專利名稱：隔孢伏革菌植酸酶的制作方法
發(fā)明的領域本發(fā)明涉及表現有植酸酶活性的分離的多肽、相應的克隆的DNA序列、制備該多肽的方法，及其在許多工業(yè)用途中，特別是在動物飼料中的應用。
發(fā)明的背景植酸或1,2,3,4,5,6-六磷酸二氫肌醇(或簡稱六磷酸肌醇)是植物種子中肌醇的主要來源和磷酸鹽的主要儲存形式。事實上，它是在種子和谷粒成熟期間天然形成的。在豆莢的種子中，其總計占磷酸鹽含量的大約70％，并且在結構上是作為植酸鈣鎂，即肌醇的混合的鉀、鎂和鈣鹽與蛋白體整合的。種子、谷粒和豆莢是食物和飼料制品，特別是動物飼料制品的重要成分。而且在人類食物中，谷物和豆類莢果變得越來越重要。
植酸的磷酸鹽部分與二價和三價陽離子，如金屬離子，特別是營養(yǎng)上必需的鈣、鐵、鋅和鎂以及微量礦質元素錳、銅和鉬離子螯合。
此外，植酸還在一定程度上借助靜電相互作用與蛋白質結合。在pH低于蛋白質的等電點pI時，帶正電荷的蛋白質直接與植酸鹽結合。在pH高于pI時，帶負電荷的蛋白質通過金屬離子與植酸鹽結合。
植酸和其鹽，即植酸鹽因為不能在胃腸系統(tǒng)中吸收，所以常常不被代謝，即其三價磷、螯合的金屬離子，以及所結合的蛋白質均不能是營養(yǎng)上可利用的?？墒?，鑒于磷是所有生物體生長的必要元素，所以食物和飼料制品中必需添加無機磷酸鹽。另外還常常要添加鐵和鈣等營養(yǎng)上必不可少的離子。再者，由于食物中的蛋白質被植酸結合，所以也導致其營養(yǎng)價值降低。因此，常常將植酸稱為抗營養(yǎng)因子。
還有，由于植酸不被代謝，使植酸磷通過動物胃腸道亦隨糞便一起排泄，從而導致環(huán)境中的過度磷酸鹽污染，例如使水環(huán)境富營養(yǎng)化和水藻的廣泛生長。
除特別指出者外，術語植酸或植酸鹽在本說明書中作為同義詞或者隨意地使用，都是可被植酸酶降解的。
在含有植酸的大多數植物種子中，也發(fā)現有內源性植酸酶。這些酶是在種子發(fā)芽期間形成的，并適用于釋放磷酸鹽和在植物生長期間作為終產物使用的游離肌醇的目的。
當被消化后，食物或飼料成分植酸鹽在理論上可被種子的內源性植物植酸酶、來源于消化道微生物菌群的植酸酶以及腸粘膜植酸酶水解。但在實際上，內源性植物植酸酶和腸粘膜植酸酶的水解能力，即使有也遠不是以明顯地增加植酸鹽的結合或組成成分的生物可利用性。如果在制備食品或飼料的工藝中包括萌發(fā)、發(fā)酵或浸漬過程，則內源性植酸酶可在較大程度上降解植酸鹽。
在馬和牛等反芻或多胃動物體內，胃腸道系統(tǒng)中寄生有能夠降解植酸的微生物。但人、家禽和豬等單胃動物則不是這樣。因此，就這些單胃動物來說上述問題就顯得特別重要。
已報導了植物及微生物可產生植酸酶。在微生物中，產生植酸酶的細菌及產生植酸酶的真菌都是已知的。
在植物界，麥麩植酸酶是已知的(Thomlinson等人，生物化學，1(1962),166-171)。Barrientos等人(植物生理學，106(1994),1489-1495)已描述了源自百合花花粉的堿性植酸酶。
就細菌來說，已描述了衍生于枯草芽孢桿菌(Paver和Jagannathan,1982，細菌學雜志151:1102-1108)和假單胞菌屬(Cosgrove,1970，澳大利亞生物科學雜志23:1207-1220)的植酸酶。另外，Greiner等人(生物化學與生物物理文獻，303,107-113,1993)已純化并定性了大腸桿菌的植酸酶。但這種酶可能是酸性磷酸酶。
也描述了產生植酸酶的酵母，例如釀酒酵母(Nayini等人，1984,Lebensmittel Wissenschaft und Technologie17:24-26)。但這種酶可能是肌醇一磷酸酶(Wodzinski等人，應用微生物學進展(Adv.Appl.Microbiol.),42:263-303)。AU-A-24840/95描述了許旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)植酸酶的克隆和表達。
有幾篇報導描述了產生植酸酶的絲狀真菌，但只是屬于真菌的子囊菌門(子囊菌)。具體地說，有幾篇參考文獻涉及曲霉屬如土曲霉的產生植酸酶的子囊菌(Yamada等人，1996，農業(yè)生物化學322:1275-1282)。另外還描述了黑曲霉awamori變種中植酸酶基因的克隆和表達(Piddington等人，1993，基因133:55-62)。EP0420358描述了得自無花果曲霉(黑曲霉)的植酸酶的克隆和表達。EP0684313描述了子囊菌嗜熱毀絲霉(Myceliophthora thermophila)和土曲霉(A.ferreus)的植酸酶的克隆和表達。植酸酶的命名和位置特異性在本文中，植酸酶是指催化植酸(六磷酸肌醇)水解成(1)肌醇和/或(2)其一、二、三、四和/或五磷酸鹽，及(3)無機磷酸鹽的酶。下文中，有時將上述化合物分別簡稱為IP6、I、IP1、IP2、IP3、IP4、IP5和P。這意味著通過植酸酶的作用IP6被降解成P+一種或多種成分IP5、IP4、IP3、IP2、IP1和I?；蛘?，攜帶總共n個連接到位置p、q、r,……上的磷酸基團的肌醇被表示為Ins(p、q、r,…)Pn。為方便起見，將Ins(1、2、3、4、5、6)P6(植酸)縮寫為PA。
根據酶命名數據庫ExPASy(相對于原先基于國際生物化學與分子生物學聯合會(IUBMB)的命名委員會所推薦的酶命名給出的信息庫，命名中提供了每種類型已鑒定的酶的EC(酶委員會)編號)，已知有兩種不同類型的植酸酶所謂的3-植酸酶(六磷酸肌醇3-磷酸水解酶，EC3.1.3.8)和所謂的6-植酸酶(六磷酸肌醇6-磷酸水解酶，EC3.1.3.26)。3-植酸酶首先水解3位上的酯鍵，而6-植酸酶則首先水解6位上的酯鍵。磷酸肌醇命名考慮到作用于植酸的植酸酶的初級水解產物，所得到的酯有些是非對映體，有些則是對映體。一般說來，很容易區(qū)別不同的非對映體，因為它們具有不同的物理性質；而對映體則彼此是呈鏡像結構的，所以很難辨別。
因此，Ins(1,2,4,5,6)P5(除去了3-磷酸)和Ins(1,2,3,4,5)P5(除去了6-磷酸)是非對映體并且易于分辨，而Ins(1,2,4,5,6)P5(除去了3-磷酸)和Ins(2,3,4,5,6)P5(除去了1-磷酸)則是對映體。Ins(1,2,3,4,5,)P5(除去了6-磷酸)和Ins(1,2,3,4,5)P5(除去了4-磷酸)同樣是這種情況。因此，從植酸酶催化的水解植酸的第一步得到的6種五磷酸酯中，只能容易地分辨其中已除去了2-、3-、5和6-磷酸的酯，即只得到四種非對映體，其余兩種酯中每個都是這些化合物之一的對映體(如1-和3-一樣，4-和6-也是對映體)。最低位標規(guī)則的使用應提到的是，當使用代號Ins(2,3,4,5,6)P5和Ins(1,2,3,4,5,6)P5時，已放寬了以前推薦的肌醇原子編號。對最低位標規(guī)則的放寬是由國際生物化學聯合會的命名委員會推薦的(生物化學雜志(1989)258,1-2)，當時作者希望闡明結構關系。
