專利名稱：利用芽孢桿菌進行纖維素結合結構域(cbd)的細胞外表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種能表達纖維素結合結構域多肽的轉化芽孢桿菌宿主，一種芽孢桿菌表達載體，以及在芽孢桿菌宿主細胞內生產纖維素結合結構域的方法。
背景技術：
對CBD作為一種功能性結構域的研究涉及到以單一結構域分子合成該結構域。最早的純CBD之一是通過自動固相合成法合成的(KraulisP.等(1989))。
已示CBD能以功能性的單一結構域形式在大腸桿菌中表達，參見例如Ong E.等(1993)，其中公布，采用大腸桿菌進行的表達在細胞外圍胞質中每升培養(yǎng)液的CBD產量為33mg。
最近，在大腸桿菌中也成功地表達了真菌CBD二體(二聚體)，見Linder M.等(1996)。
然而，CBD在大腸桿菌內的表達并不是真正的細胞外表達，并且產量也不盡如人意，對于CBD的工業(yè)水平生產來說該產量有些太低。
US5525195,US5536655,WO 91/17244和WO 91/10732公開了具有可操作地連接了纖維素結合結構域的催化活性結構域的內切葡聚糖酶在芽孢桿菌宿主細胞內的表達。
據此，本發(fā)明的目的是提供一種以高產率生產CBD的方法，該方法優(yōu)選采用涉及CBD的細胞外生產的常規(guī)發(fā)酵技術，這樣使得CBD在工業(yè)上的應用更為經濟可行。
發(fā)明概述本發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可通過在芽孢桿菌宿主中表達而生產纖維素結合結構域(CBD)。
在本發(fā)明之前，在芽孢桿菌中表達CBD是非常不如人意的，因為，首先，已知纖維素結合結構域含有二硫橋，其次，纖維素結合結構域對由芽孢桿菌宿主產生的蛋白酶的降解可能比較敏感。
據此，本發(fā)明的第一個方面涉及轉化了包含編碼纖維素結合結構域之DNA序列的載體、并且能夠表達該DNA序列的芽孢桿菌宿主。
在第二方面，本發(fā)明涉及一種芽孢桿菌表達載體，所述載體攜帶有編碼纖維素結合結構域的一段插入的DNA序列。
另外，在第三方面，本發(fā)明涉及在芽孢桿菌宿主細胞內生產纖維素結合結構域多肽的方法，該方法包括以下步驟--在營養(yǎng)培養(yǎng)基中，可以過量生產纖維素結合結構域的條件下，培養(yǎng)芽孢桿菌宿主細胞，所述宿主細胞已轉化了包含可操作性地連接在一起的以下諸成分的表達盒a)轉錄和翻譯起始調控區(qū)，b)編碼纖維素結合結構域多肽的DNA序列c)轉錄和翻譯終止調控區(qū)，其中所述調控區(qū)在該宿主中具有功能，和d)用于選擇已轉化宿主細胞的選擇標記基因；和--回收纖維素結合結構域多肽。發(fā)明詳述纖維素結合結構域(CBD)是一種可結合纖維素和幾丁質的水不溶性形式(包括晶態(tài)形式)或與它們有高親合力的多肽。
已發(fā)現(xiàn)CBD是由2個或多個不同多肽結構域組成的大蛋白質復合物的整合部分，例如存在于水解酶中，所述水解酶通常包含一個含有用于底物水解的活性位點的催化結構域和一個用于與不溶性基質結合的糖類結合結構域或纖維素結合結構域(CBD)。這樣的酶可以包含一個以上的催化結構域和一個、兩個或三個CBD，還可選擇性地包含一個或多個將CBD與所述催化結構域連接起來的多肽區(qū)，后一類型的區(qū)域通常被稱為“接頭”。包含CBD的水解酶的例子有纖維素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰酯酶和幾丁質酶。也已經在藻類中，例如在紅藻Porphyra purpurea中發(fā)現(xiàn)了非水解性多糖結合蛋白形式的CBD(參見Peter Tomme等人(1996))。但是，大多數已知的CBD來源于纖維素酶和木聚糖酶。
在本發(fā)明中，術語“纖維素結合結構域”與Tomme等人(出處同前)中的含義相同。其中將120種以上的纖維素結合結構域劃分為10個家族(Ⅰ-Ⅹ)，它們可能在底物結合機理方面具有不同的功能或作用。然而，在進行本發(fā)明的工作中，已發(fā)現(xiàn)了一種迄今為止尚無人知曉的CBD家族，參見下述的實施例8；估計在將來還會出現(xiàn)新的家族代表和其它CBD家族。
在蛋白質復合物(通常是水解酶)中，CBD位于N或C末端或位于內部。
CBD單體通常由約30個以上且約250個以下的氨基酸殘基組成。例如，歸類為家族Ⅰ的CBD由33-37個氨基酸殘基組成，歸類為家族Ⅱa的CBD由95-108個氨基酸殘基組成，歸類為家族Ⅵ的CBD由85-92個氨基酸殘基組成。因此，CBD單體的分子量通常約4kD-40kD，并且通常低于約35kD。
CBD可作為單一結構域多肽使用，或作為二聚體、三聚體或多聚體使用，或作為蛋白質雜合體的一部分使用。嵌合蛋白雜合體嵌合蛋白雜合體在現(xiàn)有技術中是已知的，參見例如WO 90/00609，WO 94/24158和WO 95/16782，其包含源于其他來源的纖維素結合結構域(CBD)，優(yōu)選是源于其他微生物來源的纖維素結合結構域(CBD)，而不是源于其中CBD以蛋白質整合部分存在的嵌合蛋白質。通常，嵌合蛋白雜合體是酶雜合體，即含有催化結構域和所述結合結構域。
嵌合蛋白質雜合體和酶雜合體可通過轉化一種DNA構建體至宿主細胞中并培養(yǎng)宿主細胞以表達融合基因而得以制備，其中所述DNA構建體包含編碼纖維素結合結構域(CBD)的至少一個DNA片段，該DNA片段通過或不通過接頭而與編碼所述蛋白質或酶的DNA序列相連接。重組融合蛋白或酶雜合體可用下式描述CBD-MR-X其中，CBD是對應于至少是纖維素結合結構域的氨基酸序列的N-末端或C-末端區(qū)；MR是中間區(qū)(接頭)，它可以是一個鍵、或優(yōu)選具有2至100個碳原子、更優(yōu)選具有2至40個碳原子的短連接基團，或者優(yōu)選是具有約2-100個氨基酸、更優(yōu)選具有2至40個氨基酸；X是由編碼該蛋白質或酶的DNA序列所編碼的多肽的N末端或C末端區(qū)。
然而，也包括具有內部CBD的重組融合蛋白或酶雜合體。
