破囊壺菌、脂肪酸組合物和其制備方法及用圖
【專利說明】破囊壺菌、脂肋酸組合物和其制備方法及用途
[0001] 本發(fā)明申請是基于申請日為2009年3月19日、申請?zhí)枮?00980159422. 0(國際 申請?zhí)枮镻CT/US2009/001720)、名稱為"破囊壺菌、脂肪酸組合物和其制備方法及用途"的 發(fā)明專利申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明設(shè)及分離的破囊壺菌（t虹austochytrid)微生物及其菌株和變體。本發(fā)明 還設(shè)及破囊壺菌生物質(zhì)、微生物油、組合物、培養(yǎng)物、生產(chǎn)微生物油的方法和使用分離破囊 壺菌、生物質(zhì)及微生物油的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 脂肪酸基于碳鏈長度和飽和特性分類。短鏈脂肪酸通常具有12個碳或更少，中鏈 脂肪酸通常具有14到18個碳，長鏈脂肪酸通常具有20個或更多碳。碳原子間不存在雙鍵 時脂肪酸定義為飽和脂肪酸且在雙鍵存在時定義為不飽和脂肪酸。僅存在一個雙鍵時不飽 和長鏈脂肪酸是單不飽和且存在大于一個雙鍵時是多不飽和。
[0004] 多不飽和脂肪酸（PUFA)基于所述脂肪酸甲基末端的第一個雙鍵位置分類。 Q-3 (n-3)脂肪酸在第=個碳上包含第一個雙鍵，而Q-6 (n-6)脂肪酸在第六個碳上包含 第一個雙鍵。例如，二十二碳六締酸廣DHA")是Q-3長鏈多不飽和脂肪酸（LC-PUFA)，具有 22個碳的鏈長度和6個雙鍵，通常標(biāo)為"22:6n-3"。其他Q-3LC-PUFA包括標(biāo)為"20:5 n-3"的二十碳五締酸（"EPA")和標(biāo)為"22:5n-3"的Q-3二十二碳五締酸廣DPAn-3")。 DHA和EPA定義為"必需"脂肪酸。Q-6LC-PUFA包括標(biāo)為"20:4n-6"的花生四締酸廣ARA") 和標(biāo)為"22:5n-6"的Q-6二十二碳五締酸廣DPAn-6")。
[0005] Q-3脂肪酸是生物學(xué)上重要的分子，由于其在細胞膜的存在而影響細胞生理 學(xué)，調(diào)節(jié)生物活性化合物的生成和基因表達，且用作生物合成底物。Roche,H.M.，Proc. Nutr.Soc.58:397-401(1999)。例如，DHA占人大腦皮層中脂質(zhì)的約15% -20 %、視網(wǎng)膜 中脂質(zhì)的約30% -60%，其集中于睪丸和精液中，且是乳汁中的重要成分。Jean-Pascal Berg6和GillesBarnathan，"來自海洋生物脂質(zhì)的脂肪酸；分子生物多樣性，作為生 物標(biāo)記的作用，生物活性化合物和經(jīng)濟方面"（FattyAcids化omLipidsofMarine Organisms:MolecularBiodiversity,RolesasBiomarkers,BiologicallyActive Compounds,andEconomicalAspects),《海洋生物技術(shù)》（MarineBiotechnology)]；49(T. Sch巧er編，2005)。DHA占大腦中Q-3脂肪酸的多達97%和視網(wǎng)膜中Q-3脂肪酸的多 達93%。此外，DHA對胎兒和嬰兒發(fā)育化及維持成人中的認知功能是必需的。同上。包括 DHA和EPA在內(nèi)的Q-3脂肪酸也具有抗炎特性。參見例如同上W及Simopoulos，A.P.，J. Am.Coll.Nutr.21:495-595(2002)。由于Q-3脂肪酸不在人體內(nèi)從頭合成，該些脂肪酸必 須獲得自營養(yǎng)源。
[0006] 亞麻巧油和魚油被視作Q-3脂肪酸的良好膳食來源。亞麻巧油不含EPA、DHA、DPA 或ARA，但含有能使身體生成EPA的基礎(chǔ)成分亞麻酸（C18:3n-3)。然而，有證據(jù)顯示代謝 轉(zhuǎn)化率可w較慢且可變，特別是在健康受損的機體中。魚油在脂肪酸組成的類型和水平上 差異很大，該取決于具體物種和其飲食。例如，水產(chǎn)養(yǎng)殖的魚往往Q-3脂肪酸水平低于野 生魚。此外，魚油具有含環(huán)境污染物的風(fēng)險并可能設(shè)及穩(wěn)定性問題和魚腥味或口味。