在最低位標規(guī)則中，推薦L-和D-命名磷酸肌醇，即肌醇的磷酸酯，一般定名為1D(或IL-)Ins(r,s,t,u,w,x)Pn,n代表磷酸基團數，位標r、s、t、u、w和x則代表它們的位置。按照上文提到的國際生物化學聯合會命名委員會(NC-IUB)的規(guī)定對各位置編號，使用1D和1L以便使取代基有可能的最低位標或編號(“最低位標規(guī)則”)。植酸酶特異性如上所說，按照植酸酶在初始水解步驟中的特異性，即按照其首先水解的磷酸酯基因來劃分之。
關于已知植酸酶的特異性，一般植物植酸酶被說成是6-植酸酶，但百合花粉植酸酶一般被說成是5-植酸酶。微生物衍生的植酸酶主要是3-植酸酶。例如，上文提到的ExPASy數據庫中把3-植酸酶看作是煙草泡盛曲霉(菌株ALK0243)和黑曲霉(菌株NRRL3135)的四種植酸酶(基因133:55-62(1993)和基因127:87-94(1993))。
在使用D-/L-符號的情況下(其中D-和L-構型是指1位)，麥麩植酸酶首先水解L-6位(=D-4)上的磷酸酯基團，而3-植酸酶則首先水解D-3位(=L-1)上的磷酸酯基團。
可按幾種方法檢查特異性，例如用HPLC或NMR光譜法。然而，這些方法并不能直接辨別D-6和L-6位上的例如磷酸酯基團的水解，因為水解產物D-Ins(1,2,3,4,5)P5和L-Ins(1,2,3,4,5)P5是對映體(鏡像)，并因而具有相同的NMR光譜。
換句話說，本文中6-植酸酶是指L-6-或D-6-植酸酶或兩者，即植酸酶是L-6-植酸酶、D-6-植酸酶或((D-6-)+(L6-))-植酸酶(有兩者的活性)。其中字母有時也指定為D/L-6-植酸酶。
發(fā)明的概要本發(fā)明的目的是提供可代用的植酸酶，特別是具有較高的熱穩(wěn)定性或更快地從植酸中釋放磷酸等優(yōu)良性質，并可商品化生產的植酸酶。
本發(fā)明人已驚奇地發(fā)現，可從Stereales目，特別是隔孢伏革菌科，較好是隔孢伏革菌屬的菌株，尤其是從菌株Peniophora lycii得到表現有植酸酶活性的酶，并已成功地克隆了編碼所說的酶的DNA序列。序列表的SEQ ID No.1和2中分別列出了該DNA序列和推測的氨基酸序列。
如下文的實驗部分中進一步概述的，已驚奇地發(fā)現這種新的植酸酶，特別是與已知的植酸酶(黑曲霉植酸酶，植酸酶Novo)相比，顯著地加快了從植酸中初始釋放三價磷的速度。這一點已在一個于pH3.5和pH5.5進行的相關玉米試驗中及NMR研究中顯示出來。
再者，已發(fā)現本發(fā)明的植酸酶具有明顯不同的降解過程分布圖。在pH3.5時它屬于一類新的，對植酸的6-及3-位都表現有高初始親和性的植酸酶，換句話說，其既不是3-植酸酶，也不是6-植酸酶，而是比迄今報導的任何已知植酸酶都有較小位置特異性的植酸酶。但在pH5.5時，它應被分類為6-植酸酶。
Peniophora lycii植酸酶的比活性處于很高的水平，即超過200，較好在400以上，特別是在600以上，更具體是在800以上，最好是大約100FYT/mg(參見實施例4a)。至少對于真菌植酸酶來說，這一點是出乎預料的(已知曲霉植酸酶的比活性只為大約180FYT/mg)。
Stereales目屬于層擔子菌的真菌綱和擔子菌的真菌門。已知的產生植酸酶的真菌屬于子囊菌門。
第一個方面，本發(fā)明涉及具有植酸酶活性的和具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或其氨基酸序號31至439的序列，或至少與這些序列有70％同源性的氨基酸序列的分離的多肽。
再一個方面，本發(fā)明提供編碼上述多肽的克隆的DNA序列，以及包含這些克隆的DNA序列的載體和宿主細胞。
在本發(fā)明的范圍內，再一個方面涉及使用本發(fā)明的植酸酶從植酸中釋放無機磷酸鹽，及某些更具體的應用和組合物，特別是食品和飼料制品，以及包括本發(fā)明植酸酶的添加劑。
一般說來，本文所使用的術語和詞句均按本領域慣例解釋。但在有疑問的情況下，本說明書的定義可能是有用的。一般性定義詞句“具有/表現有植酸酶活性的分離的多肽/酶”或“分離的植酸酶”是指具有植酸酶活性(參見下文)并基本上沒有其他非植酸酶多肽的，例如用SDS-PAGE檢測至少約20％純，較好至少約40％純，更好約80％純，最好約90％純，最好甚至約95％純的任何肽或蛋白質。有時這樣的多肽也可稱為“純化的”植酸酶。
“分離的多肽”的定義也包括融合的多肽或可裂解的融合多肽，其中另一種多肽在該多肽或其片段的N末端或C末端融合。融合的多肽是通過將編碼另一種多肽的核酸序列(或其部分)與本發(fā)明的核酸序列(或其部分)融合而產生的。生產融合多肽的技術是本領域已知的，并且包括連接編碼這些多肽的編碼序列以便它們在讀碼內，并使融合多肽的表達處于同樣啟動子和終止子的控制下。
詞句“表現有植酸酶活性的多肽或酶”或“植酸酶”可包括能夠影響無機磷酸鹽或三價磷從各種磷酸肌醇中釋放的任何酶。這樣的磷酸肌醇(植酸酶底物)的例子是植酸和其任何鹽，如植酸鈉或植酸鉀或混合的鹽。另外，肌醇的一、二、三、四或五磷酸酯的任何立體異構體也可作為植酸酶底物。
按照上述定義，可使用這些底物之一檢測植酸酶活性。本文中(除特別指出者外)，以FYT單位確定植酸酶活性，一個FYT是指在下述條件下每分鐘釋放1μmol無機原磷酸鹽所需的酶量pH5.5；溫度37℃；底物濃度為0.0050mol/ml的植酸鈉(C6H6O24P6Na12)。實驗部分中描述了適當的植酸酶檢測法。
“多肽同源性”或“氨基酸同源性”是指兩個序列間的同一性程度?？山柚绢I域已知的計算機程序，例如GCG版本8程序包(ProgramManual for the Wisconsin Package,Version 8,Genetics ComputerGroup,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物學雜志，48,443-453)中提供的GAP來確定同源性。使用有下列設置的GAP進行多肽序列比較5.0GAP創(chuàng)制補償和0.3延伸補償。
在本文中，術語“6-植酸酶”是指首先水解植酸中的6位或對這些位置(因為這一術語覆蓋兩個位置，故使用復數)有所偏愛。具體地說，第一步驟中的50％以上的水解產物是Ins(1,2,3,4,5)P5和/或Ins(1,2,3,5,6)P5。這兩種化合物較好包括至少60％，更好至少70％，更好至少80％，特別是至少90％，并且最好95％以上的PA初始水解步驟的產物。
如“3-植酸酶”、“(3+6)-植酸酶”、“6D-植酸酶”和“6L-植酸酶”等其他特異性術語應作相應的解釋，包括同樣優(yōu)選的實施方案。
目前認為短語“克隆到存在于保藏的大腸桿菌菌株中的質粒內的DNA序列的植酸酶編碼部分”和“序列表中給出的相應DNA序列的植酸酶編碼部分”有相同的意義，因此可以互換使用。
與DNA序列相關使用的術語“植酸酶編碼部分”主要是指翻譯成具有植酸酶活性多肽序列的DNA序列區(qū)域。其常常是第一個“ATG”起始密碼子(在mRNA中上是“AUG”密碼子)和跟在后面的終止密碼子(“TAA”、“TAG”或“TGA”)之間的區(qū)域。
