫育2天。這個板上的細胞用于接種125mL搖瓶中的20mL SD撤除成分培養(yǎng)基，且于30℃伴隨250rpm振蕩生長過夜。測量過夜培養(yǎng)物的光密度(OD600)，且在1.0L搖瓶中的250mL相同培養(yǎng)基中將培養(yǎng)物稀釋至OD600＝0.1，且于30℃伴隨250rpm振蕩生長至OD600 0.8-1.0。細胞隨后通過在2000xg下離心10分鐘進行收獲，且重懸浮于20mL 50mM Tris-HCl緩沖液，pH8.5中。酶測定如上所述進行。
用于thlA和hbd共表達的質(zhì)粒pNY102的構(gòu)建。構(gòu)建許多雙重表達載體用于共表達thlA和hbd基因。啤酒糖酵母ERG10基因是thlA基因的功能性直向同源物。最初，ERG10和hbd的雙重載體使用酵母GAL1-GAL10反向雙啟動子、GAL1終止子(GAL1t)和ERG10終止子(ERG10t)來構(gòu)建。ERG10基因-ERG10t DNA片段從啤酒糖酵母菌株BY4743基因組DNA進行PCR擴增，其中使用引物OT731(SEQ IDNO164)和OT732(SEQ ID NO165)。酵母GAL1-GAL10反向啟動子也通過PCR從BY4743基因組DNA擴增，其中使用引物OT733(SEQ ID NO166)和OT734(SEQ ID NO167)。hbd基因從大腸桿菌質(zhì)粒pTrc99a-E-C-H-T(在實施例13中描述)擴增，其中使用PCR引物OT735(SEQ ID NO168)和OT736(SEQ ID NO169)。GAL1t從BY4743基因組DNA擴增，其中使用引物OT737(SEQ ID NO170)和OT738(SEQ ID NO171)。因此獲得的4種PCR片段erg10-ERG10t、GAL1-GAL10啟動子、hbd和GAL1t，在每個相鄰PCR片段之間具有約25bp重疊序列。GAL1t和ERG10-ERG10t片段各自包含與酵母載體pRS425的約25bp重疊序列。為了通過缺口修復(fù)重組裝配這些序列，將DNA片段連同載體pRS425共轉(zhuǎn)化到酵母菌株BY4741內(nèi)，所述載體pRS425用BamHI和HindIII酶進行消化。菌落選自SD-Leu極限板，且具有插入片段的克隆通過PCR擴增鑒定。新質(zhì)粒命名為pNY6(pRS425.ERG10t-erg10-GAL10-GAL1-hbd-GAL1t)。進一步的證實通過限制酶切作圖來進行。
通過將質(zhì)粒pNY6轉(zhuǎn)化到啤酒糖酵母BY4741內(nèi)制備的酵母菌株BY4741(pNY6)顯示良好的Hbd活性，但無硫解酶活性。由于缺乏硫解酶活性，ERG10基因通過缺口修復(fù)重組替換為thlA基因。thlA基因通過PCR從大腸桿菌載體pTrc99a-E-C-H-T擴增，其中使用引物OT797(SEQ ID NO172)和OT798(SEQ ID NO173)，所述引物OT797添加ShpI限制位點，所述引物OT798添加AscI限制位點。質(zhì)粒pNY6用SphI和PstI限制酶進行消化，凝膠純化，且連同thlA的PCR產(chǎn)物一起共轉(zhuǎn)化到酵母BY4741內(nèi)。由于thlA的PCR產(chǎn)物和消化的pNY6之間的30bp重疊序列，thlA基因重組到pNY6內(nèi)的GAL10啟動子和ERG10t終止子之間。這產(chǎn)生質(zhì)粒pNY7(pRS425.ERG10t-th1A-GAL10-GAL1-hbd-GAL1t)，所述質(zhì)粒pNY7通過PCR和限制酶切作圖來驗證。
在基于缺口修復(fù)重組的后續(xù)克隆步驟中，pNY7中的GAL10啟動子替換為CUP1啟動子，且GAL1啟動子替換為強GPD啟動子。這種質(zhì)粒pNY10(pRS425.ERG10t-thlA-CUP1-GPD-hbd-GAL1t)允許在銅誘導型啟動子CUP1下表達thlA基因，和在GPD啟動子下表達hbd基因。CUP1啟動子序列從酵母BY4743基因組DNA進行PCR擴增，其中使用引物OT806(SEQ ID NO174)和OT807(SEQ ID NO175)。GPD啟動子從BY4743基因組DNA擴增，其中使用引物OT808(SEQID NO176)和OT809(SEQ ID NO177)。CUP1和GPD啟動子的PCR產(chǎn)物與用NcoI和SphI限制酶消化的pNY7質(zhì)粒組合。從這個缺口修復(fù)克隆步驟構(gòu)建質(zhì)粒pNY10，所述質(zhì)粒pNY10通過PCR和限制酶切作圖來驗證。包含pNY10的酵母BY4741菌株具有Hbd活性，但無ThlA活性。與GAL1啟動子控制的Hbd活性相比較，在GPD啟動子下的Hbd活性顯著改善(1.8U/mg對0.40U/mg)。測序分析揭示pNY10中的thlA基因在3＇末端附近具有1個堿基缺失，這導致截短的蛋白質(zhì)。這解釋了菌株中硫解酶活性的缺乏。
質(zhì)粒pNY12用正確的thlA基因序列構(gòu)建。thlA基因通過用SphI和AscI消化從載體pTrc99a-E-C-H-T中切割。FBA1啟動子從BY4743基因組DNA進行PCR擴增，其中使用引物OT799(SEQ ID NO178)和OT761(SEQ ID NO179)，且用SalI和SphI限制酶進行消化。將thlA基因片段和FBA1啟動子片段連接到質(zhì)粒pNY10內(nèi)的AscI和SalI位點上，從而產(chǎn)生質(zhì)粒pNY12(pRS425.ERG10t-thlA-FBA1)，所述質(zhì)粒pNY12通過限制酶切作圖來驗證。將pNY12轉(zhuǎn)化到酵母菌株BY4741內(nèi)，且所得到的轉(zhuǎn)化體顯示1.66U/mg的ThlA活性。