[0007] 破囊壺菌是破囊壺菌目（T虹austochyhiales)微生物。破囊壺菌包括裂殖壺 菌屬（Schizochytrium)的成員且被認為是包括DHA在內(nèi)的Q-3脂肪酸的替代來源。參 見美國專利第5, 130, 242號。該些海洋異養(yǎng)微生物生成的油通常具有比相應(yīng)魚或微藻油 更簡單的多不飽和脂肪酸分布。Lewis,T.E. ,Mar.Biotechnol. 1:580-587 (1999)。據(jù)報 道，破囊壺菌菌株W該生物體所產(chǎn)生總脂肪酸的高百分比生成Q-3脂肪酸。美國專利第 5, 130, 242 號；Huang,J.等，J.Am.Oil.Qiem.Soc. 78:605-610(2001) ;Huang,J.等，Mar. Biotechnol. 5:450-457 (2003)。然而，分離的破囊壺菌在生成LC-PUFA的特性和量上不同， 從而一些前述菌株可能具有的n-6脂肪酸水平不理想和/或在培養(yǎng)中表現(xiàn)出低生產(chǎn)率。由 此，從營養(yǎng)源中分離出證明有高生產(chǎn)率和理想LC-PUFA分布的破囊壺菌的需求一直存在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明設(shè)及WATCC登錄號PTA-9695保藏的破囊壺菌物種的分離破囊壺菌微生物 或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％或更少的 二十碳五締酸。
[0009] 本發(fā)明也設(shè)及具有WATCC登錄號PTA-9695保藏的破囊壺菌物種特征的分離破 囊壺菌微生物，其中所述微生物或其衍生菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％或更少的 二十碳五締酸。
[0010] 本發(fā)明也設(shè)及含有甘油=醋組分的分離破囊壺菌微生物或其衍生菌株，其中所 述甘油=醋組分的二十二碳六締酸含量為至少約40重量％，其中所述甘油=醋組分的 二十二碳五締酸n-6含量為至少約0. 5重量％ -約6重量％，且其中所述微生物或其衍生 菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％或更少的二十碳五締酸。
[0011] 本發(fā)明也設(shè)及與WATCC登錄號PTA-9695保藏的破囊壺菌物種同種的分離破囊壺 菌微生物或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％ 或更少的二十碳五締酸。
[0012] 在一些實施方式中，本發(fā)明衍生自分離破囊壺菌微生物的菌株是突變菌株。
[0013] 本發(fā)明也設(shè)及WATCC登錄號PTA-9695、PTA-9696、PTA-9697 或PTA-9698 保藏的 分離微生物。
[0014] 本發(fā)明也設(shè)及含任意一種本發(fā)明破囊壺菌微生物或其混合物的破囊壺菌生物質(zhì)。
[0015] 本發(fā)明也設(shè)及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中至少約50重量％的生物質(zhì)細胞干重 是脂肪酸，且其中至少約50重量％的脂肪酸是Q-3脂肪酸。在一些實施方式中，至少約50 重量％的脂肪酸是二十二碳六締酸。本發(fā)明還設(shè)及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中至少約25 重量％的生物質(zhì)細胞干重是二十二碳六締酸。
[0016] 在一些實施方式中，本發(fā)明也設(shè)及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中約10重量％或更 少的脂肪酸是二十碳五締酸，且其中二十二碳六締酸與二十碳五締酸的重量比為至少約 5:1。
[0017] 在一些實施方式中，本發(fā)明也設(shè)及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中約1.5重量％ 或更少的脂肪酸是花生四締酸，且其中二十二碳六締酸與花生四締酸的重量比為至少約 20:1。
[0018] 在一些實施方式中，本發(fā)明也設(shè)及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其含有的二十二碳六 締酸與二十二碳五締酸n-6的重量比為至少約10:1。
[0019] 本發(fā)明也設(shè)及含任意一種本發(fā)明破囊壺菌微生物或其混合物的分離破囊壺菌培 養(yǎng)物。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)物包括至少約5%的溶解氧。
[0020] 本發(fā)明也設(shè)及用于動物或人的食品、化妝品或藥物組合物，其包含本發(fā)明破囊壺 菌微生物或生物質(zhì)中的任何一種或其混合物。
[0021] 本發(fā)明也設(shè)及含有至少約70重量％甘油S醋組分的微生物油，其中所述甘油S 醋組分的二十二碳六締酸含量為至少約50重量％，其中所述甘油S醋組分的二十二碳五 締酸n-6含量為約0. 5重量％ -約6重量％。在一些實施方式中，所述微生物油還包括占 所述甘油S醋組分約1. 5重量％或更少的花生四締酸含量。