然而，如上所述翻譯的多肽除表現有植酸酶活性的成熟多肽外，還常常包括有N末端信號序列和/或前肽序列。一般信號序列指導多肽的分泌，前肽指導多肽的折疊。有關更進一步的信息參見Egnell,P.等人，分子微生物學6(9):1115-19(1992)或Stryer,L.，“生物化學”W.H.,Freeman and Company/New York,ISBN0-7167-1920-7。因此，術語“植酸酶編碼部分”也將包括相當于被翻譯的多肽之成熟部分或每個這樣的成熟部分(如果存在幾個的話)的DNA序列。
此外，該定義還將包括編碼仍保留某些植酸酶活性的多肽片段之DNA序列的任何片段。
克隆的DNA序列或者說“DNA構建物”、“DNA區(qū)段”或“分離的DNA序列”是指可按照用于遺傳工程中的標準克隆方法克隆，以將DNA區(qū)段從其天然位置重新定位到其將被復制的不同位點的DNA序列。該術語一般是指基本上沒有其他核酸序列的，即當用瓊脂糖凝膠電泳法檢測時可見至少約20％純，較好至少約40％純，更好約60％純，特別是至少約80％純，最好約90％純，尤其是最好約95％純的核酸序列?？寺》椒砂ㄇ懈畈⒎蛛x包括編碼多肽之核酸序列的所需核酸片段，將該片段插入到載體分子中，并將重組載體摻入到核酸序列的多拷貝或克隆將在其中復制的宿主細胞內。核酸序列可以是基因組的、cDNA、RNA、半合成的、合成來源的，或其任何聯合來源的。
可借助本領域已知的計算機程序，例如GCG程序包(ProgramManual for the Wisconsin Package,Version8,August1996,GeneticsComputer Group,575Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711)(Needlaman,S.B.和Wunsch,C.D.,(1970)，分子生物學雜志，48，443-453)中提供的GAP確定兩個核酸序列間的同一性或“同源性”程度。使用有下列設定的GAP進行DNA序列比較5.0GAP創(chuàng)制補償和0.3GAP延伸補償。
決定某特定DNA或RNA序列是否與特定核苷酸或寡核苷酸探針“雜交”的適當實驗條件包括，在5×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)(J.Sambrook,E.F.Fritsch，和T.Maniatis,1989，分子克隆，實驗室手冊，第2版，冷泉港，紐約)中預浸漬含有DNA片段或RNA的濾膜10分鐘，以檢查雜交并在5×SSC、5×Denhardt′s溶液(Sambrook等人，1989)、0.5％SDS和100μg/ml變性的超聲處理的鮭精子DNA(Sambrook等人，1989)的混合液中預雜交，然后在含有10ng/ml隨機引發(fā)的(Feinberg,A.P.和Vogelstein,B.(1983)分析生物化學132:6-13)、32P-dCTP標記的(比活性＞1×109cpm/μg)探針的同樣溶液中，于大約45℃雜交12小時。
然后在2×SCC、0.5％SDS中，分別于至少55℃(低嚴格性)、至少60℃(中等嚴格性)、至少65℃(中等/高嚴格性)、至少70℃(高嚴格性)或至少75％(很高嚴格性)將濾膜洗兩次。
使用X光膠片檢測在這些條件下與寡核苷酸探針雜交的分子。
已發(fā)現，有可能在理論上推斷兩個給定的DNA序列是否能在某些特定條件下雜交。
因此，作為上述實驗方法的可代用方法，可基于理論上計算兩個異源DNA序列將在特定條件(例如關于陽離子濃度和溫度)下與已知序列雜交的Tm(解鏈溫度)，確定是否某類似的DNA序列將與上述核苷酸探針雜交。
為了確定異源DNA序列的解鏈溫度(Tm(異))，有必要首先確定同源DNA序列的解鏈溫度(Tm(同))。
可使用下列公式確定兩條完全互補的DNA鏈(同源雙鏈形成)之間的解鏈溫度(Tm(同))，Tm(同)=81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L(參見“分子生物學當前方案”，John Wiley and Sons,1995)，其中“M”代表洗滌緩沖液中的陽離子摩爾濃度，“％GC”代表DNA序列中堿基總數的鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)百分比，“％form”代表洗滌緩沖液中的甲酰胺百分比，“L”代表DNA序列的長度。
按上述公式確定的Tm是兩個完全互補的DNA序列間同源雙鏈形成的Tm(Tm(同))。為了使Tm值適應兩個異源DNA序列的Tm值，推測兩個異源序列間核苷酸序列的1％差異相當于Tm降低1℃(“分子生物學當前方案”，John Willey and Sons,1995)。因此，可從Tm(同)中減去所研究的類似的序列間％同源性差異以求出異源雙鏈形成所需的Tm(異)。按本文上述的方法計算將被減去的DNA同源性百分數(參見上文)。
術語“載體”將包括如“核酸構建物”、“DNA構建物”、“表達載體”或“重組載體”等這樣一些術語/主題。
核酸構建物包括與一個或多個調控序列可操作地連接的本發(fā)明的核酸序列，所說的調控序列能夠指導編碼序列在與之相容的條件下在適當宿主細胞中表達。
“核酸構建物”在本文中定義為單鏈或雙鏈的核酸分子，其為從天然基因中分離的，或已被修飾而含有以使之不再以天然形式存在的方式結合和相鄰的核酸區(qū)段。
當核酸構建物含有表達本發(fā)明的編碼序列所需的所有調控序列時，術語核酸構建物可以是與表達盒同義的。
本文限定的術語“編碼序列”當置于上述調控序列控制下時，其主要含有被轉錄成mRNA并被翻譯成本發(fā)明的多肽的序列。編碼序列的邊界基本上是由5′末端的翻譯起始密碼子ATG和3′末端的翻譯終止密碼子確定的。編碼序列可包括但不只限于DNA、cDNA和重組核酸序列。
本文限定的術語“調控序列”包括為表達核酸序列中的編碼序列所需要的所有成分。每個調控序列都可以是編碼多肽的核酸序列所固有的或外源提供的。這樣的調控序列包括但不只限于前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號序列和轉錄終止序列。調控序列最少包括啟動子，和轉錄與翻譯終止信號。可以與為導入特異性限制位點所需的接頭一起提供調控序列，以利于調控序列與編碼多肽之核酸序列的編碼區(qū)相連接。
在表達載體中，編碼植酸酶的DNA序列應可操作地連接到適當的啟動子和終止子序列上。啟動子可以是在選擇的宿主細胞中表現有轉錄活性，并可衍生于編碼同源或異源于宿主細胞之蛋白質的基因的任何DNA序列。用于連接編碼植酸酶的DNA序列、啟動子和終止子，以及將它們插入適當的載體的方法是本領域技術人員已知的(如參見Sambrook等人，1989，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港，紐約)。
重組表達載體可以是能夠方便地經受重組DNA處理步驟，并可引起核酸序列表達的任何載體(如質?；虿《?。