編碼源自給定生物體的CBD的DNA序列通?？刹捎肞CR技術獲得，并且，基于現(xiàn)有知識，也可以從其他生物體找到同源序列。
估計通過克隆纖維素酶、木聚糖酶或其他植物細胞壁降解酶并測量它們對纖維素的結合，可發(fā)現(xiàn)新的CBD。如果酶活性在以下所述的標準條件下與Avicel結合，那么可推定該基因的一部分編碼結合結構域。
獲得編碼CBD的DNA片段后，將該DNA基因插入于適合在芽孢桿菌內進行表達的載體中。
例如，纖維素親合性可采用在500ml緩沖的漿液(緩沖液0.1磷酸鈉，pH7.5)中的10g Avicel進行測量，所述漿液用一小勺緩慢攪拌并且在室溫下放30分鐘讓其溶脹。然后以1份纖維素結合結構域比150份Avicel的比例加入酶。在冰上進行操作，這樣在5至10分鐘內可達到最佳結合。然后可洗滌Avicel，并對其直接進行SDS-PAGE以觀察已結合的蛋白質(由于使用了SDS并進行了熱煮，這樣會將已結合的蛋白質釋放下來)。另一種方法是將漿液裝入柱內并洗滌。用離子化水或高pH緩沖液如三乙胺(pH11.2,1％溶液)洗脫已結合的蛋白質，經pH洗脫下來的蛋白質立即調節(jié)到中性。
在大腸桿菌中已表達了一些CBD。然而，尚無從芽孢桿菌中表達并分泌CBD的報道。大腸桿菌作為異源蛋白質的表達宿主相比于芽孢桿菌來說有一些優(yōu)點，主要是由于大腸桿菌有壁膜間隙，異源表達的基因產物有可能在其中進行正確折疊(綜述見例如Hockney,R.C.(1994))。特別是，當表達功能性依靠正確排列的雙硫橋時，就需要在外圍胞質中有氧化電位且存在二硫鍵氧化還原酶(Emmanuel Brun等，1995)。歐洲生化雜志，231,142-148，和Ong等(1993)中公開了Erwiniachrysanthemi分泌的內切葡聚糖酶EGZ的纖維素結合結構域的過量表達、純化和鑒定。有二硫鍵的CBD的其它例子有熒光假單胞菌纖維素亞種(NCIMB 10462)CelB的N-末端CBD[見Tomme P.等(出處同前)中的序列對比]，以及糞肥纖維單胞菌(ATCC 484)CenA的N末端CBD(N.R.Gilkes等，1991)。
此外，大腸桿菌的外圍胞質也起著保護異源表達的蛋白質免受上清以及胞漿中存在的蛋白酶的作用。
也已知，當在枯草芽孢桿菌中表達含有二硫橋的分泌蛋白時，表達水平顯著下降(Van den Berg等(1993))。
異源表達的另一個問題是已表達蛋白質的蛋白水解降解作用。已知枯草芽孢桿菌表達至少7種不同的胞外蛋白酶(A.L.Sonenshein等編(1993))。
特別是對于CBD這樣一種高度疏水的蛋白質，當在枯草芽孢桿菌中表達時，該蛋白質的運輸可能嚴重受阻，而若該蛋白質由于其疏水性而錨定于細胞膜上，將會因其有害效果而甚至引起細胞死亡。
在第一方面，本發(fā)明涉及轉化了包含編碼CBD之DNA序列的載體、并且能表達該序列的芽孢桿菌宿主。顯而易見，所表達的多肽基本上由一個或多個非催化性的結構域組成，即該多肽不包含任何催化活性結構域。
在一個優(yōu)選實施方案中，所表達的CBD或含CBD之多肽的分子量等于或高于約4kD。優(yōu)選地，其分子量等于或低于35kD，較優(yōu)選地約32kD，甚至更優(yōu)選地約30kD，尤其是約25kD。
可以單一結構域多肽(即包含一個CBD的多肽)的形式表達CBD?；蛘?，可以二聚體或三聚體甚或多聚體形式(即包含兩個、三個甚或三個以上相同CBD“單元”的多肽或蛋白質形式)表達CBD。
也可以作為多結構域多肽的一部分而表達CBD，這種多肽的非CBD部分可以是例如一個、兩個、甚或多個沒有催化活性的結構域。部分可以是例如一個、兩個、甚或多個沒有催化活性的結構域。
可以相信，按照本發(fā)明，即通過已轉化的芽孢桿菌宿主的途徑，幾乎可以表達任何一種CBD。優(yōu)選地，可表達的CBD是可得自微生物或植物的CBD，更優(yōu)選是可得自細菌或真菌的CBD。
來自細菌的CBD的實例包括可從下列各屬之一的種內得到的CBD丁酸弧菌屬、纖維單胞菌屬、梭菌屬、小雙孢菌屬、小單孢菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬、高溫單孢菌屬、芽孢桿菌屬、Caldocellum、歐文氏菌屬、粘球菌屬、纖維弧菌屬、熱厭氧桿菌屬和棲熱袍菌屬。
源自真菌的CBD的實例包括可從下列各屬之一的種內獲得的CBD蘑茹屬、網柄菌屬、鐮孢屬、腐質霉屬、Neocallimastix，脈孢菌屬，Limulus，青霉屬，Phanerochaete和木霉屬。
可得自植物的CBD的實例是來自蘋果青霉素的CBD。
本發(fā)明的芽孢桿菌宿主是嗜中性的、嗜堿性的、嗜中溫的或嗜熱的宿主。
本發(fā)明中有用的宿主的實例是來自枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的宿主。然而，估計其他芽孢桿菌種類也可以用作表達CBD的宿主。
如下詳述，用包含編碼CBD之DNA序列的載體轉化本發(fā)明的宿主。優(yōu)選地，所述載體整合到了宿主的基因組中，更優(yōu)選地，其在基因組中已得到了擴增。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，所述載體為表達質粒，優(yōu)選地為多挎貝質粒。
在第二方面，本發(fā)明涉及帶有插入的編碼CBD之DNA序列的一種芽孢桿菌表達載體。優(yōu)選地，該載體的表達盒包含來自芽孢桿菌的調控區(qū)，更優(yōu)選地，這類調控區(qū)是該宿主的內源區(qū)域。
在第三方面，本發(fā)明涉及生產CBD多肽的方法，該方法包括以下步驟--在營養(yǎng)培養(yǎng)基中，過量表達纖維素結合結構域的條件下，培養(yǎng)芽孢桿菌宿主細胞，所述細胞已用包含以下可操作性地連接在一起的諸成分a)轉錄和翻譯起始調控區(qū)，b)編碼纖維素結合結構域的DNA序列，c)轉錄和翻譯終止調控區(qū)，其中該調控區(qū)在宿主中是有功能的，和d)用于選擇已轉化的宿主的選擇標記基因；并且--回收纖維素結合結構域多肽。