[0022] 本發(fā)明也設(shè)及含有至少約70重量％甘油S醋組分的微生物油，其中所述甘油S 醋組分的二十二碳六締酸含量為至少約40重量％，其中所述甘油S醋組分的二十二碳五 締酸n-6含量為至少約0. 5重量％ -約6重量％，且其中二十二碳六締酸與二十二碳五締 酸n-6的比例為大于約6:1。
[0023] 本發(fā)明也設(shè)及含有至少約70重量％甘油S醋組分的微生物油，其中所述甘油S 醋組分的二十二碳六締酸含量為至少約60重量％。
[0024] 在一些實施方式中，所述微生物油甘油S醋組分的至少約20%甘油S醋在所述甘 油=醋內(nèi)的兩個位置上含有二十二碳六締酸，所述位置選自sn-1、sn-2和sn-3位置中的任 意兩個。在一些實施方式中，所述微生物油甘油=醋組分的至少約5%甘油=醋在所述甘油 S醋中sn-1、sn-2和sn-3S個位置都含有二十二碳六締酸。
[00巧]在一些實施方式中，所述微生物油還包括約5重量％或更少的十走酸。
[0026] 本發(fā)明也設(shè)及用于動物或人的食品、化妝品或藥物組合物，其包含本發(fā)明的任何 微生物油。在一些實施方式中，所述食品是嬰兒配方。在一些實施方式中，所述嬰兒配方適 合早產(chǎn)兒。在一些實施方式中，所述食品是牛奶、飲料、治療性飲品、營養(yǎng)素飲料或其組合。 在一些實施方式中，所述食品是用于動物或人食物的添加劑。在一些實施方式中，所述食品 是營養(yǎng)補充品。在一些實施方式中，所述食品是動物飼料。在一些實施方式中，所述動物飼 料是水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料。在一些實施方式中，所述動物飼料是牲畜飼料、動物園動物飼料、役畜 飼料、家畜飼料或其組合。
[0027] 本發(fā)明也設(shè)及含Q-3脂肪酸的微生物油的生產(chǎn)方法，該方法包括；(a)使本發(fā)明 的任何一種分離破囊壺菌微生物或其混合物在培養(yǎng)物中生長W生成生物質(zhì)，和化）從所述 生物質(zhì)中提取含Q-3脂肪酸的油。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)物包括至少約5%的溶解 氧。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)物抑維持在約6. 5-約8. 5。在一些實施方式中，所述培 養(yǎng)物溫度維持在約17°C-約30°C。在一些實施方式中，所述培養(yǎng)物包括約5g/l-約50g/L 濃度的葡萄糖。
[0028] 本發(fā)明也設(shè)及含Q-3脂肪酸的微生物油的生產(chǎn)方法，該方法包括從本發(fā)明任何 一種生物質(zhì)中提取含Q-3脂肪酸的油。在一些實施方式中，所述微生物油用己燒提取方法 提取。在一些實施方式中，微生物油用無溶劑提取方法提取。
[0029] 在一些實施方式中，在pH約6. 5-約8. 0的培養(yǎng)基中約17°C-約30°C生長7天后， 從每升本發(fā)明任何培養(yǎng)物中分離的生物質(zhì)干細胞重為至少約50g，所述培養(yǎng)基包含碳、氮和 營養(yǎng)源及約95化pm-約8500ppm氯離子。
[0030] 在一些實施方式中，在抑約6. 5-約8. 0的培養(yǎng)基中約17°C-約30°C生長7天后， 本發(fā)明的任何一種分離培養(yǎng)物的n-3脂肪酸生產(chǎn)率為至少約2克/升/天，所述培養(yǎng)基包 含碳源、氮源和營養(yǎng)素及約95化pm-約8500ppm氯離子。
[0031] 本發(fā)明也設(shè)及通過本發(fā)明方法產(chǎn)生的微生物油。
[0032] 本發(fā)明也設(shè)及采用本發(fā)明的任何分離微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物生產(chǎn) 治療炎癥或其相關(guān)病癥的藥物。
[0033] 本發(fā)明也設(shè)及采用本發(fā)明的任何分離微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物治療 炎癥或其相關(guān)病癥。
[0034] 本發(fā)明也設(shè)及用于治療炎癥或其相關(guān)病癥的本發(fā)明的任何分離微生物、生物質(zhì)或 微生物油或其混合物。
[0035] 本發(fā)明也設(shè)及在需要的對象中治療炎癥或其相關(guān)病癥的方法，包括將本發(fā)明的任 何分離微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物W及藥學(xué)上可接受載體給予對象。
[0036] 具體地，本發(fā)明設(shè)及如下各項：