可以將編碼本發(fā)明多肽之核酸序列的一個以上的拷貝插入宿主細胞中，以擴增核酸序列的表達?？梢允褂帽绢I域已知的方法將序列的至少一個附加拷貝整合到宿主細胞基因組中，并選擇轉化體，從而獲得核酸序列的適當擴增。
用于連接上述各元件以構建本發(fā)明的重組表達載體的方法是本領域技術人員已知的(如參見Sambrook等人，1989，上述文獻)。
“宿主細胞”或“重組宿主細胞”包括親代細胞的任何子代，由于其在復制期間發(fā)生突變而不同于親代細胞。
較好用包括本發(fā)明的核酸序列的載體轉化細胞，然后將載體整合到宿主染色體內。
“轉化”是指將包括本發(fā)明之核酸序列的載體導入宿主細胞中，從而作為染色體的整合體或自身復制的染色體外載體保留之。一般認為整合作用是有利的，因為這樣核酸序列更可能穩(wěn)定地保留在細胞中?？梢酝ㄟ^如上所述的同源或非同源重組使載體整合到宿主染色體內。
宿主細胞可以是單細胞微生物如原核細胞，或非單細胞微生物如真核細胞。真核細胞例如可以是哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞或真菌細胞。適用的哺乳動物細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、HeLa細胞、幼倉鼠腎(BHK)細胞、COS細胞或例如可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心得到的其他無限增殖細胞系的任何成員。
在一優(yōu)選實施方案中，宿主細胞是真菌細胞。本文中使用的術語“真菌”包括子囊菌門、擔子菌門、壺菌門和接合菌門(如Hawksworth等人在Ainsworth和Bisby的真菌字典，第8版，1995,CAB International,大學出版社，Cambrige，英國中限定的)，以及卵菌門(如Hawksworth在上述文獻中列出的)和所有的有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995，上述文獻)。還參見Julich,1981，擔子菌的高級分類單位和Hansen&Knudsen(編輯)，Nordic Macromgcetes,Vol.2(1992)和3(1997)。
可使用原生質體形成，原生質體轉化和細胞壁再生等已知方法轉化真菌細胞。
優(yōu)選的宿主細胞是鐮孢霉屬、木霉屬或曲霉屬的菌株，特別是禾本科鐮孢(Fusarium graminearum)、F.venenatum、F.cerealis、有鐮孢霉ATCC20334的識別特征的菌種(如PCT/US/95/07743所述)、Trichoderma harzianum或T.reesei、黑曲霉或米曲霉。
附圖簡要說明在本發(fā)明的詳細描述中必須參考下列附圖

圖1是隔孢伏革菌植酸酶的pH-活性曲線(5mM植酸鹽，30分鐘，37℃)；圖2是其pH-穩(wěn)定性曲線(40℃預保溫1小時)；圖3是其溫度-活性曲線(0.1M乙酸鈉、5mM植酸鹽，pH5.5,30分鐘)；圖4是其溫度-穩(wěn)定性曲線(在0.1M乙酸鈉(pH5.5)中預保溫60分鐘)；圖5是其差示掃描量熱(DSC)曲線(0.1M乙酸鈉，pH5.5；Td=59.6℃)；圖6-7分別顯示黑曲霉和隔孢伏革菌植酸酶產物型式的疊合作圖的NMR光譜(達24小時)；圖8-9同上述NMR光譜，但重疊作圖達4.5小時；圖10a-c是分別在20分鐘(pH5.5)、24小時(pH5.5)和20分鐘(pH3.5)后觀察到的NMR分布圖。
圖11是分別顯示Ins(1,2)P2和Ins(2)P的濃度對時間的曲線；圖12-13是分別顯示pH5.5和pH3.5條件下從玉米得到的無機磷酸鹽釋放對時間的曲線。
寄存已按照國際公認用于專利程序的布達佩斯條約的規(guī)定，將從中得到本發(fā)明的植酸酶的分離的Peniophora lycii的菌株寄存在Centraalbureanvoor Schimmel-cultures,P.O.Box273,3740AG Baarn，荷蘭，(CBS)；寄存日1996年12月4日；寄存號NN006113；CBS號Peniophoralycii CBS No.686.96。
另外，也已將轉化到大腸桿菌菌株中的含有編碼本發(fā)明的該植酸酶的全長度cDNA序列的表達質粒(穿梭載體)pYES2.0，按照國際公認用于專利程序的布達佩斯條約的規(guī)定保藏在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH.,Mascheroder Weg 1b,D-38124Braunschweig，德國，(DSM)；寄存日1996年12月2日；寄存號NN049282；DSM號大腸桿菌DMS No.11312。發(fā)明的詳細描述已知的植酸酶與有SEQ ID No.2所示氨基酸序列和SEQ ID No.1所示DNA序列的植酸酶的同源性如下與下列植酸酶的同源性(分別在氨基酸和DNA水平上)為氨基酸DNA黑曲霉(NRRL3135)41％51％土曲霉(菌株9A-1)41％53％嗜熱毀絲霉(ATCC48102):45％54％許旺酵母26％38％大腸桿菌K12(ATCC33965):- 39％符號“-”表示沒有真正識別P.lycii和大腸桿菌的植酸酶。
因此，隔孢伏革菌植酸酶與已知植酸酶相當不同，其中最密切相關的是嗜熱毀絲霉的植酸酶(EP0684313)。
如下文實驗部分中更詳細描述的，當在曲霉中表達時，隔孢伏革菌植酸酶具有N末端氨基酸序列Leu-Pro-Ile-Pro-Ala-Gln-Asn-(SEQ ID NO.2的氨基酸序號31-37)。因此，目前認為SEQ ID No.2的氨基酸序號31-439的序列是成熟植酸酶序列。
本申請的所有氨基酸同源性至少為55％，或至少60％，或至少65％，特別是至少70％。同源性程度至少為80％，較好為至少90％，更好是至少95％，特別是至少97％。
植酸酶多肽可得自Peniophora lycii CBS686.96，并且具有下列一種或多種特征(ⅰ)最適pH3-6，(ⅱ)最適溫度30-65℃，(ⅲ)在pH3-9和40℃至少穩(wěn)定1小時，(ⅳ)于0-50℃預保溫1小時后保留75％以上的殘留活性，(ⅴ)去糖基化酶的分子量為43-53KDa，(ⅵ)70℃預保溫60分鐘后至少保留20％的殘留活性，(ⅶ)用DSC法檢測解折疊溫度為50-65℃。
某些可替代的或更優(yōu)選的范圍是(ⅰ)最適pH較好為3.5-5.5，更好為3.7-5.2，最好為3.85.0，(ⅱ)最適溫度較好為35-62℃，更好約為37-58℃，可能約為50℃，(ⅲ)在pH3-6，最好是pH3-5和40℃條件下至少穩(wěn)定1小時，(ⅳ)于pH5.5條件下，0-50℃保溫1小時后的殘留活性至少80％，最好是至少90％，(ⅴ)SEQ ID No.2所示多肽的去糖基化形式的計算的分子量為48KDa。可用酶學或化學方法使多肽去糖基化并用質譜法或SDS-PAGE凝膠電泳法測定分子量。M.F.Chaplin和J.F.