將來自pNY12的FBA1啟動子-thlA基因片段重新亞克隆到pNY10內(nèi)。pNY10載體用AscI限制酶切割，且與從質(zhì)粒pNY12分離的AscI消化的FBA1啟動子-thlA基因片段連接。這產(chǎn)生了具有2個可能的插入方向的新質(zhì)粒。選擇具有以相反方向彼此相鄰定位的FBA1和GPD啟動子的克隆，且這種質(zhì)粒命名為pNY102。pNY102(pRS425.ERG10t-thlA-FBA1-GPD-hbd-GAL1t)通過限制酶切作圖來驗證。菌株DPD5206通過將pNY102轉(zhuǎn)化到酵母菌株BY4741內(nèi)來制備。DPD5206的ThlA活性為1.24U/mg，且Hbd活性為0.76U/mg。
用于crt表達的質(zhì)粒pNY11的構(gòu)建。crt基因表達盒通過在酵母在使用缺口修復(fù)重組，將GPM1啟動子、crt基因、和GPM1t終止子組合到載體pRS426內(nèi)來構(gòu)建。GPM1啟動子從酵母BY4743基因組DNA進行PCR擴增，其中使用引物OT803(SEQ ID NO180)和OT804(SEQ ID NO181)。crt基因從大腸桿菌質(zhì)粒pTrc99a-E-C-H-T使用PCR引物OT785(SEQ ID NO182)和OT786(SEQ ID NO183)擴增。GPM1t終止子從酵母BY4743基因組DNA進行PCR擴增，其中使用OT787(SEQ ID NO184)和OT805(SEQ ID NO185)。酵母載體pRS426用BamHI和HindIII進行消化，且進行凝膠純化。這種DNA與GPM1啟動子、crt基因和GPM1終止子的PCR產(chǎn)物共轉(zhuǎn)化到酵母BY4741感受態(tài)細胞內(nèi)。具有正確插入片段的克隆通過PCR和限制酶切作圖來驗證，且所得到的酵母菌株BY4741(pNY11pRS426-GPM1-crt-GPM1t)具有85U/mg的Crt活性。
用于thlA、hbd和crt共表達的質(zhì)粒pNY103的構(gòu)建。關(guān)于上游1-丁醇途徑酶的共表達，將來自pNY11的crt基因盒亞克隆到質(zhì)粒pNY102內(nèi)，以產(chǎn)生hbd、thlA和crt表達載體。包含GPM1啟動子、crt基因和GPM1終止子的2,347bp DNA片段用SacI和NotI限制酶從質(zhì)粒pNY11中切割，且克隆到載體pNY102內(nèi)，所述pNY102用NtoI進行消化且用SacI部分消化，從而產(chǎn)生表達載體pNY103(pRS425.ERG10t-thlA-FBA1-GPD-hbd-GAL1t-GPM1t-crt-GPM1)。通過用HindIII消化證實pNY103中存在所有3種盒后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母BY4743細胞內(nèi)，且轉(zhuǎn)化的酵母菌株命名為DPD5200。當在標準條件下生長時，DPD5200顯示分別為0.49U/mg、0.21 U/mg和23.0 U/mg的ThlA、Hbd和Crt酶活性。
用于ald表達的質(zhì)粒pNY8的構(gòu)建。編碼Ter蛋白質(zhì)(SEQ ID NO187)、命名為tery的密碼子最優(yōu)化基因(SEQ ID NO186)，和編碼Ald蛋白質(zhì)(SEQ ID NO189)、命名為aldy的密碼子最優(yōu)化基因(SEQ ID NO188)，使用啤酒糖酵母的優(yōu)選密碼子來合成。包含密碼子最優(yōu)化的ter基因的質(zhì)粒pTERy和包含密碼子最優(yōu)化的ald基因的pALDy由DNA2.0(Palo Alto，CA)制備。
為了裝配pNY8(pRS426.GPD-ald-GPDt)，包括GPD啟動子的PCR產(chǎn)物(由引物OT800(SEQ ID NO190)和OT758(SEQ ID NO191)，以及BY4743基因組DNA合成)，通過用NcoI和SfiI從pALDy中切割的aldy基因片段(SEQ ID NO188)，和GPD終止子的PCR產(chǎn)物(由引物OT754(SEQ ID NO192)和OT755(SEQ ID NO193)，以及BY4743基因組DNA合成)的3種插入片段，經(jīng)由缺口修復(fù)重組克隆與BamHI、HindIII消化的pRS426載體重組。酵母BY4741轉(zhuǎn)化克隆通過PCR作圖進行分析。因此構(gòu)建的新質(zhì)粒pNY8通過限制酶切作圖進一步證實。分析包含pNY8的酵母BY4741轉(zhuǎn)化體的Ald活性，且針對丁酰輔酶A的比活性為約0.07U/mg。
用于ter表達的質(zhì)粒pNY9和pNY13的構(gòu)建。通過缺口修復(fù)克隆將密碼子最優(yōu)化的tery基因克隆到在FBA1啟動子控制下的載體pRS426內(nèi)。FBA1啟動子從酵母BY4743基因組DNA進行PCR擴增，其中使用引物OT760(SEQ ID NO194)和OT792(SEQ ID NO195)。tery基因通過SphI和NotI限制酶消化質(zhì)粒pTERy來獲得，這導致作為SEQ ID NO186給出的片段。FBA1終止子的PCR片段通過PCR從酵母BY4743基因組DNA產(chǎn)生，其中使用引物OT791(SEQ ID NO196)和OT765(SEQ ID NO197)。3種DNA片段-FBA1啟動子、ter基因和FBA1終止子，與BamHI、HindIII消化的pRS426載體組合，且通過缺口修復(fù)重組轉(zhuǎn)化到酵母BY4741內(nèi)。所得到的質(zhì)粒pNY9(pRS426-FBA1-tery-FBA1t)通過PCR作圖以及限制酶切消化來證實。pNY9的酵母BY4741轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生0.26U/mg的Ter活性。