在第四方面，本發(fā)明涉及優(yōu)化CBD在芽孢桿菌宿主中的表達的一種方法，該方法包括在宿主中表達與報道分子融合的CBD的諸步驟；以及通過測量報道分子的內在性質而監(jiān)測發(fā)酵宿主的上清中已表達的CBD的濃度。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述報道分子是綠色熒光蛋白，其內在性質是發(fā)射熒光。
在第五與第六方面，本發(fā)明涉及一種基本上由與綠色熒光蛋白融合的一個或多個纖維素結合結構域組成的多肽雜合體，以及通過在芽孢桿菌宿主中表達而生產這種雜合體的方法，所述方法包括在一定條件下培養(yǎng)已轉化的宿主，從而使已轉化的培養(yǎng)物基本上無未轉化的細胞；在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)已轉化的培養(yǎng)物以使所述雜合體過量產生；以及回收該雜合體。CBD的表達重組表達載體包含編碼本發(fā)明CBD的DNA構建體的重組載體可以是可方便用于重組DNA操作的任何載體，載體的選擇常常取決于其將被導入的宿主細胞。導入載體的宿主細胞通常是指已轉化的宿主細胞。這樣的轉化表示采用例如原生質體、天然的感受態(tài)細胞、轉染、接合、電穿孔或任何相當的方法將DNA導入宿主細胞。因此，載體可以是自主復制型載體，即作為染色體外實體存在的載體，其復制獨立于染色體的復制，例如質粒?；蛘?，載體可以是這樣一種載體，當將其導入宿主細胞時，能部分或全部整合到宿主細胞基因組中并隨其整合入的染色體一起復制。
載體優(yōu)選地是一種表達載體，其內編碼本發(fā)明CBD的DNA序列可操作地與該DNA轉錄所需的附加區(qū)段相連接。通常，表達載體是從質?；虿《綝NA衍生而來的，或者同時含有二者的元件。術語“可操作地連接”是指所述區(qū)段的排列方式使得它們能夠協(xié)調地發(fā)揮作用而達到預期目的，例如由啟動子起始轉錄并穿過編碼CBD的DNA序列進行下去。
該啟動子可以是在選定的宿主細胞中有轉錄活性的任何DNA序列，其可以衍生自編碼宿主細胞的同源或異源蛋白質的基因。
可用于細菌宿主細胞的合適的啟動子的實例包括嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽原淀粉酶基因的啟動子，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因的啟動子，枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶基因的啟動子，或短小芽孢桿菌木糖苷酶基因的啟動子，或者λ噬菌體PR或PL啟動子，或者大腸桿菌lac,trp或tac啟動子?；蛘?，可以設計整合載體，使得僅在其正確整合至宿主細胞基因組中(如旁側啟動子的下游)，方可有效地表達編碼CBD的DNA。
必要時，編碼本發(fā)明CBD的DNA序列也可以可操作性地連接一種合適的終止子。
本發(fā)明的重組載體還可包含可使所述載體在選用的宿主細胞中復制的DNA序列。
載體還可以包含一種選擇性標記，例如，其產物可彌補宿主細胞內一個缺陷的基因，或者，編碼對諸如卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、鏈霉素等抗生素的抗性或對重金屬或除草劑的抗性的基因。
為了將本發(fā)明的CBD引入宿主細胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供一種分泌信號序列(也已知為前導序列、前原序列或前序列)。該分泌信號序列是以正確的閱讀框架與編碼所述CBD的DNA序列連接在一起的。分泌信號序列通常位于編碼CBD的DNA序列的5′端。該分泌信號序列可以是通常與CBD有關的分泌信號序列，也可以來自編碼另一種分泌蛋白質的基因。
本領域熟知用來分別連接編碼本發(fā)明CBD的DNA序列、啟動子和任選的終止子和/或分泌信號序列或用來通過合適的PCR擴增方案組裝這些序列，并將它們插入含有復制或整合所需信息的合適載體中的方法(參見例如Sambrook等，出處同前)綠色熒光蛋白(GFP)已廣泛用作監(jiān)控基因表達的報道分子，細胞系的示蹤物以及蛋白質的融合標記(Crameri等(1996)；Cubitt等(1995)；國際專利申請PCT/DK96/00051)。
GFP可與CBD融合而產生具有纖維素結合性質以及發(fā)熒光性質的融合蛋白?？衫眠@一融合蛋白的表達來監(jiān)控CBD在芽孢桿菌各種中的表達情況，因此可用于優(yōu)化給定CBD的表達水平。
實施例材料與方法菌株Bacillus agaradherens NCIMB No.40482包含實施例8中的編碼內切葡聚糖酶的DNA序列。
大腸桿菌SJ2(Diderichsen,B.等(1990))利用Bio-Rad GenePu lserTM，按照生產商的推薦方法制備電感受態(tài)細胞和進行轉化。
枯草芽孢桿菌PL2306該菌株為枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen,B.等(1990))在已知的枯草芽孢桿菌纖維素酶基因的轉錄單位中發(fā)生破壞而產生的纖維素酶陰性細胞。此外，該菌株的aprE和nprE基因(aprE:Stahl和Ferrari(1984)；nprE:Yang等(1984))也已被破壞。這種破壞基本上按照Sonenshein等編(1993),P618中所述進行。
枯草芽孢桿菌PL2304。該菌株為枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen B.，出處同前)在已知的枯草芽孢桿菌纖維素酶基因的轉錄單位中發(fā)生破壞而產生的纖維素酶陰性細胞。這一破壞基本上按照A.L.Sonenshein(編)(出處同前)中所述進行。質粒pMB100，它是pDN1528(S.Jφrgensen等(1991))的衍生物。該質?；旧吓cpDN1528相同，只是為了進行克隆，前者在amyL基因的終止密碼子和終止子之間導入了一個SacⅠ位點。