Kennedy所編寫的“碳水化合物分析-實用方法”(IRL出版社，Oxford,1986，特別是參見第5章)中描述了化學去糖基化方法。按照酶供應商指出的方法進行酶促去糖基化。或者在SDS-PAGE中測得相對分子量標志物遷移率的表觀分子量約為67KDa。該值(約67KDa)是當酶在曲霉中表達時得到的(參見下文實施例)。
(ⅵ)在pH5.5,70℃預保溫60分鐘后的殘留活性至少為30％，較好至少40％，最好至少50％；或者于pH5.5,60-80℃預保溫1小時后的殘留活性至少為30％，較好至少40％，最好至少50％，(ⅶ)DSC方法測定解折疊溫度較好為55-62℃，更好58-62℃，最好約60℃。
或者說，下列特征是多肽所特有的37℃測得最適pH為3-7；較好是37℃測得最適pH為4-6；更好37℃測得最適pH為4.5-5.5；70℃保溫20分鐘后測得相對于26℃保溫后至少保留有65％殘留植酸酶活性；較好是70℃保溫20分鐘后測得相對于26℃活性至少保留65％殘留植酸酶活性；更好是70℃保溫20分鐘后測得相對于26℃時的活性，至少保留80％殘留植酸酶活性。
最近注意到，也可從層擔子菌綱，較好從Stereales目，更好是從隔孢伏革菌屬，特別是Peniophora lycii的菌株中得到本發(fā)明的多肽。
本發(fā)明的多肽能夠在其已變性后重新折疊以恢復其植酸酶活性的至少10％，較好至少20％，更好至少30％，再好至少40％，最好至少50％。
一種篩選這種真菌多肽的方法是將所研究的微生物鋪覆在植酸酶復制平板上(參見實施例1，“陽性菌落的鑒定”)并于例如30或37℃保溫。分離植酸酶陽性菌落，在搖瓶中培養(yǎng)并除去上清。按實施例1的方法(“米曲霉轉化體的試驗”)，于70℃熱處理例如20分鐘之前和之后檢測上清液的植酸酶活性。那些例如在70℃保溫20分鐘后仍為植酸酶陽性的樣品即為熱穩(wěn)定的，或能夠重新折疊以恢復其大部分植酸酶活性的。可按照實施例5或6所述方法，即在許多不同溫度下(在確定殘留活性是否隨溫度增加而下降和再升高的相對溫度范圍內)保溫后檢測殘留活性來排除真正的熱穩(wěn)定性樣品。
可使用所研究的生物體所要求的基本培養(yǎng)基和溫度，將該方法應用于其他微生物，如細菌。
本發(fā)明還涉及在應用中使PA底物(完全磷酸化的)很早地消失，具體地說是在5小時內，較好在4小時內，更好在3小時內，特別是在2小時內，尤其是在1小時內，最好在1/2小時內消失的，表現有植酸酶活性的分離的多肽(參見本文實施例5)；特別是在pH3.5條件下較快地從植酸中釋放無機磷酸鹽的表現有植酸酶活性的分離的多肽(參見本文實施例6)；以及這四種類型植酸酶中的任何一種在烘烤面包、調合面團、制備肌醇或其衍生物，以及在食物和飼料，特別是動物飼料或動物飼料添加劑中的應用。
權利要求4涉及本發(fā)明植酸酶的核苷酸序列，特別是DNA序列。
有關“雜交”的定義請參見“一般性定義”部分，其中也列出了某些優(yōu)選的雜交條件。
可按“一般性定義”部分中描述的方法確定兩個核酸序列間的同一性或同源性程度。就權利要求4的特征(c)中所述的同源性來說，與(a)和(b)項所列核酸序列的同源性程度至少約為55％(仍編碼有植酸酶活性的多肽)。具體地說，同源性至少為60％，或至少為65％，特別是至少70％，較好至少約80％，優(yōu)選的是至少約90％，更優(yōu)選的是至少約95％，最優(yōu)選的是至少約97％。具體地說，同源性程度是基于所列出的完整序列與其互補鏈或其相當于“成熟”植酸酶的任何亞序列間比較。
雜交條件(特征(d))較好是低、中度、中度/高度、高度或很高嚴格性的。
也可用包括下列步驟的任何一般性方法克隆本發(fā)明的DNA序列·將來自任何預期產生所需植酸酶的生物體的cDNA文庫在適當的載體中克隆，·用所說的載體轉化適當的酵母宿主細胞，·在表達由cDNA文庫中的克隆編碼的有用酶的適當條件下培養(yǎng)宿主細胞，·經檢測由這些克隆產生的酶的植酸酶活性篩選陽性克隆，以及·分離由這些克隆中的DNA編碼的酶。WO93/11249和WO94/14953中已公開了一般性分離方法。實驗部分中給出了篩選方法的詳細步驟。
本發(fā)明還總地涉及使用根據權利要求1-3任一項的多肽從植酸鹽或植酸中釋放(或催化釋放)無機磷酸鹽。換句話說，即將植酸鹽轉化成無機磷酸鹽和肌醇和/或其一、二、三、四、五磷酸酯。在該權利要求范圍內，包括其中本發(fā)明的植酸酶發(fā)揮其如以前限定的植酸酶活性的任何方法。
根據本發(fā)明的更具體的應用是在人食品或動物飼料制品中或在這些制品的添加劑中，其中植酸酶例如可用于以下目的(ⅰ)降低糞尿中的植酸鹽水平，(ⅱ)例如通過制造其本身已被植酸鹽結合的可用蛋白質，改善可消化性、促進生長、或改善食品和飼料利用率或其轉化效率，(ⅲ)預防營養(yǎng)不良或由必需離子和磷酸鹽缺乏引起的疾病如貧血，即改善物質的生物可利用率或增加其吸收，而不必另外添加磷酸鹽和離子等。
具體地說，本發(fā)明的植酸酶也可用于雞飼料中以改善卵殼質量(減少因破碎造成的損失)，如參見Merck獸醫(yī)手冊，第7版，Merck&Co.,Inc.,Rahway,N.J.,USA,1991,p.1268；Jeroch等人，Bodenkultur Vol.45,No.4,pp.361-368(1994)；禽類科學，Vol.75,No.1,PP.62-68(1996)；加拿大動物科學雜志Vol.75,No.3,PP.439-444(1995)；禽類科學74,No.5,PP.784-787(1995)和禽類科學Vol.73,No.10,pp.1590-1596(1994)。
“飼料”和“食品”分別是指任何天然或人工食物、飲食等，或適于動物和人類食用、攝入、消化的這些食物的成分。
植酸酶可在體外或體內，即其攝入之前或在個體的胃中發(fā)揮其作用。也可能有聯合作用。
本發(fā)明的植酸酶組合物總是包括至少一種本發(fā)明的植酸酶。
一般說來，植酸酶組合物是液體或干燥的。
液體組合物不需要含有植酸酶以外的任何成分，并且較好是高度純化形式的。但通常也加入穩(wěn)定劑如甘油、山梨醇或丙二醇。液體組合物還可包括其他添加劑，如鹽、糖、防腐劑、pH調節(jié)劑、蛋白質、植酸鹽(植酸酶底物)。典型的液體組合物是含水或油基的漿液。液體組合物可在適當地制成粒狀沉淀后加到食品或飼料中。
干燥組合物可以是噴霧干燥的組合物，在這種情況下，組合物不一定含有干燥形式酶以外的任何其他成分。但干燥組合物是可很容易與食品或飼料成分混合的所謂顆粒，或最好形成預混物的成分。酶顆粒的粒子大小最好是與混合物的其他成分的顆粒大小匹配的。如此提供一種將酶摻入例如動物飼料中的安全和方便的方法。
在填充材料和酶共團聚以形成顆粒期間，在高剪切力混合器(如Lodige)中使用團聚技術制備團聚顆粒。用酶包被/吸收載體材料核心以制備吸收顆粒。
典型的填充材料是鹽，例如硫酸二鈉。其他填充材料是高嶺土、滑石粉、硅酸鋁鎂和纖維素纖維。也可在團聚顆粒中加入粘合劑例如糊精。
典型的載體材料是淀粉、例如木薯、玉米、馬鈴薯、稻米和小麥的淀粉。也可以使用鹽。
必要時可用包被混合物包被顆粒。這樣的混合物包括涂層劑，較好是疏水涂層劑，例如氫化棕櫚油和煉制的牛油脂，以及高嶺土或碳酸鈣等必要的其他添加劑。
此外，植酸酶組合物可含有其他成分，如著色劑、產香化合物、穩(wěn)定劑、維生素、礦物質、其他飼養(yǎng)或食品增效酶等。這對于所謂的預混合物也是一樣的。
“食品或飼料添加劑”是適于加入到食品或飼料中的基本上純的化合物或多成分組合物。具體地說，它是一種可成為食品或飼料產品的成分或影響食品或飼料產品的任何特征的物質。它參予組成上述植酸酶組合物。典型的添加劑通常包括維生素、礦物鹽或飼料增效酶，和適當的載體和/或賦形劑等的一種或多種化合物。