為了制備最終的1-丁醇生物合成途徑菌株，必需構(gòu)建包含幾種質(zhì)粒的酵母表達菌株，所述質(zhì)粒各自具有獨特的營養(yǎng)選擇標記。因為親本載體pRS426包含Ura選擇標記，所以將ter表達盒亞克隆到包含His3標記的載體pRS423內(nèi)。包含F(xiàn)BA1-tery-FBA1t盒的3.2kb片段通過用SacI和XhoI限制酶消化從質(zhì)粒pNY9分離，且連接到用這2種相同酶切割的載體pRS423內(nèi)。新質(zhì)粒pNY13(pRS423-FBA1-tery-FBAIt)通過限制酶切消化進行作圖。將pNY13轉(zhuǎn)化到BY4741菌株內(nèi)，且在SD-His培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從而產(chǎn)生具有0.19U/mg Ter活性的菌株。
包含1-丁醇生物合成途徑基因用于證實1-丁醇生產(chǎn)的酵母菌株的構(gòu)建。如上所述，酵母菌株DPD5200通過將質(zhì)粒pNY103轉(zhuǎn)化到啤酒糖酵母菌株BY4743內(nèi)來構(gòu)建，所述質(zhì)粒pNY103允許thlA、hbd和crt基因共表達。DPD5200的酵母感受態(tài)細胞如上所述進行制備，且將質(zhì)粒pNY8和pNY13共轉(zhuǎn)化到DPD5200內(nèi)，從而產(chǎn)生菌株DPD5213。DPD5213允許1-丁醇生物合成途徑中的5種基因thlA、hbd、crt、ter和ald同時組成型表達。菌株DPD5212(用空質(zhì)粒，pRS425和pRS426轉(zhuǎn)化的啤酒糖酵母菌株BY4743)用作陰性對照。菌株DPD5213的4個獨立分離物在SD-Ura，-Leu，-His撤除成分極限培養(yǎng)基中在2％葡萄糖或2％蔗糖的存在下生長，以允許所有3種質(zhì)粒的生長互補。DPD5212的單個分離物在合適培養(yǎng)基中類似地生長。
為了證實通過需氧培養(yǎng)物的1-丁醇生產(chǎn)，將每種菌株的單個菌落在新鮮瓊脂板上劃線，所述新鮮瓊脂板包含SD極限撤除成分生長培養(yǎng)基(包含2％葡萄糖)或SS極限撤除成分生長培養(yǎng)基(包含2％蔗糖)，且于30℃溫育2天。來自這些板的細胞用于接種125mL塑料搖瓶中的20mL極限撤除成分培養(yǎng)基(SD或SS)，且于30℃伴隨250rpm振蕩生長過夜。測量過夜培養(yǎng)物的光密度(OD600)，且在125mL搖瓶中的25mL相同培養(yǎng)基中將培養(yǎng)物稀釋至OD6000.1，且于30℃伴隨250rpm振蕩生長。
如一般方法部分中所述，在24小時和48小時時取出等分試樣的培養(yǎng)物用于1-丁醇生產(chǎn)的GC分析(HP-INNOWax柱，30m x 0.53mmid，1μm膜厚度)，其具有FID檢測。GC分析結(jié)果在表15中給出。
表15 通過啤酒糖酵母菌株DPD5213從葡萄糖和蔗糖的1-丁醇生產(chǎn) 1獨立分離物由a-d指示。
2通過GC測定的濃度。
實施例18(預(yù)示的) 1-丁醇生物合成途徑在植物乳桿菌中的表達 這個預(yù)示的實施例的目的是描述如何在植物乳桿菌中表達1-丁醇生物合成途徑。將編碼6種酶活性的1-丁醇途徑的6種基因分成2個操縱子用于表達。使用由Hols等人(Appl.Environ.Microbiol.601401-1413(1994))描述的方法，通過同源重組將該途徑的前3種基因(thl、hbd和crt，分別編碼乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶、3-羥丁酰輔酶A脫氫酶和巴豆酸酶)整合到植物乳桿菌染色體內(nèi)。將后3種基因(EgTER、ald和bdhB，分別編碼丁酰輔酶A脫氫酶、丁醛脫氫酶和丁醇脫氫酶)克隆到表達質(zhì)粒內(nèi)，且轉(zhuǎn)化到攜帶整合的上游途徑1-丁醇基因的乳桿菌屬菌株內(nèi)。乳桿菌屬在MRS培養(yǎng)基(DifcoLaboratories，Detroit，MI)中于37℃生長。如由Moreira等人(BMCMicrobiol.515(2005))所述，從植物乳桿菌分離染色體DNA。
整合。通過同源重組將在合成的P11啟動子(Rud等人，Microbiology 1521011-1019(2006))控制下的thl-hbd-crt盒整合到植物乳桿菌ATCC BAA-793(NCIMB8826)染色體內(nèi)的ldhL1基因座上。為了構(gòu)建ldhL整合靶向載體，來自植物乳桿菌(GenbankNC_004567)與ldhL具有同源性的DNA片段進行PCR擴增，其中使用引物LDH EcoRV F(SEQ ID NO198)和LDH AatIIR(SEQ ID NO199)。將1986 bp PCR片段克隆到pCR4Blunt-TOPO內(nèi)且測序。pCR4Blunt-TOPO-ldhL1克隆用EcoRV和AatII進行消化，從而釋放凝膠純化的1982 bp ldhL1片段。在實施例14中描述的整合載體pFP988用HindIII進行消化，且用克列諾DNA聚合酶處理，以使末端變成平頭的。線性化質(zhì)粒隨后用AatII進行消化，且將2931bp載體片段凝膠純化。使EcoRV/AatII ldhL1片段與pFP988載體片段連接，且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)化體在包含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB瓊脂板上進行選擇，且通過菌落PCR進行篩選，以證實pFP988-1dhL的構(gòu)建。
為了給整合DNA添加選擇標記，Cm基因與其啟動子從pC194(Genbank NC_002013)進行PCR擴增，其中使用引物Cm F(SEQ IDNO200)和Cm R(SEQ ID NO201)，從而擴增836bp PCR產(chǎn)物。將擴增子克隆到pCR4Blunt-TOPO內(nèi)，且轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)，從而產(chǎn)生pCR4Blunt-TOPO-Cm。測序以證實通過PCR沒有引入錯誤后，Cm盒作為828 bp MluI/SwaI片段從pCR4Blunt-TOPO-Cm中消化，且進行凝膠純化。包含ldhL同源性的整合載體pFP988-ldhL用MluI和SwaI進行消化，且將4740bp載體片段凝膠純化。Cm盒片段與pFP988-ldhL載體連接，從而生成pFP988-DldhL::Cm。