pDN1981(P.L.Jφrgensen等(1990))溶液/培養(yǎng)基TY和LB瓊脂(如Ausubel,F.M.等(1995)所述)SB在無菌水中混合32g蛋白胨，20g酵母提取物，5g NaCl和5ml 1N NaOH至終體積為1升。該溶液在121℃下，高壓蒸氣滅菌20分鐘。
10％Avicel將100g Avicel(FLUKA，瑞士)與無菌水混合至終體積為1升。此10％Avicel在121℃下高壓蒸氣滅菌20分鐘。
Congo紅(SIGMA，美國)貯存液1％于離子化水中。
緩沖液0.1M磷酸鉀，pH7.5。普通分子生物學方法利用分子生物學標準方法(Sambrook等(1989)，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，NY；Ausubel F.M.等，1995；Harwood和Cutting,1990)進行DNA操作和轉化。
按照供應商的詳細說明使用DNA操作中的酶。實施例1-3基因組DNA的分離在TY中，于30℃,250rpm下培養(yǎng)糞肥纖維單胞菌24小時，通過離心收獲細胞。
60℃下，在國家工業(yè)和海洋細菌保藏有限公司(蘇格蘭)推薦的特殊培養(yǎng)基中厭氧地培養(yǎng)糞堆梭菌NCIMB 11754。通過離心收獲細胞。
30℃下，在TY瓊脂板上培養(yǎng)熒光假單胞菌纖維素亞種NCIMB1046224小時。刮下細胞用于分離基因組DNA。
按照Pitcher等(1989)中描述的方法分離上述提及的任一種的基因組DNA。鑒定糖基水解酶中存在的纖維素結合結構域根據其氨基酸序列，將纖維素結合結構域劃分為10個家族，見Tommel等(出處同前)?；谠摼C述文章的公開內容，選擇三種潛在不同的CBD序列作為旨在研究枯草芽孢桿菌中表達情況的模型從家族Ⅱa中選出糞肥纖維單胞菌(ATCC 484)纖維素酶CenA(GenBank和SWISS-PROT Accession No.M15823)的CBD和熒光假單胞菌(NCIMB 10462)CelB(GenBank和SWISS-PROT Accession No.X52615)的CBD。
從家族Ⅵ中選出糞堆梭菌(NCIMB 11754)XynA(GenBank和SWISS-PROT Accession No.13325)的CBD二聚體。
所得到的SWISS-PROT數據中描述了推定的纖維素結合結構域的位置，利用該信息來特異性地設計PCR引物以用于從這三種不同的細菌中得到編碼CBD的DNA片段。
同時，設計PCR引物使其添加上相應于amyL之信號序列的氨基酸的額外密碼子，該序列用于引導CBD至枯草芽孢桿菌細胞的外部。糞肥纖維單胞菌(ATCC 484)纖維素酶CenA的CBD的體外擴增在包含每種dNTP各200μM,1.5％DMSO(SIGMA，美國)，2.5單位的AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer,Cetus美國)和各100pmol的下述引物CELFIM01U,5′-CTG CCT CAT TCT GCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT GCT CCC GGCTGC CGC GTC GAC TAC -3′CELFIM01D,5′-CTG CCT CAT TGC ATG CAG AGC TCC TAC TAC ACG GTG CCC GTG CAGGTG GTG -3′劃線處為PstⅠ和SacⅠ限制性位點的PCR緩沖液(10mM Tris-HCl,pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.01％(w/v)明膠)中對大約100-200ng基因組DNA進行PCR擴增。
在DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國)進行PCR反應。先在94℃下保溫5分鐘，接著按下述循環(huán)方案進行PCR 30個循環(huán)94℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘以及72℃延伸1分鐘。通過在1.5％瓊脂糖凝膠(Nasieve,FMC)上進行電泳，并以ReadyLoad 100bp DNA梯度(GibcoBRL,Denmark)作為分子量標記，對10μl的擴增產物等分試樣進行分析。熒光假單胞菌(NCIMB 10462)CelB的CBD的體外擴增在添加了每種dNTP各200μM、2.6單位HiFidelityTMExpand酶混合物和各300pmol的下述引物PSUPPER,5′-CGT CCT CAT TCT GCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT GCA GCA GTGTGT GAA TAT CGG G-3′PSLOWER,5′-CTG CCT CAT TGC ATG CAG AGC TCC TAC TAT TGT CCA CCG CAA ATCGCC-3′劃線處為PstⅠ和SacⅠ限制性位點的HiFidelityTMPCR緩沖液(Boehringer Mannheim，德國)中對大約100-200ng基因組DNA進行PCR擴增。
在DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國)中進行PCR反應。首先是94℃下2分鐘，60℃下30秒和72℃下45秒溫育一個循環(huán)，接著按照下述循環(huán)方案進行PCR 10個循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火30秒和72℃延伸45秒，再按下述方案進行20個循環(huán)94℃下30秒，60℃下30秒和72℃下45秒(在此延伸步驟中每一循環(huán)均增加20秒)。通過在1.5％的瓊脂糖凝膠(Nusieve,FMC)上電泳，以ReadyLoad 100bp DNA梯度(GibcoBRL,Denmark)作為分子量標記，對10μl擴增產物等分試樣進行分析。糞堆梭菌(NCIMB 11754)XynA)的CBD二聚體的體外擴增在補充了每種dNTP各200μM,2.6單位的HiFidelityTMExpand酶混合物和各300pmol的下述引物CLOST03U,5′-CTG CCT CAT TCTGCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT CCA ACT CCTGCC CCA TCT CAA AGC-3′CLOST03D2,5′-CTG CCT CAT TGC ATG CAG AGC TCC TAC TAC CAG TCA ACA TTA ACAGGA CCT GAG-3′劃線處為PstⅠ和SacⅠ限制性位點的HiFidelityTMPCR緩沖液(Boehringer Mannbeim，德國)中對大約100-200ng基因組DNA進行PCR擴增。
在DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國)中進行PCR反應。首先是94℃下2分鐘，60℃30秒和72℃下45秒進行一次溫育，接著按下列循環(huán)方案進行10個PCR循環(huán)94℃變性30秒，60℃退火30秒和72℃延伸45秒，再按以下循環(huán)方案進行20個循環(huán)94℃下變性30秒，60℃下30秒，72℃下45秒(在此延伸步驟中每個循環(huán)均增加20秒)。通過在1.5％的瓊脂糖凝膠(NuSieve,FMC)上電泳，并以ReadyLoad 100bpDNA梯度(GibcoBRL,Denmark)作為分子量標記，對10μl擴增產物等分試樣進行分析。通過聚合酶鏈反應(PCR)進行克隆PCR片段的亞克隆用QIAquick PCR純化試劑盒(Qiagen,USA)，按照生產商說明純化上述產生的PCR產物40μl等分試樣。用50μl 10mM Tris-HCl,pH8.5洗脫已純化的DNA。用SacⅠ和PstⅠ消化25μl已純化的PCR片段，在1.5％低融點瓊脂糖(SeaPlaque GTG,FMC)凝膠上電泳，從膠上切下相關的片段，并用QIA quick凝膠抽提試劑盒(Qiagen，美國)按照生產商說明進行純化。然后將已分離的DNA片段連接到經PstⅠ、SacⅠ消化的pMB100上，用該連接混合物轉化枯草芽孢桿菌PL2306。陽性克隆的鑒別和鑒定細胞鋪于含有氯霉素(6μg/ml),0.4％葡萄糖和10mM磷酸氫鉀的LB瓊脂平板上，并在37℃下培養(yǎng)過夜。第二天，將菌落再劃線到新鮮的LBPG氯霉素瓊脂板上，并在37℃下培養(yǎng)過夜。一天后將每一克隆的單菌落轉移到含氯霉素(6μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基中，于37℃以250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
用QIAgen質粒純化小試劑盒(Qiagen，美國)，按照生產商說明，從液體培養(yǎng)物中提取質粒，與說明書不同的是，在于37℃裂解細胞15分鐘前，在重懸緩沖液中補充了1mg/ml的雞蛋白溶菌酶(SIGMA，美國)。用PstⅠ和SacⅠ消化5μl質粒樣品。消化產物經1.5％瓊脂糖凝膠(NuSieve,FMC)電泳進行檢測。出現(xiàn)一個大小與PCR擴增產物相同的DNA片段表明為陽性克隆。選出三個克隆，它們分別代表上述提及的來自三種不同細菌的CBD:MB144(表達糞肥纖維單胞菌CenA-CBD)、MB203(表達糞堆梭菌XynA二聚體CBD)和MB207(表達熒光纖維單胞菌纖維素亞種CelB-CBD)。已克隆DNA片段的核苷酸測序使用以上用過的同樣引物和Taq雙脫氧末端循環(huán)測序試劑盒(Perkin Elmer,USA)，采用Applied Biosystems 373A自動測序儀，按照生產商說明，對經Qiagen純化的質粒DNA進行測序?？寺BD的表達、分泌和功能分析克隆MB144(表達糞肥纖維單胞菌CenA-CBD),MB203(表達糞堆梭菌XynA二聚體CBD)和MB207(表達熒光假單胞菌纖維素亞種CelB-CBD)均在SB培養(yǎng)基中于37℃,250rpm培養(yǎng)20小時。將1ml無細胞的上清液與200μl 10％Avicel混合。將該混合物置于0℃1小時。在CBD和Avicel結合后，將有CBD的Avicel于5000g離心5分鐘。將沉淀物重懸浮于100μl SDS-PAGE緩沖液中，在95℃煮5分鐘，以5000g離心5分鐘，再取25μl上樣到18％Laemmli Tris-甘氨酸，SDS-PAGENOVEX凝膠(Novex，美國)上。按照生產商推薦的方法在XcellTM微槽(NOVEX，美國)中電泳，按照生產商所述進行凝膠的所有后續(xù)操作，包括用考馬斯染色、脫色和干燥。
出現(xiàn)預期大小的蛋白質條帶(MB144蛋白質條帶大約是12kDa,MB203蛋白質條帶約是35kDa,MB207蛋白質條帶約是12kDa)表明在枯草芽孢桿菌中表達了有功能性的CBD。實施例4由糞堆梭菌克隆的CBD二聚體的表達和純化用分離自MB203的質粒轉化另一種枯草芽孢桿菌TOC46，這樣獲得了一種表達CBD二聚體的新克隆MB206。用這株菌作為CBD二聚體的表達宿主，在含有SB培養(yǎng)基(氯霉素6μg/ml)的搖瓶中于37℃并以250rpm振搖培養(yǎng)該克隆20小時。
在冰浴上冷卻1400ml的培養(yǎng)液上清。用Whatman玻璃過濾器F過濾，再通過0.45微米的Millipore HVLP型濾器過濾除菌。
在室溫下，將50g Avicel懸浮在0.1M磷酸鈉緩沖液，pH7.5中30分鐘。去除上清并將Avicel懸浮液冷卻至4℃。將清亮上清與Avicel懸浮液在4℃混合30分鐘。
使Avicel靜置10分鐘，然后除去上清。將Avicel蛋白質復合物裝入柱中并用0.1M磷酸鈉緩沖液洗滌，接著用含有0.5M氯化鈉的緩沖液洗。最后，用去離子水洗脫CBD。