在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的植酸酶組合物另外還包括有效量的一種或多種飼養(yǎng)增效酶，特別是選自α半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶，特別是乳糖酶、其他植酸酶、β葡聚糖酶，特別是內切-β-1,4-葡聚糖酶和內切-β-1,3(4)-葡聚糖酶、纖維素酶、木聚糖苷酶，半乳聚糖酶，特別是阿拉伯半乳聚糖內切-1,4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖內切-1,3-β-半乳糖苷酶，內切葡聚糖酶，特別是內切-1,2-β-葡聚糖酶、內切-1,3-α-葡聚糖酶和內切-1,3-β-葡聚糖酶，果膠降解酶，特別是果膠酶、果膠酯酶、果膠裂合酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯糖酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖-α-鼠李糖苷酶、果膠酸裂合酶，和α-半乳糖醛酸苷酶、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、蛋白酶、木聚糖酶、阿拉伯糖木聚糖酶和脂解酶，如脂酶、磷脂酶和角質酶。
在進食之前或進食的同時將本發(fā)明的動物飼料添加劑補充給單胃動物。較好是與食物一起將本發(fā)明的動物飼料添加劑補充給單胃動物。在一優(yōu)選實施方案中，將動物飼料添加劑以顆?；蚍€(wěn)定化液體的形式加到食物中。
食品或飼料中植酸酶的有效量約為10-20,000，較好約10-15,000，更好約為10-10,000，特別是約為100-5,000，尤其是約為100至2,000FYT/公斤飼料或食品。
本發(fā)明植酸酶的其他特定用途是例如用于大豆加工和生產肌醇或其衍生物。
本發(fā)明還涉及降低動物糞尿中植酸鹽水平的方法，其中包括給動物喂飼包含有有效量本發(fā)明植酸酶的飼料。如本申請開頭所指出的，其一個重要作用是降低環(huán)境中的磷酸鹽污染。
本發(fā)明還包括在制備食品或飼料制品或添加劑期間使用本發(fā)明的植酸酶，即只在生產期間使植酸酶發(fā)揮其植酸酶活性，而其在食品或飼料終產品中則沒有活性。這方面的相關例子是例如調和面團和烘烤面包中。
本發(fā)明還涉及實質上純的已寄存之微生物的生物學培養(yǎng)物；和包含作為其遺傳材料的一部分的，編碼本發(fā)明植酸酶的DNA序列的菌株。實質上純的生物學培養(yǎng)物是指所說菌株的保留有植酸酶編碼能力的任何突變體。
下列實施例旨在進一步地詳細描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例材料和方法培養(yǎng)基植酸鹽復制平板
向200ml熔化的SC瓊脂中加入20ml 20％半乳糖、800μl5％蘇氨酸、25ml溶液A、25ml溶液B、200μl微量元素溶液(DSM目錄141)。
溶液A6g CaCl2·2H2O、8g MgCl2·6H2O、加ddH2O至1升，pH=6.5。
溶液B35.12g植酸鈉，加H2O至1升，pH=6.5。
培養(yǎng)基A酵母氮基W/O氨基酸(Difco0919)7.5g/l琥珀酸(Merck822260) 11.3g/lNaOH(Merck6498)6.8g/l酪蛋白氨基酸W/O維生素(Difco0288)5.6g/l色氨酸(Merck8374) 0.1g/l蘇氨酸 1.0g/l植酸鈉(35.12g/l,pH6.5) 125ml/l半乳糖 20.0g/l微量金屬(DSM141)1.0ml/l加水至1升微量金屬溶液次氮基三乙酸1.50g、MgSO4·7H2O3.00g、MnSO4·2H2O0.50g、NaCl1.00g、FeSO4·7H2O0.10g、CoSO4·7H2O0.18g、CaCl2·2H2O0.10g、ZnSO4·7H2O0.18g、CuSO4·5H2O0.01g、KAl(SO4)2·12H2O0.02g、H3BO30.01g、Na2MoO4·2H2O0.01g、NiCl2·6H2O0.025g、Na2Se3O·5H2O0.30g，加蒸餾水至1升，pH7.0。
首先溶解次氮基三乙酸并用KOH將pH調到6.5，然后加入礦物質。最后的pH為7.0(用KOH調整)。
培養(yǎng)基B
相似于培養(yǎng)基A，所不同的是加入葡萄糖作為C源，以代替半乳糖。
YPD10g酵母提取物、20g蛋白胨，加水至900ml。高壓滅菌，加入100ml20％葡萄糖(無菌過濾)。
YPM10g酵母提取物、20g蛋白胨，加水至900ml。高壓滅菌，加入100ml20％無菌過濾的麥芽糖糊精。
10X基本鹽75g酵母氮基、113g琥珀酸、68g NaOH，加水至1000ml，然后無菌過濾。
SC-URA100ml 10X基本鹽、28ml 20％沒有維生素的酪蛋白氨基酸、10ml1％色氨酸，加水至900ml，高壓滅菌，然后加入3.6ml 5％蘇氨酸和100ml20％葡萄糖或20％半乳糖。
SC-瓊脂SC-URA，加入20g/l瓊脂。
SC-變體瓊脂20g瓊脂、20ml 10x基本鹽，加水至900ml，然后高壓滅菌。一般分子生物學方法除另外指出者外，所有DNA操作和轉化均按分子生物學的標準方法進行(Sambrook等人(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；Ausubel,F.M.等人(編輯)“分子生物學當前方案”，John Wileyand Sons,1995；Harwood,C.R，和Cutting,S.M.(編輯)“芽孢桿菌的分子生物學方法”，John Willey and Sons,1990)。
除特別提到者外，用于DNA操作的所有酶，例如限制性核酸內切酶、連接酶等均得自New England Biolabs,Inc.。按照供應商的說明書中所述方法使用這些酶。實施例1從Peniophora lycii CBS No.686.96克隆并表達植酸酶保藏的生物體
Peniophora lycii CBS No.686.96含有編碼本發(fā)明植酸酶的DNA序列。
大腸桿菌DSM No.11312包含存在于穿梭載體pYES2.0中的編碼本發(fā)明植酸酶的全長度cDNA序列。
其他菌株酵母菌株使用的釀酒酵母菌株是W3124(van den Hazel,H.B.；Kielland-Brandt,M.C；Winther,J.R，歐洲生物化學雜志207:277-283,1992)(MATa；ura3-52；Leu2-3,112；his3-D200；pep4-1137；prcl:HIS3；prb1∷LEU2；cir+)。
大腸桿菌菌株DH10B(Life Technologies)質粒曲霉表達載體pHD414是質粒p775(EP238023中所述)的衍生物。pHD414的構建詳見WO93/11249。
pYES2.0(Invitrogen)pA2phy2(見實施例1)在酵母中表達克隆按照H.Dalboege等人(Mol.Gen.Genet.,(1994),243:253-260；WO93/11249；WO94/14953；引入本文作為參考)所述的方法進行酵母中的表達克隆?？俁NA延伸、cDNA合成、綠豆核酸酶處理、用T4DNA聚合酶修剪平頭及文庫構建均按以上參考文獻所述方法完成。
發(fā)酵培養(yǎng)Peniophora lycii CBS No.686.96以分離mRNA將長出菌絲體的平板中的Peniophora lycii CBS686.96接種到含有100ml培養(yǎng)基B(大豆粉30g/l，麥芽糖糊精15g/l，細菌蛋白胨5g/l，多聚醇(Pluronic)0.2g/l)的搖瓶中。26℃將培養(yǎng)物靜止保溫15天。通過濾布(Miracloth)過濾所得到的培養(yǎng)物并在液氮中冷凍菌絲體。按上文所述H.Dalboege等人的方法從該培養(yǎng)物的菌絲體中分離mRNA。