最后來自實施例14中描述的pFP988Dss-T-H-C的thl-hbd-crt盒進行修飾，以用合成的P11啟動子替換淀粉酶啟動子。隨后，將整個操縱子移至pFP988-DldhL::Cm內(nèi)。P11啟動子通過與引物P11F(SEQ IDNO202)和P11R(SEQ ID NO203)的寡核苷酸退火構(gòu)建。退火的寡核苷酸在6％ Ultra PAGE凝膠(Embi Tec，San Diego，CA)上進行凝膠純化。質(zhì)粒pFP988Dss-T-H-C用XhoI和SmaI進行消化，且將9kbp載體片段凝膠純化。使分離的P11片段與消化的pFP988Dss-T-H-C連接，以產(chǎn)生pFP988-P11-T-H-C。質(zhì)粒pFP988-P11-T-H-C用XhoI和BamHI進行消化，且將3034bp P11-T-H-C片段凝膠純化。pFP988-Dldh L::Cm用XhoI和BamHI進行消化，且分離5558bp載體片段。使上游途徑操縱子與整合載體連接，以產(chǎn)生pFP988-DldhL-P11-THC::Cm。
將pFP988-DldhL-P11-THC::Cm整合到植物乳桿菌BAA-793內(nèi)，以形成包含外源thl、hbd和crt基因的植物乳桿菌ΔldhL1::T-H-C::Cm。植物乳桿菌的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞如Aukrust，T.W.，等人(InElectroporation Protocols for Microorganisms；Nickoloff，J.A.，Ed.；Methods in Molecular Biology，第47卷；Humana Press，Inc.，Totowa，NJ，1995，第201-208頁)所述制備。如Aukrust等人同上所述，電穿孔后，細胞在MRSSM培養(yǎng)基(補加了0.5M蔗糖和0.1M MgCl2的MRS培養(yǎng)基)于37℃不伴隨振蕩過度生長(outgrow)2小時。為了選擇將電穿孔的細胞在包含氯霉素(10μg/mL)的MRS板上進行鋪平板且于37℃溫育。轉(zhuǎn)化體通過菌落PCR擴增進行最初篩選以證實整合，且最初的陽性克隆隨后通過PCR擴增使用一組引物更嚴格地篩選。
EgTER、ald和bdhB基因的質(zhì)粒表達。剩余3種1-丁醇基因在植物乳桿菌ldhL啟動子(Ferain等人，J.Bacteriol.176596-601(1994))控制下，由質(zhì)粒pTRKH3(O＇Sullivan DJ和Klaenhammer TR，Gene 137227-231(1993))表達。ldhL啟動子從植物乳桿菌ATCC BAA-793基因組進行PCR擴增，其中使用引物PldhL F(SEQ ID NO204)和PldhL R(SEQ ID NO205)。將369bp PCR產(chǎn)物克隆到pCR4Blunt-TOPO內(nèi)且測序。所得到的質(zhì)粒pCR4Blunt-TOPO-PldhL用SacI和BamHI進行消化，從而釋放359 bp PldhL片段。
實施例14中描述的pHT01-ald-EB用SacI和BamHI進行消化，且通過凝膠純化回收10503bp載體片段。使PldhL片段和載體連接，從而產(chǎn)生pHT01-Pldhl-ald-EB。
為了亞克隆ldhL啟動子-ald-EgTER-bdh盒，用MluI消化pHT01-Pldhl-ald-EB，且用克列諾DNA聚合酶處理末端。線性化的載體用SalI進行消化，且將包含PldhL-AEB片段的4270bp片段凝膠純化。質(zhì)粒pTRKH3用SalI和EcoRV進行消化，且使凝膠純化的載體片段與PldhL-AEB片段連接。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)，且將轉(zhuǎn)化體在包含紅霉素(150mg/L)的腦心浸液(Brain HeartInfusion)(BHI，Difco Laboratories，Detroit，MI)板上進行鋪平板。轉(zhuǎn)化體通過PCR進行篩選，以證實pTRKH3-ald-E-B的構(gòu)建。如上所述通過電穿孔將表達質(zhì)粒pTRKH3-ald-E-B轉(zhuǎn)化到植物乳桿菌ΔldhL1::T-H-C::Cm內(nèi)。
將包含pTRKH3-ald-E-B的植物乳桿菌ΔldhL1::T-H-C::Cm接種到250mL搖瓶內(nèi)，所述搖瓶包含50mL MRS培養(yǎng)基加紅霉素(10μg/mL)，且于37℃不伴隨振蕩生長18-24小時。18-24小時后，如一般方法部分中所述，通過HPLC或GC分析檢測1-丁醇。
實施例19(預(yù)示的) 1-丁醇生物合成途徑在糞腸球菌中的表達 這個預(yù)示的實施例的目的是描述如何在糞腸球菌中表達1-丁醇生物合成途徑。糞腸球菌菌株V583的全基因組序列已得到公開(Paulsen等人，Science 2992071-2074(2003))，所述菌株V583在這個實施例中作為宿主菌株用于表達1-丁醇生物合成途徑。質(zhì)粒pTRKH3(O＇Sullivan DJ和Klaenhammer TR，Gene 137227-231(1993))-大腸桿菌/革蘭氏陽性穿梭載體用于表達在1個操縱子中的1-丁醇途徑的6種基因(thlA、hbd、crt、EgTER、ald、bdhB)。pTRKH3包含大腸桿菌質(zhì)粒p15A復(fù)制起點和pAMβ1復(fù)制子，以及2種抗生素抗性選擇標記-四環(huán)素抗性和紅霉素抗性。四環(huán)素抗性只在大腸桿菌中表達，而紅霉素抗性在大腸桿菌和革蘭氏陽性細菌中均表達。質(zhì)粒pAMβ1衍生物可以在糞腸球菌中復(fù)制(Poyart等人，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett.156193-198(1997))。已通過乳鏈菌肽在多種革蘭氏陽性細菌包括糞腸球菌中用于有效控制基因表達的誘導型nisA啟動子(PnisA)(Eichenbaum等人，Appl.Environ.Microbiol.642763-2769(1998))，用于控制編碼1-丁醇生物合成途徑酶的6種所需基因的表達。