含有CBD的洗脫液總體積為78ml。加入固體氯化鈉至終濃度為0.5M后，在有攔截8kD分子的R8lP膜的Amicon槽中濃縮CBD。
已濃縮的CBD溶液(30ml)在280nm的吸收值為1.2。MB206的克分子消光系數為42000，對應于蛋白質濃度為0.82，這樣可得出高度純化的雙CBD的總量為25mg。根據SDS-PAGE，起始材料每毫升有0.1mg的29kD蛋白質。最終的純化產物在SDS-PAGE上僅顯示一條帶。實施例5在枯草芽孢桿菌中克隆和表達的二聚化真菌CBD的鑒定通過融合由Humicola insolens EGII的DNA序列編碼的CBD與由源于Humicola insolens的所述43kDa的DNA序列所編碼的CBD而構建出一種真菌起源的CBD二聚體。
利用特異于CBD區(qū)的引物，從攜有EGⅡ(又稱為CMC3)(Dalbφge和Heldt Hansen,1994)的cDNA的質粒中PCR擴增出編碼Humicolainsolens EGⅡCBD和接頭的DNA序列，此外，將反義引物設計成使所得PCR片段具有與編碼前一CBD的DNA片段相同的突出，所述CBD由詳述于EP-B-0531372和US5457046中的H.insolens之43kDa內切葡聚糖酶基因所編碼。從EP-B-0531372中所述的Humicolainsulens的基因組DNA中PCR擴增編碼此CBD的DNA。
用下述引物#228575′-CTG CCT CAT TCT GCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT CAG GGC GGTGCA TGG CAG CAG-3′#206225′-CTG CCT CAT TGC ATG CAG AGC TCC TAC TAC AGG CAC TGA TGG TACCAG TC-3′通過SOE-PCR(Higuchi等(1988))將所述兩片段組合起來。
將此PCR片段作為PstⅠ-SacⅠ片段連接至pMB100中，用連接混合物轉化枯草芽孢桿菌PL2306。
主要編碼CBD二聚體的克隆DNA可在序列CBD-EGⅡ-CZ(327bp):GCAAATCTTA ATCAGGGCGG TGCATGGCAG CAGTGTGGTG GCGTTGGCTTCTCGGGCTCT ACGTCCTGTG TGTCCGGTTA CACGTGCGTG TACTTGAACG ACTGGTA-CAG CCAATGCCAG CCGCAGCCGA CGACGTTACG GACAACAACA ACGCCAGGGGCAACATCGAC AACAAGGTCA GCCCCGGCTG CCACTTCAAC CACTCCGGCCGGCTGCACTG CTGAGAGGTG GGCTCAGTGC GGCGGCAATG GCTGGAGCGG CTGCAC-CACC TGCGTCGCTG GCAGCACTTG CACGAAGATTAATGACTGGT ACCATCAGTG CCTGTAG和相應的氨基酸序列(108個氨基酸殘基)ANLNQGGAWQ QCGGVGFSGS TSCVSGYTCV YLNDWYSQCQ PQPTTLRTTTTPGATSTTRS APAATSTTPA GCTAERWAQC GGNGWSGCTT CVAGSTCTKI NDWYHQCL中找到。
如上所述進行CBD的表達、分泌和功能性分析。實施例6構建GFP-CBD融合體以用于優(yōu)化CBD的表達在含有每種dNTP各200μM,1.5％DMSO(SIGMA,USA),2.5單位的AmpliTaq聚合酶(Perkin-Elmer,Cetus，美國)和各100pmol下述引物C-融合體1:5′-GTC AGT GAA TTC GCA TGC GTC CTT CTT TGT GCT TG-3′C-融合體2:5′-CTC ATA AAG CTT ACG GTG CCC GTG CAG GTG GTG-3′下劃線處為EcoRⅠ和HindⅢ限制性位點的PCR緩沖液(10mM Tris-HCl,pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2,0.01％(w/v)明膠)中，PCR擴增按上述方法分離的100ng質粒DNApMB144。
在DNA熱循環(huán)儀(Landgraf，德國)中進行PCR反應。首先在94℃溫育5分鐘，接著按下述循環(huán)方案進行三十個循環(huán)的PCR:94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘和72℃延伸1分鐘。通過在0.7％的瓊脂糖凝膠(NuSieve,FMC)中電泳，并以Readload 100bp DNA梯度(GibcoBRL,Denmark)作為分子量標記，對10μl擴增產物等分試樣進行分析。
對該片段進行純化、EcoRⅠ和HindⅢ消化以及凝膠純化，并連接至載體pBR322(Bolivar等(1977)，基因，2,95-113)中。
用連接混合物轉化SJ2電感受態(tài)大腸桿菌。陽性克隆的鑒定和表征將轉化細胞平鋪于含有氨芐青霉素(200μg/ml)的LB瓊脂平板上并在37℃下培養(yǎng)過夜。一天后將菌落重新劃線至新鮮的LB-氨芐青霉素瓊脂平板上，在37℃下培養(yǎng)過夜。第二天將每個克隆的單菌落轉移至含有氨芐青霉素(200μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃下以250rpm振搖培養(yǎng)過夜。
用QIAgen質粒純化小型試劑盒(Qiagen，美國)，按照生產商說明從液體培養(yǎng)物中提取質粒。用HindⅢ和EcoRⅠ消化5μl質粒樣品。通過在0.7％瓊脂糖凝膠(NuSieve,FMC)上凝膠電泳而檢測消化產物。
從按照國際專利申請PCT/DK96/00051中所述構建的突變體F64L-S65T-GFP的DNA構建物中克隆獲得GFP的衍生物。
將編碼此F64L-S65T-GFP的DNA片斷作為BamHⅠ-HindⅢ片斷，與已克隆至pBR322中的CBD編碼DNA讀框一致地克隆?；旧习瓷鲜龇椒ㄟM行連接、轉化和陽性克隆的鑒定。