總RNA的提取和poly(A)+RNA的方離用硫氰酸鈲提取總RNA，然后通過5.7M CsCl墊層超離心，并使用WO94/14953中所述方法，通過Oligo(dT)纖維素親合層析分離poly(A)+RNA。
cDNA合成用RNase H方法(Gubler和Hoffman，(1983)基因25:263-269；Sambrook等人，(1989)，上述文獻)從5mg poly(A)+RNA合成雙鏈cDNA。將poly(A)+RNA(5μg，在5μl DEPC處理的水中)于70℃在預硅化的，無RNase的Eppendorph管中加熱8分鐘，在冰上驟冷并以50μl終體積與含有1mM dATP、dGTP和dTTP及0.5mM 5-甲基-dCTP(Pharmacia)、40單位人胎盤核糖核酸酶抑制劑(RNasin，Promega)、1.45μg Oligo(dT)18-Not Ⅰ引物(Pharmacia)和1000單位SuperScriptⅡRNase H反轉錄酶(Bethesda Research Laboratories)的反轉錄酶緩沖液(50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT)(Bethesda Research Laboratories)合并。于45℃將反應混合物保溫1小時以合成第一條cDNA鏈。合成后，按照生產商提供的使用說明通過MicroSpin S-400HR(Pharmacia)旋轉柱凝膠過濾mRNA:cDNA雜合混合物。
凝膠過濾后，在含有各200μl dNTP、60單位大腸桿菌DNA聚合酶I(Pharmacia),5.25單位RNase H(Promega)和15單位大腸桿菌DNA連接酶(Boehringer Mannheim)的250μl第二鏈緩沖液(20mMTris-Cl(pH7.4)、90mM KCl、4.6mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、0.16mM bNAD+)中稀釋所得到的雜合體。將反應管于16℃保溫2小時，再于25℃保溫15分鐘來完成第二條cDNA鏈的合成。加入終濃度為20mM的EDTA終止反應，然后進行苯酚和氯仿提取。
綠豆核酸酶處理加入2倍體積96％乙醇，0.2體積10M NH4Ac于-20℃將雙鏈cDNA沉淀12小時，離心回收，在70％EtOH中洗滌，干燥并重新懸浮在含有25單位綠豆核酸酶(Pharmacia)的30μl綠豆核酸酶緩沖液(30mM NaAc(pH 4.6)、300mM NaCl、1mM ZnSO4、0.35mM DTT、2％甘油)中。將反應混合物于30℃保溫30分鐘以修剪單鏈發(fā)夾DNA，然后加入70μl 10mM Tris-Cl(pH7.5)和1mM EDTA，用苯酚提取并在冰上用2體積96％EtOH和0.1體積3M NaAc(pH5.2)沉淀30分鐘。
用T4DNA聚合酶修平頭離心回收雙鏈cDNA，并在含有各0.5mM dNTP和5單位T4DNA聚合酶(New England Biolabs)的30ml T4 DNA聚合酶緩沖液(20mMTris-乙酸鹽(pH7.9)、10mM MgAc、50mM KAc、1mM DTT)中將反應混合物于16℃保溫1小時以修成平頭。加入終濃度為20mM的EDTA以終止反應，然后進行苯酚和氯仿提取，通過加入2體積96％EtOH和0.1體積3M NaAc(pH5.2)于-20℃沉淀12小時。
連接物連接、NotⅠ消化和按大小選擇填充反應后，離心回收cDNA，在70％乙醇中洗并干燥。將cDNA沉淀物重新懸浮于含有2.5μg非回文BstXⅠ連接物(Invitrogen)和30單位T4連接酶(Promega)的25μl連接緩沖液(30mM Tris-Cl(pH7.8)、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP)中并于16℃保溫12小時。于65℃加熱20分鐘以終止反應，然后在冰上冷卻5分鐘。加入20μl水、5μl 10X NotⅠ限制性酶緩沖液(New England Biolabs)和50單位NotⅠ(New England Biolabs)，然后于37℃保溫2.5小時，以用NotⅠ限制性酶消化銜接的cDNA。于65℃加熱10分鐘以終止反應。在1×TBE中，于0.8％SeaPlaque GTG低熔點凝膠(FMC)上進行凝膠電泳按大小分級分離cDNA，以分離出未連接的連接物和小的cDNA。以0.7Kb的截斷值按大小選擇cDNA，并按生產商的使用說明使用b-Agarase(NewEngland Biolabs)從凝膠中拯救所需大小的片段，然后加入2體積96％EtOH和0.1體積3M NaAc(pH5.2)于-20℃沉淀之。
文庫的構建離心回收有方向性的，按大小選擇的cDNA，在70％EtOH中洗滌，干燥并重新懸浮于30μl 10mM Tris-HCl(pH7.5)、1mM EDTA中。按照生產商的使用說明通過MicroSpin S-300HR(Pharmacia)旋轉柱，以凝膠過濾法將cDNA脫鹽。在含有5μl雙鏈cDNA(#1和#2反應管)、15單位T4連接酶(Promega)和30ng(#1管)、40ng(#2管)和40ng(#3管，載體本底對照)BstXⅠ-NotⅠ切割的pYES2.0載體的10μl連接緩沖液(30mM Tris-Cl(pH7.8)、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP)中進行三次試驗連接。于16℃保溫12小時，于70℃加熱20分鐘并向各管內加入10μl水完成連接反應。按已述方法(Sambrook等人，(1989)，上述文獻)將各1μl連接混合物電穿孔轉化到40μl電感受態(tài)大腸桿菌DH10B細胞(Bethesda Research Laboratories)中。使用最適條件在由集合體組成的大腸桿菌中建立文庫。將轉化的大腸桿菌分散于LB+氨芐青霉素瓊脂平板上，37℃保溫24小時后得到15,000-30,000個菌落/平板，從而制得各集合體。將20ml LB+氨芐青霉素加到平板上并將細胞懸浮在其中。將細胞懸液于37℃在50ml管中振蕩1小時。使用QIAGEN質粒試劑盒按生產商提供的使用說明從細胞中分離質粒DNA并于-20℃貯存之。
將從各個集合體分出的1μl純化的質粒DNA(100ng/ml)以電穿孔法(Becker和Guarante,(1991)，酶學方法194:182-187)轉化到釀酒酵母W3124中，將轉化體鋪覆在含有2％葡萄糖的SC瓊脂板上并于30℃保溫。
陽性菌落的鑒定生長3-5天后，將瓊脂板復印到一組植酸鹽復制板上，并于30℃保溫3-5天。將含有0.2M CaCl2的1％LSB瓊脂糖傾倒在平板上并在1-4天后根據菌落周圍亮區(qū)的出現鑒定植酸酶陽性菌落。
將酶陽性菌落中的用于單菌落分離的細胞散布于瓊脂上，并從每個所鑒定的植酸酶生產菌落中分離產生酶的單個菌落。
分離用于在曲霉中表達的cDNA基因將產生植酸酶的酵母菌落接種到50ml玻璃試管內的20ml YPD培養(yǎng)液中。將試管于30℃振蕩2天。以3,000rpm離心10分鐘以收獲細胞。
按照WO94/14953所述方法分離DNA并溶解于50ml水中。按標準方法將DNA轉化到大腸桿菌中。以標準方法從大腸桿菌中分離質粒DNA，并進行限制性酶切分析。
用限制性酶HindⅢ和XbaⅠ切割cDNA插入物并連接到曲霉表達載體pHD414中，得到質粒pA2phy2。
使用Taq脫氧末端循環(huán)測序試劑盒(Perkin Elmer,USA)和合成的寡核苷酸引物，在Applied Biosystems ABI PRISMTM377 DNA測序儀中按儀器使用說明書測定Qiagen純化之質粒pA2phy2(Qiagen,USA)DNA的cDNA插入物的序列。