包含nisA啟動子(Chandrapati等人，Mol.Microbiol.46(2)467-477(2002))的線性DNA片段(215bp)從乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)基因組DNA進行PCR擴增，其中使用引物F-PnisA(EcoRV)(SEQ IDNO206)和R-PnisA(PmeI BamHI)(SEQ ID NO207)。215bp PCR片段用EcoRV和BamHI進行消化，且將所得到的PnisA片段凝膠純化。質(zhì)粒pTRKH3用EcoRV和BamHI進行消化，且將載體片段凝膠純化。使線性化的pTRKH3與PnisA片段連接。通過電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)，且轉(zhuǎn)化體于37℃在包含紅霉素(25μg/mL)的LB瓊脂板上過夜生長后進行選擇。轉(zhuǎn)化體隨后通過菌落PCR使用引物F-PnisA(EcoRV)和R-PnisA(BamHI)進行篩選，以證實pTRKH3-PnisA的正確克隆。
質(zhì)粒pTRKH3-PnisA用PmeI和BamHI進行消化，且將載體凝膠純化。質(zhì)粒pHTO1-ald-EgTER-bdhB如實施例14中所述進行構(gòu)建并用SmaI和BamHI進行消化，且將2,973bpald-EgTER-bdhB片段凝膠純化。將2,973bpald-EgTER-bdhB連接到pTRKH3-PnisA載體內(nèi)的PmeI和BamHI位點上。通過電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)，且轉(zhuǎn)化體于37℃在包含紅霉素(25μg/mL)的LB瓊脂板上過夜溫育后進行選擇。轉(zhuǎn)化體隨后通過菌落PCR用引物ald正向引物N27F1(SEQ ID NO31)和bdhB反向引物N65(SEQ ID NO44)進行篩選。所得到的質(zhì)粒命名為pTRKH3-PnisA-ald-EgTER-bdhB(＝pTRKH3-A-E-B)。
質(zhì)粒pTRKH3-A-E-B從轉(zhuǎn)化體中進行純化，且用于進一步將剩余基因(thlA、hbd、crt)克隆到位于bdhB基因下游的BamHI位點內(nèi)。質(zhì)粒pTRKH3-A-E-B用BamHI進行消化，且用DNA聚合酶的克列諾片段處理，以產(chǎn)生平端。質(zhì)粒pFP988Dss-thlA-hbd-crt(＝pFP988Dss-T-H-C)如實施例14中所述進行構(gòu)建，且用SmaI和BamHI進行消化。所得到的2,973bpthlA-hbd-crt片段用DNA聚合酶的克列諾片段處理，以產(chǎn)生平端，且進行凝膠純化。使2,973bpthlA-hbd-crt片段與線性化的pTRKH3-A-E-B連接。通過電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10細胞內(nèi)，且轉(zhuǎn)化體于37℃在包含紅霉素(25μg/mL)的LB瓊脂板上過夜生長后進行選擇。轉(zhuǎn)化體隨后通過菌落PCR用引物thlA正向引物N7(SEQ ID NO21)和crt反向引物N4(SEQ ID NO18)進行篩選。所得到的質(zhì)粒命名為pTRKH3-PnisA-ald-EgTER-bdhB-thlA-hbd-crt(＝pTRKH3-A-E-B-T-H-C)。質(zhì)粒pTRKH3-A-E-B-T-H-C由大腸桿菌轉(zhuǎn)化體制備，且使用本領(lǐng)域已知方法(Aukrust，T.W.，等人InElectroporationProtocols for Microorganisms；Nickoloff，J.A.，Ed.；Methods in MolecularBiology，第47卷；Humana Press，Inc.，Totowa，NJ.，1995，第217-226頁)，通過電穿孔轉(zhuǎn)化到電轉(zhuǎn)化感受態(tài)糞腸球菌V583細胞內(nèi)，從而導致產(chǎn)生糞腸球菌V583/pTRKH3-A-E-B-T-H-C。
通過電穿孔將第2種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到糞腸球菌V583/pTRKH3-A-E-B-T-H-C內(nèi)，所述第2種質(zhì)粒包含nisA調(diào)節(jié)基因、nisR和nisK、add9壯觀霉素抗性基因、以及pSH71復(fù)制起點。包含pSH71復(fù)制起點的質(zhì)粒與pAMβ1衍生物在糞腸球菌中是相容的(Eichenbaum等人，同上)。雙重藥物抗性轉(zhuǎn)化體在包含紅霉素(25μg/mL)和壯觀霉素(100μg/mL)的LB瓊脂板上進行選擇。
所得到的糞腸球菌菌株V583B具有2種質(zhì)粒，即表達質(zhì)粒(pTRKH3-A-E-B-T-H-C)和調(diào)節(jié)質(zhì)粒(pSH71-nisRK)，被接種到包含50mL Todd-Hewitt液體培養(yǎng)基的250mL搖瓶內(nèi)，所述Todd-Hewitt液體培養(yǎng)基補加了酵母提取物(0.2％)(Fischetti等人，J.Exp.Med.1611384-1401(1985))、乳鏈菌肽(20μg/mL)(Eichenbaum等人，同上)、紅霉素(25μg/mL)、和壯觀霉素(100μg/mL)。瓶于37℃不伴隨振蕩溫育18-24小時，這之后，如一般方法部分中所述，通過HPLC或GC分析測量1-丁醇生產(chǎn)。
序列表
<110>E.I.du Pont de Nemours and Co.