將此融合構建物以EcoRⅠ-BamHⅠ片段形成從大腸桿菌載體中轉換至pUB110載體(Gryczan等(1978))中。轉化枯草芽孢桿菌PL2306，通過其發(fā)光能力以及可結合Avicel的F64L-S657-GFB CBD融合多肽的存在來鑒定陽性克隆。
用于激發(fā)本研究中F64L-S65T-GFP的光波長為488nm，其激活F64L-S65T-GFP，從而發(fā)出510-530nm的光。
通過熒光分光術測量上清中的熒光，并與同AVicel共溫育后的上清的熒光進行比較。此外，通過使融合蛋白結合至AVicel，去除多余的上清，并將Avicel移至比色杯中用于在熒光分光光度計中檢測熒光，即可以肉眼觀察到帶有CBD的發(fā)光分子。
通過制備結合于或未結合于Avicel的融合蛋白的系列稀釋度，可以確定表達水平，這樣就可以鑒定出以相對較高水平表達CBD的芽孢桿菌克隆。實施例7用CMC-CongoRed篩選可通過CBD表達水平的分析篩選出能表達CBD的重組芽孢桿菌克隆。
為了找到表達給定CBD的最佳芽孢桿菌菌株，在合適培養(yǎng)基(例如上述的TY)中，適當的生長條件下培養(yǎng)目的克隆24小時。將諸克隆的上清轉移至挖有孔洞的瓊脂糖-CMC-CongoRed平板上，使具有CBD的上清與CMC在37℃下結合5小時。當用2％NaCl溶液洗15分鐘時，即可看到作為一個清晰區(qū)域的CBD活性。
平板分析可按以下方法進行。
用于CBD平板分析的凝膠的制備用96％乙醇潤濕CMC(CMC羧甲基纖維素，7LF，來自Hercules)和瓊脂糖(Litex HSA/HSB)而制備0.5％CMC和0.7％瓊脂糖。加入0.1M磷酸鉀pH7.5緩沖液，加熱混合物至100℃直至完全溶解。將溶液冷卻至60℃。加入Congo Red貯存液至終濃度5％，倒平板，每個直徑9cm的Petri平皿中倒入15ml。
用打孔器制作裝樣品的孔。實施例8定義一種新CBD家族的新CBD的鑒定通過在SB培養(yǎng)基中，于37℃下，250rpm振搖培養(yǎng)克隆20小時，從而表達下述的克隆于枯草芽孢桿菌中的堿性纖維素酶。由于其具有與Avicel特異性結合的能力，顯示所表達的纖維素酶含有CBD。
當繼續(xù)培養(yǎng)20小時時，該纖維素酶發(fā)生蛋白水解性切割，在SDS-PAGE上可看到兩條特異的蛋白質條帶，其中一條相當于纖維素酶催化部分，其分子量(MW)為大約35kD，另一條相當于預計的接頭和CBD，分子量約8kD。
已發(fā)現(xiàn)該CBD位于該纖維素酶的C-末端部分，并且該CBD與以前描述的任何CBD家族都不相符(Tomme等，1995，第142-161頁)。據此，這個CBD是一個新家族的首位成員。從Bacillus agaradherens克隆堿性纖維素酶并在枯草芽孢桿菌中表達堿性內切葡聚糖酶通過PCR克隆編碼Bacillus agaradherers(保藏號NCIMB 40482)堿性纖維素酶的核苷酸序列，以用于插入到表達質粒pDN1981中。
基本上如上述對500ng基因組DNA進行PCR，其中使用含NdeⅠ和KpnⅠ限制位點的下述兩個引物引物5:(#20887)5′-GTA GGC TCA GTC ATA TGT TAC ACA TTG AAA GGG GAG GAG AAT CATGAA AAA GAT AAC TAC TAT TTT TGT CG-3′引物6:(#21318)5′-GTA CCT CGC GGG TAC CAA GCG GCC GCT TAA TTG AGT GGT TCC CACGGA CCG-3′所述NdeⅠ和KpnⅠ位點用于將編碼內切葡聚糖酶的DNA序列導入pDN1981中以便進行表達。
在PCR后，用QIAquick PCR柱試劑盒(Qiagen，美國)按照生產商說明純化PCR片斷。將純化的DNA在50μl 10mM Tris-HCl pH8.5中洗脫。經NdeⅠ和KpnⅠ消化，進行純化，再連接至已消化的pDN1981中。用連接混合物轉化枯草芽孢桿菌PL2304。制備感受態(tài)細胞并按照Yasbin等(1975)所述進行轉化。枯草芽孢桿菌轉化體的分離和檢測將已轉化細胞平鋪于含有10mg/ml卡那霉素，0.4％葡萄糖，10mMKH2PO4和0.1％AZCL HE纖維素(Megazyme，澳大利亞)的LB瓊脂平板上，在37℃下培養(yǎng)18小時。周圍有藍暈的克隆被鑒定為內切葡聚糖酶陽性克隆。
將每一陽性轉化體接種在10ml含有10mg/ml卡那霉素的TY培養(yǎng)基中。經37℃、250rpm培養(yǎng)一天后，取出50ml上清。通過將50ml上清加到在含有0.1％AZCL HE-纖維素的LB瓊脂平板上所挖的孔中而鑒定內切葡聚糖酶活性。
在37℃下培養(yǎng)16小時后，周圍有藍暈的孔表示枯草芽孢桿菌中有內切葡聚糖酶的表達。實施例9選擇CBD的方法制備磷酸溶脹的纖維素(PASC)用水濕潤5g Avicel，加入到150ml冰冷的85％磷酸中，在冰浴中輕微地攪拌1小時。然后邊攪拌邊加入500ml冷丙酮。用玻璃過濾漏斗過濾已溶脹的Avicel(PASC)，并用100ml冰冷的丙酮洗3次，隨后用500ml水洗兩次。然后將PASC懸浮在500ml水中，并用UltraThorax勻漿器混合均勻。將PASC冷藏。CBD與磷酸溶脹的纖維素(PASC)的結合一-CBD的選擇將Eppendorf管中溶解于50mM磷酸鈉pH7的400ml 10mg/mlPASC(按照上述制備，并經50mM磷酸鈉pH清洗)與稀釋于50mM磷酸鈉，pH7中的400ml纖維素結合結構域(Cel5A CBD或MB206雙CBD)混合。改變CBD的濃度，例如，從0mM至約8mM的Cel5A CBD。設計一個沒有PASC的對照組。將樣品在室溫下溫育1小時，然后在14000g離心4分鐘。將500μl上清稀釋成2ml水。在Perkin-Elmer LS50分光光度計(激發(fā)光為280nm，發(fā)射光為340nm)中，通過色氨酸熒光光度術測定上清中存在的CBD(游離CBD)量，其中使用不加入PASC的樣品的熒光密度作為參照(標準曲線)。然后可按照總CBD(未加PASC)-游離CBD計算出已結合的CBD量。這樣，將每克PASC結合CBD的量作為溶液中游離CBD(以mM表示)的函數作圖，即可得到結合等溫線見