[0037] 1. -種WATCC登錄號PTA-9695保藏的破囊壺菌的分離破囊壺菌微生物或其衍生 菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％或更少的二十碳五 締酸。
[0038] 2. -種具有WATCC登錄號PTA-9695保藏的破囊壺菌特征的分離破囊壺菌微生 物，其中所述微生物或其衍生菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％或更少的二十碳五締 酸。
[0039] 3. -種含有甘油=醋組分的分離破囊壺菌微生物或其衍生菌株，其中所述甘油= 醋組分的二十二碳六締酸含量為至少約40重量％，其中所述甘油S醋組分的二十二碳五 締酸n-6含量為至少約0. 5重量％ -約6重量％，且其中所述微生物或其衍生菌株生成的 總脂肪酸包括約10重量％或更少的二十碳五締酸。
[0040] 4. 一種與WATCC登錄號PTA-9695保藏的破囊壺菌同種的分離破囊壺菌微生物 或其衍生菌株，其中所述微生物或其衍生菌株生成的總脂肪酸包括約10重量％或更少的 二十碳五締酸。
[0041] 5.如項1到4中任一項所述的分離破囊壺菌微生物，其特征在于，所述衍生菌株是 突變菌株。
[0042] 6. -種WATCC登錄號PTA-9695保藏的分離的破囊壺菌微生物。
[0043] 7. -種WATCC登錄號PTA-9696保藏的分離的破囊壺菌微生物。
[0044] 8. -種WATCC登錄號PTA-9697保藏的分離的破囊壺菌微生物。
[0045] 9. 一種WATCC登錄號PTA-9698保藏的分離的破囊壺菌微生物。
[0046] 10. -種含有前述項中任一項所述的破囊壺菌微生物或其混合物的破囊壺菌生物 質(zhì)。
[0047] 11. -種分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中，至少約50重量％的所述生物質(zhì)的細胞干 重是脂肪酸，且其中至少約50重量％的脂肪酸是Q-3脂肪酸。
[0048] 12.如項11所述的分離破囊壺菌生物質(zhì)，其特征在于，所述至少約50重量％的所 述脂肪酸是二十二碳六締酸。
[0049] 13. -種分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中，至少約25重量％的所述生物質(zhì)的細胞干 重是二十二碳六締酸。
[0050] 14.如項10到13中任一項所述的分離破囊壺菌生物質(zhì)，其特征在于，約10重量％ 或更少的所述脂肪酸是二十碳五締酸，且其中二十二碳六締酸與二十碳五締酸的重量比為 至少約5:1。
[0051] 15.如項10到14中任一項所述的分離破囊壺菌生物質(zhì)，其特征在于，約1.5重 量％或更少的所述脂肪酸是花生四締酸，且其中二十二碳六締酸與花生四締酸的重量比為 至少約20:1。
[0052] 16.如項10到15中任一項所述的分離破囊壺菌生物質(zhì)，其特征在于，所述生物質(zhì) 還含有重量比為至少約10:1的二十二碳六締酸與二十二碳五締酸n-6。
[0053] 17. -種含有項1到9中任一項所述的破囊壺菌微生物或其混合物的分離破囊壺 菌培養(yǎng)物。
[0054] 18.如項17所述的分離破囊壺菌培養(yǎng)物，其特征在于，所述破囊壺菌培養(yǎng)物還包 括至少約5 %的溶解氧。
[00巧]19. 一種用于動物或人的食品、化妝品或藥物組合物，其包括項1到16中任一項所 述的破囊壺菌微生物或破囊壺菌生物質(zhì)或其混合物。
[0056] 20. -種含有至少約70重量％甘油S醋組分的微生物油，其中，所述甘油S醋組 分的二十二碳六締酸含量為至少約50重量％，其中所述甘油=醋組分的二十二碳五締酸 n-6含量為約0. 5重量％ -約6重量％。
[0057] 21.如項20所述的微生物油，其特征在于，所述微生物油中所述甘油=醋組分的 花生四締酸含量為約1. 5重量％或更少。
[0058] 22. -種含有至少約70重量％甘油S醋組分的微生物油，其中，所述甘油S醋組 分的二十二碳六締酸含量為至少約40重量％，其中所述甘油=醋組分的二十二碳五締酸 n-6含量為至少約0. 5重量％ -約6重量％，且其中二十二碳六締酸與二十二碳五締酸n-6 的比例為大于約6:1。
[0059] 23. -種含有至少約70重量％甘油S醋組分的微生物油，其中，所述甘油S醋組 分的二十二碳六締酸含量為至少約60重量％。
[0060] 24.如項20到23中任一項所述的微生物油，其特征在于，所述甘油立醋組分的至 少約20%甘油=醋在所述甘油=醋內(nèi)的兩個位置上含有二十二碳六締酸，所述位置選自 sn-1、sn-2和sn-3位置中的任意兩個。
[006。 25.如項20到23中任一項所述的微生物油，其特征在于，所述甘油立醋組分的至 少約5 %甘油=醋在所述甘油=醋中sn-1、sn-2