<120>4碳醇的發(fā)酵生產(chǎn)
<130>CL3241 PCT
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<170>PatentIn version 3.3
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<400>71
<210>72
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>72
<210>73
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>73
<210>74
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>74
<210>75
<211>79
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>75
<210>76
<211>1197
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的密碼子最優(yōu)化的CACO462基因
<400>76
<210>77
<211>1224
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密碼子最優(yōu)化的EgTER
<400>77
<210>78
<211>1498
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密碼子最優(yōu)化的ald基因
<400>78
<210>79
<211>6509
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>質(zhì)粒pFP988
<400>79
<210>80
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N85
<400>80
<210>81
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N86
<400>81
<210>82
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>T7引物
<400>82
<210>83
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Trc99af
<400>83
<210>84
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N5SeqF4
<400>84
<210>85
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物T-ald(BamHI)
<400>85
<210>86
<211>54
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物B-ald(ETGER)
<400>86
<210>87
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物T-Ptrc(BspEI)
<400>87
<210>88
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物B-aldopt(BspEI)
<400>88
<210>89
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物T-BspEIAatII
<400>89
<210>90
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物B-BspEIAatII
<400>90
<210>91
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>1.6GI啟動子
<400>91
<210>92
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>1.5GI啟動子
<400>92
<210>93
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物AFBamHI
<400>93
<210>94
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物ARAat2
<400>94
<210>95
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物正向1(E)
<400>95
<210>96
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物底部反向1(E)
<400>96
<210>97
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Top正向2(B)
<400>97
<210>98
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物反向2(B)
<400>98
<210>99
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Pamy/lacOF
<400>99
<210>100
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Pam/la cOR
<400>100
<210>101
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Spac F
<400>101
<210>102
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Spac R
<400>102
<210>103
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Top TF
<400>103
<210>104
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Bot TR
<400>104
<210>105
<211>57
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Top CF
<400>105
<210>106
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Bot CR
<400>106
<210>107
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N3SeqF1
<400>107
<210>108
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N3SeqF2
<400>108
<210>109
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N3SeqF3
<400>109
<210>110
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N4SeqR3
<400>110
<210>111
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N5SeqF3
<400>111
<210>112
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N7SeqR2
<400>112
<210>113
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N31SeqF1
<400>113
<210>114
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N62SeqF2
<400>114
<210>115
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N62SeqF3
<400>115
<210>116
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N62SeqF4
<400>116
<210>117
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N63SeqR1
<400>117
<210>118
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N63SeqR2
<400>118
<210>119
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N63SeqR3
<400>119
<210>120
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物N63SeqR4
<400>120
<210>121
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Pamy SeqF2
<400>121
<210>122
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Pamy SeqF
<400>122
<210>123
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Pamy seqR
<400>123
<210>124
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物SpacF Seq
<400>124
<210>125
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物sacB Up
<400>125
<210>126
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物sacB Dn
<400>126
<210>127
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物HT R
<400>127
<210>128
<211>1185
<212>DNA
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>128
<210>129
<211>394
<212>PRT
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>129
<210>130
<211>1182
<212>DNA
<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
<400>130
<210>131
<211>393
<212>PRT
<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
<400>131
<210>132
<211>1197
<212>DNA
<213>啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>132
<210>133
<211>398
<212>PRT
<213>啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>133
<210>134
<211>864
<212>DNA
<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
<400>134
<210>135
<211>287
<212>PRT
<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
<400>135
<210>136
<211>855
<212>DNA
<213>富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)
<400>136
<210>137
<211>284
<212>PRT
<213>富養(yǎng)羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)
<400>137
<210>138
<211>741
<212>DNA
<213>真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrophis)
<400>138
<210>139
<211>246
<212>PRT
<213>真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligenes eutrophus)
<400>139
<210>140
<211>768
<212>DNA
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>140
<210>141
<211>255
<212>PRT
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>141
<210>142
<211>783
<212>DNA
<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