圖1和圖2。數據可用簡單的Langmuir結合模式(Bothwell等，(1995)進行調整E(結合)=(A最大值×E(游離)/(Kd+E(游離))，其中E(結合)是以mmol/gPASC表示的已結合的CBD量，E(游離)是以mM表示的游離CBD量，A最大值是可與PASC結合的CBD的最大量，Kd是平衡E(結合)《E(游離)的平衡常數。這樣，Kd(解離常數)越低，結合就越強。將數據用GraphPad Prizm中的算法調整成該模式，即可獲得這些常數。Cel5ACBD和MB206雙CBD的解離常數分別是0.42和0.76mM(參見圖1和圖2)。
本發(fā)明CBD的解離常數低于1mM，更優(yōu)選為低于0.1mM，最優(yōu)選為低于10mM。
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1．一種芽孢桿菌宿主，其轉化了包含編碼纖維素結合結構域(CBD)的DNA序列的載體并能表達該序列，所表達的多肽基本上由一個或多個非催化性結構域組成。
2．根據權利要求1的宿主，其中所述DNA序列是另一種來源而非芽孢桿菌。
3．根據權利要求1或2的宿主，其能以單一多肽結構域形式表達該纖維素結合結構域。
4．根據權利要求1至3中任一項的宿主，其中所述纖維素結合結構域的分子量為4kD-35kD。
5．根據權利要求4的宿主，其中所述纖維素結合結構域的分子量不高于30kD，優(yōu)選不高于28kD，更優(yōu)選不高于25kD。
6．根據權利要求1-5中任一項的宿主，其中所述載體包含編碼單一纖維素結合結構域的DNA序列。
7．根據權利要求1-5中任一項的宿主，其中所述載體包含編碼二聚體或三聚體纖維素結合結構域的DNA序列。
8．根據權利要求1-5中任一項的宿主，其中所述載體包含編碼連有至少一個其他非催化活性結構域的纖維素結合結構域的DNA序列。
9．根據權利要求1-8中任一項的宿主，其中所述纖維素結合結構域可得自微生物或植物，優(yōu)選得自細菌或真菌。
10．根據權利要求9的宿主，其中所述細菌選自由以下各屬組成的組丁酸弧菌屬、纖維單胞菌屬、梭菌屬、小雙孢菌屬、小單孢菌屬、假單胞菌屬、鏈霉菌屬、高溫單孢菌屬、芽孢桿菌屬、Caldocellum、歐文氏菌屬、粘球菌屬、纖維弧菌屬、熱厭氧桿菌屬和棲熱袍菌屬。
11．根據權利要求9的宿主，其中所述真菌選自由以下各屬組成的組蘑茹屬、網柄菌屬、鐮孢屬、腐質霉屬、Neocallimastix，脈孢菌屬，Limulus，青霉屬，Phanerochaete和木霉屬。
12．根據權利要求1-11中任一項的芽孢桿菌宿主，其為嗜中性的、嗜堿性的、嗜溫性的或嗜熱性的。
13．根據權利要求12的芽孢桿菌宿主，其選自由下列各種組成的組枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。
14．根據權利要求1-13中任一項的宿主，其中所述載體整合至未轉化宿主的基因組中。
15．根據權利要求1-14中任一項的宿主，其中所述載體以表達質粒形式存在。
16．根據權利要求1-15中任一項的宿主，其中所述載體已在基因組內發(fā)生了擴增，或者所述表達質粒為多拷貝質粒。
17．一種芽孢桿菌表達載體，其攜有插入的編碼纖維素結合結構域的DNA序列。
18．根據權利要求17的載體，其內表達盒包含源自芽孢桿菌的調控區(qū)。
19．根據權利要求18的載體，其中所述芽孢桿菌調控區(qū)對該宿主是內源的。
20．在芽孢桿菌宿主細胞中生產纖維素結合結構域多肽的方法，該方法包括以下步驟--在營養(yǎng)培養(yǎng)基中，過量生產纖維素結合結構域的條件下培養(yǎng)芽孢桿菌宿主細胞，所述宿主細胞已轉化了包含可操作性地連接在一起的下述元件的表達盒a)轉錄和翻譯起始調控區(qū)，b)編碼纖維素結合結構域多肽的DNA序列，c)轉錄和翻譯終止調控區(qū)，其中所述調控區(qū)在該宿主中是有功能的，和d)用于選擇已轉化的宿主的選擇性標記基因；和--回收纖維素結合結構域多肽。
21．根據權利要求20的方法，其中生產的纖維素結合結構域多肽的分子量為4kD-35kD。
22．一種優(yōu)化芽孢桿菌宿主中CBD表達的方法，該方法包括以下步驟a．在宿主中表達融合于報道分子的CBD，b．通過測定報道分子的內在性質，鑒測已發(fā)酵宿主的上清中已表達CBD的濃度。
23．根據權利要求22的方法，其中所述報道分子是綠色熒光蛋白，所述內在性質為發(fā)射熒光。
24．基本上由與綠色熒光蛋白融合的一個或多個纖維素結合結構域組成的多肽雜合體。
25．生產權利要求24的雜合體的方法，其中所述雜合體是在芽孢桿菌宿主中表達的，即在一定條件下培養(yǎng)已轉化的宿主，從而使轉化培養(yǎng)物中基本上無未轉化細胞；將已轉化的培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)培養(yǎng)基中，從而使所述雜合體得到過量表達；并且回收該雜合體。
全文摘要
轉化了包含編碼纖維素結合結構域(CBD)之DNA序列的載體的芽胞桿菌宿主。該宿主能表達所述序列,所表達的多肽蛋白質基本上由一個或多個非催化性結構域組成;纖維素結合結構域的分子量為4kD—35kD,并且得自于微生物或植物,優(yōu)選地來自細菌或真菌;芽孢桿菌宿主例如可以是以下諸種之一:枯草芽孢桿菌,地衣芽孢桿菌,巨大芽孢桿菌,嗜熱脂肪芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌;攜有編碼纖維素結合結構域的DNA序列的芽孢桿菌表達載體;一種在芽孢桿菌宿主細胞中生產纖維素結合結構域多肽的方法。
文檔編號C12N15/09GK1235635SQ9719919
公開日1999年11月17日 申請日期1997年10月28日 優(yōu)先權日1996年10月28日
發(fā)明者M·E·布蘭瓦德, M·舒賴恩, P·L·喬根森 申請人:諾沃挪第克公司