<400>142
<210>143
<211>260
<212>PRT
<213>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
<400>143
<210>144
<211>405
<212>DNA
<213>豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)
<400>144
<210>145
<211>134
<212>PRT
<213>豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)
<400>145
<210>146
<211>1912
<212>DNA
<213>小眼蟲(Euglena gracilis)
<400>146
<210>147
<211>539
<212>PRT
<213>小眼蟲(Euglena gracilis)
<400>147
<210>148
<211>1344
<212>DNA
<213>丘鏈霉菌(Sreptomyces collinus)
<400>148
<210>149
<211>447
<212>PRT
<213>丘鏈霉菌(Streptomyces collinus)
<400>149
<210>150
<211>1344
<212>DNA
<213>天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)
<400>150
<210>151
<211>447
<212>PRT
<213>天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)
<400>151
<210>152
<211>2589
<212>DNA
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>152
<210>153
<211>862
<212>PRT
<213>丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)
<400>153
<210>154
<211>1164
<212>DNA
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>154
<210>155
<211>387
<212>PRT
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>155
<210>156
<211>3883
<212>DNA
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>156
<210>157
<211>477
<212>PRT
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>157
<210>158
<211>304
<212>PRT
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>158
<210>159
<211>415
<212>PRT
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400>159
<210>160
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Scr1
<400>160
<210>161
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Scr2
<400>161
<210>162
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Scr3
<400>162
<210>163
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Scr4
<400>163
<210>164
<211>74
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT731
<400>164
<210>165
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT732
<400>165
<210>166
<211>79
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT733
<400>166
<210>167
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT734
<400>167
<210>168
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT735
<400>168
<210>169
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT736
<400>169
<210>170
<211>81
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT737
<400>170
<210>171
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT738
<400>171
<210>172
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT797
<400>172
<210>173
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT798
<400>173
<210>174
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT806
<400>174
<210>175
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT807
<400>175
<210>176
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT808
<400>176
<210>177
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT809
<400>177
<210>178
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT799
<400>178
<210>179
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT761
<400>179
<210>180
<211>68
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT803
<400>180
<210>181
<211>49
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT804
<400>181
<210>182
<211>51
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT785
<400>182
<210>183
<211>63
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT786
<400>183
<210>184
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT787
<400>184
<210>185
<211>77
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PT805
<400>185
<210>186
<211>1269
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密碼子最優(yōu)化的ter
<400>186
<210>187
<211>398
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>修飾的Ter蛋白
<400>187
<210>188
<211>1484
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>密碼子最優(yōu)化的ald
<400>188
<210>189
<211>468
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>修飾的Ald
<400>189
<210>190
<211>69
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PT800
<400>190
<210>191
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT758
<400>191
<210>192
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT754
<400>192
<210>193
<211>52
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT755
<400>193
<210>194
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT760
<400>194
<210>195
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT792
<400>195
<210>196
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT791
<400>196
<210>197
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物OT765
<400>197
<210>198
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物LDHEcoRV F
<400>198
<210>199
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物LDH AatlR
<400>199
<210>200
<211>47
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Cm F
<400>200
<210>201
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物Cm R
<400>201
<210>202
<211>62
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P11 F
<400>202
<210>203
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物P11 R
<400>203
<210>204
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PldhL F
<400>204
<210>205
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物PldhL R
<400>205
<210>206
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物F-PnisA(EcoRV)
<400>206
<210>207
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物R-PnisA(PmeI BamHI)
<400>207
<210>208
<211>2460
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>模板DNA
<400>208
權(quán)利要求
1.一種重組微生物宿主細胞，其包含編碼多肽的至少一種DNA分子，所述多肽催化選自下述的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
a)乙酰輔酶A至乙酰乙酰輔酶A
b)乙酰乙酰輔酶A至3-羥丁酰輔酶A
c)3-羥丁酰輔酶A至巴豆酰輔酶A
d)巴豆酰輔酶A至丁酰輔酶A
e)丁酰輔酶A至丁醛和
f)丁醛至1-丁醇；
其中所述至少一種DNA分子對于所述微生物宿主細胞是異源的且其中所述微生物宿主細胞生產(chǎn)1-丁醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的宿主細胞，其中催化乙酰輔酶A至乙酰乙酰輔酶A的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的所述多肽是乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的宿主細胞，其中催化乙酰乙酰輔酶A至3-羥丁酰輔酶A的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的所述多肽是3-羥丁酰輔酶A脫氫酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的宿主細胞，其中催化3-羥丁酰輔酶A至巴豆酰輔酶A的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的所述多肽是巴豆酸酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的宿主細胞，其中催化巴豆酰輔酶A至丁酰輔酶A的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的所述多肽是丁酰輔酶A脫氫酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的宿主細胞，其中催化丁酰輔酶A至丁醛的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的所述多肽是丁醛脫氫酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的宿主細胞，其中催化丁醛至1-丁醇的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的所述多肽是丁醇脫氫酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的宿主細胞，其中所述細胞選自細菌、藍細菌、絲狀真菌和酵母。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的宿主細胞，其中所述細胞是選自梭菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、產(chǎn)堿菌屬、克雷伯氏菌屬、類芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、畢赤氏酵母屬、假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬和糖酵母屬的屬的成員。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是大腸桿菌。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是真養(yǎng)產(chǎn)堿菌。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是地衣芽孢桿菌。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是浸麻類芽孢桿菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是紅串紅球菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是惡臭假單胞菌。
16.根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是枯草芽孢桿菌。
17.根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是植物乳桿菌。
18.根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細胞，其中所述細胞選自屎腸球菌、鶉雞腸球菌、和糞腸球菌。
19.根據(jù)權(quán)利要求9的宿主細胞，其中所述細胞是啤酒糖酵母。
20.根據(jù)權(quán)利要求3的宿主細胞，其中所述乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶具有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO129、SEQ IDNO131、和SEQ ID NO133的氨基酸序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求4的宿主細胞，其中所述3-羥丁酰輔酶A脫氫酶具有選自SEQ ID NO6、SEQ ID NO135、SEQ ID NO137、和SEQ ID NO139的氨基酸序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求5的宿主細胞，其中所述巴豆酸酶具有選自SEQID NO8、SEQ ID NO141、SEQ ID NO143、和SEQ ID NO145的氨基酸序列。
23.根據(jù)權(quán)利要求6的宿主細胞，其中所述丁酰輔酶A脫氫酶具有選自SEQ ID NO10、SEQ ID NO147、SEQ ID NO149、SEQ IDNO151、和SEQ ID NO187的氨基酸序列。
24.根據(jù)權(quán)利要求7的宿主細胞，其中所述丁醛脫氫酶具有選自SEQ ID NO12、SEQ ID NO153、和SEQ ID NO189的氨基酸序列。
25.根據(jù)權(quán)利要求8的宿主細胞，其中所述丁醇脫氫酶具有選自SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO153、SEQ ID NO155、和SEQ ID NO157的氨基酸序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的宿主細胞，其中所述宿主細胞是兼性厭氧菌。
27.一種用于生產(chǎn)1-丁醇的方法，其包括
i)提供包含編碼多肽的至少一種DNA分子的重組微生物宿主細胞，所述多肽催化選自下述的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
a)乙酰輔酶A至乙酰乙酰輔酶A
b)乙酰乙酰輔酶A至3-羥丁酰輔酶A
c)3-羥丁酰輔酶A至巴豆酰輔酶A
d)巴豆酰輔酶A至丁酰輔酶A
e)丁酰輔酶A至丁醛和
f)丁醛至1-丁醇；
其中所述至少一種DNA分子對于所述微生物宿主細胞是異源的；和
ii)使(i)的所述宿主細胞在由此生產(chǎn)1-丁醇的條件下與可發(fā)酵的碳底物接觸。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述可發(fā)酵的碳底物選自單糖、寡糖和多糖。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述碳底物選自葡萄糖、蔗糖和果糖。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中由此生產(chǎn)1-丁醇的所述條件是厭氧的。
31.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中由此生產(chǎn)1-丁醇的所述條件是微需氧的。
32.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述宿主細胞在極限培養(yǎng)基中與所述碳底物接觸。
33.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中催化乙酰輔酶A至乙酰乙酰輔酶A的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的所述多肽是乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶。
34.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中催化乙酰乙酰輔酶A至3-羥丁酰輔酶A的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的所述多肽是3-羥丁酰輔酶A脫氫酶。
35.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中催化3-羥丁酰輔酶A至巴豆酰輔酶A的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的所述多肽是巴豆酸酶。
36.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中催化巴豆酰輔酶A至丁酰輔酶A的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的所述多肽是丁酰輔酶A脫氫酶。
37.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中催化丁酰輔酶A至丁醛的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的所述多肽是丁醛脫氫酶。
38.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中催化丁醛至1-丁醇的底物至產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的所述多肽是丁醇脫氫酶。
39.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述細胞選自細菌、藍細菌、絲狀真菌和酵母。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的方法，其中所述細胞是選自梭菌屬、發(fā)酵單胞菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、腸球菌屬、產(chǎn)堿菌屬、克雷伯氏菌屬、類芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬、棒桿菌屬、短桿菌屬、畢赤氏酵母屬、假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬和糖酵母屬的屬的成員。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述細胞是大腸桿菌。
42.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述細胞是真養(yǎng)產(chǎn)堿菌。
43.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述細胞是地衣芽孢桿菌。
44.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述細胞是浸麻類芽孢桿菌。
45.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述細胞是紅串紅球菌。
46.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述細胞是惡臭假單胞菌。
47.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述細胞是枯草芽孢桿菌。
48.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述細胞是植物乳桿菌。
49.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述細胞選自屎腸球菌、鶉雞腸球菌、和糞腸球菌。
50.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中所述細胞是啤酒糖酵母。
51.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中所述乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶具有選自SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO129、SEQ ID NO131、和SEQ ID NO133的氨基酸序列。
52.根據(jù)權(quán)利要求34的方法，其中所述3-羥丁酰輔酶A脫氫酶具有選自SEQ ID NO6、SEQ ID NO135、SEQ ID NO137、和SEQID NO139的氨基酸序列。
53.根據(jù)權(quán)利要求35的方法，其中所述巴豆酸酶具有選自SEQ IDNO8、SEQ ID NO141、SEQ ID NO143、和SEQ ID NO145的氨基酸序列。
54.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中所述丁酰輔酶A脫氫酶具有選自SEQ ID NO10、SEQ ID NO147、SEQ ID NO149、SEQ ID NO151、和SEQ ID NO187的氨基酸序列。
55.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中所述丁醛脫氫酶具有選自SEQID NO12、SEQ ID NO153、和SEQ ID NO189的氨基酸序列。
56.根據(jù)權(quán)利要求38的宿主細胞，其中所述丁醇脫氫酶具有選自SEQ ID NO14、SEQ ID NO16、SEQ ID NO153、SEQ ID NO155、和SEQ ID NO157的氨基酸序列。
57.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述宿主細胞是兼性厭氧菌。
全文摘要
提供了用于發(fā)酵生產(chǎn)4碳醇的方法。具體而言，丁醇，優(yōu)選地1-丁醇通過表達1-丁醇生物合成途徑的重組細菌的發(fā)酵生長來生產(chǎn)。
文檔編號C12P7/16GK101432434SQ200680035878
公開日2009年5月13日 申請日期2006年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月29日
發(fā)明者G·K·唐納森, L·L·黃, L·A·馬吉奧-黑爾, V·納加拉彥, C·E·納卡穆拉, W·叔 申請人:納幕爾杜邦公司