米曲霉和黑曲霉的轉化按照WO95/02043，第16頁第21行至第17頁第12行中所述方法制備原生質體。
將100μl原生質體懸液與5-25μg溶于10μl STC(1.2M山梨糖醇、10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM CaCl2)中的適當的DNA混合。將原生質體與p3SR2(攜帶構巢曲霉amdS基因的質粒)(Tove Christensen等人，生物/技術，PP.1419-1422,vol.6,Dec.1988)混合。將混合物于室溫下放置25分鐘。加入0.2ml 60％PEG 4000(BDH29576)、10mM CaCl2和10mM Tris-HCl(pH7.5)并小心混勻(兩次)，最后加入0.85ml同樣的溶液并小心混勻。將混合物室溫放置25分鐘，以2500g離心15分鐘并將沉淀重新懸浮于2ml 1.2M山梨糖醇中。經一次以上沉降后，將原生質體散布于含有1.0M蔗糖(pH7.0)、10mM乙酰胺(作為氮源)和20mM CsCl的基本培養(yǎng)基平板(Cove，生物化學與生物物理學學報，(1966)113:51-56)上，以抑制本底生長。37℃保溫4-7天后挑取孢子并分散成單個菌落。重復該方法，并在第二次再分離后保存單個菌落的孢子以作為限定的轉化體。
米曲霉轉化體的試驗在10ml YPM中接種各米曲霉轉化體(參見下文)并增殖之。30℃保溫2-5天后，去除上清液。
將20μl上清液加到在含有0.1M乙酸鈉(pH4.5)和0.1％六磷酸肌醇的1％LSB瓊脂糖平板打出的4mm直徑的孔中。將平板37℃放置過夜。將由0.2M乙酸鈉(pH4.5)和0.1M CaCl2組成的緩沖液傾倒到平板上并將平板室溫放置1小時。然后根據亮區(qū)的出現鑒定植酸酶活性。
補料分批發(fā)酵在含有麥芽糖糊精(作為碳源)、尿素(作為氮源)和酵母提取物的培養(yǎng)基中進行補料分批發(fā)酵。將所研究的米曲霉宿主細胞的搖瓶培養(yǎng)物接種到含有3.5％碳源和0.5％氮源的培養(yǎng)基中進行補料分批發(fā)酵。培養(yǎng)(34℃，pH7.0)24小時后，開始連續(xù)補充碳和氮源。保持碳源作為限制因素，并保證有過量氧存在。連續(xù)補料分批培養(yǎng)4天。
分離SEQ ID No.1中所示的DNA序列可用本領域已知的方法(Sambrook等人，(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)，經提取質粒DNA從已寄存的大腸桿菌DSM11312中得到編碼本發(fā)明植酸酶的SEQ ID No.1中所示DNA序列的植酸酶編碼部分。
使用上述在酵母中表達克隆技術進行克隆和表達。
按上述方法從生長的Peniophora lycii CBS No.686.96中分離mRNA。
生長15天后收獲菌絲體，立即在液氮中冷凍并貯存于-80℃下。在上述有1％載體本底的大腸桿菌中構建由大約9×105個單個克隆組成的Peniophora lycii,CBS No.686.96的文庫。將得自某些集合體的質粒DNA轉化到酵母中，并從各集合體得到含有250-400個酵母菌落的50-100個平板。
按上述方法鑒定并分離植酸酶陽性菌落，并接種到50ml玻璃試管內的20ml YPD培養(yǎng)液中。將試管30℃振蕩2天。3,000rpm離心10分鐘以收獲細胞。按照WO94/14953所述方法分離DNA并溶解于50μl水中。按標準方法將DNA轉化到大腸桿菌中。用標準方法從大腸桿菌中分離質粒DNA，并使用Applied Biosystems ABI PRISMTM377 DNA序列儀，按生產商的使用說明書所述方法，利用Taq脫氧末端循環(huán)測序試劑盒(Perkin Elmer,USA)和合成的寡核苷酸引物測定編碼植酸酶之cDNA的DNA序列。SEQ ID No.1中顯示了編碼植酸酶的cDNA的DNA序列，并且SEQ ID No.2中顯示了相應的氨基酸序列。SEQ ID No.1中的DNA核苷酸序列1至1320限定為植酸酶編碼區(qū)。
SEQ ID No.1編碼植酸酶之成熟部分的DNA序列部分是從位置91至1320，其相應于SEQ ID No.2中的氨基酸位置31-439。
可從DSM11312中的質粒制得cDNA。
從酵母菌落中分離總DNA并按上述方法轉化大腸桿菌以拯救質粒DNA。為了在曲霉中表達植酸酶，用適當的限制性內切酶消化DNA，在凝膠上進行分級分離，并純化相當于植酸酶基因的片段。然后將基因連接到pHD414上，用適當的限制性內切酶消化，得到質粒pA2phy2。
在大腸桿菌中擴增DNA后，按上述方法將質粒轉化到米曲霉中。
米曲霉轉化體的試驗按上述方法試驗各轉化體的酶活性。某些轉化體具有明顯大于米曲霉本底的植酸酶活性。這一結果證明植酸酶在米曲霉中得到有效表達。實施例2在米曲霉中表達的Peniophora lycii植酸酶的分離和特征鑒定在米曲霉IFO4177中表達并從中分泌Peniophora lycii植酸酶。
向通過濾布過濾的培養(yǎng)液中加入助濾劑。進一步通過Seitz深度濾板過濾該溶液，得到澄清的溶液。在3KDa截留分子量的聚醚砜膜上超濾濃縮濾液，然后用蒸餾水滲濾以降低導電性。將濃縮的酶液的pH調到7.5。濃縮酶液的導電率為1.2mS/cm。
將植酸酶加樣到在20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)中平衡的Q-Sepharose FF柱上，并用漸增的線性NaCl梯度(0→0.5M)洗脫酶。作為單一峰洗脫植酸酶活性。合并該峰值部分并向其中加入(NH4)2SO4至1.5M終濃度。在1.5M(NH4)2SO4,10mM琥珀酸/NaOH(pH6.0)中平衡Phenyl Toyopearl650S柱，然后將植酸酶上柱并用漸降的線性(NH4)2SO4梯度(1.5→0M)洗脫。合并含植酸酶部分，并在Sephadex G25柱上將緩沖液換成20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)。將G25濾液加樣到已在20mMTris/CH3COOH(pH7.5)中平衡的Q-Sepharose FF柱上。用平衡緩沖液徹底洗柱后，用漸增的線性NaCl梯度(0-0.5M)洗脫植酸酶。合并含植酸酶活性部分并經透析將緩沖液換成20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)。將透析的植酸酶加樣于在20mM Tris/CH3COOH(pH7.5)中平衡過的SOURCE30Q柱上。用平衡緩沖液徹底洗柱后，用漸增的線性NaCl梯度(0→0.3M)洗脫植酸酶。用SDS-PAGE分析從SOURCE300柱上洗脫的各部分，并合并含純植酸酶的部分。
隔孢伏革菌植酸酶在凝膠中作為Mr=67KDa的帶遷移。在SDS-PAGE之后測定67KDa成分的N末端氨基酸序列并電印跡到PVDF膜上?？赏茰y出下列N末端氨基酸序列Leu-Pro-Ile-Pro-Ala-Gln-Asn-，該序列相當于cDNA衍生的氨基酸序列的氨基酸殘基31-37。
因此推測在曲霉中表達時植酸酶的成熟氨基酸序列是SEQ ID No.2的氨基酸31-439。實施例3當存在于粗發(fā)酵液的上清中時，Peniophora lycii植酸酶的特征鑒定對粗培養(yǎng)物發(fā)酵液的上清進行下列特征鑒定。
植酸酶活性測定將每份植酸酶樣品的各20μl兩等份樣品加到100μl植酸中(0.1M乙酸鈉緩沖液(pH5.5)中的5mM植酸鈉)。
在時間T=0分鐘時向參考樣品中加入100μl鐵試劑(1.1gFeSO4·7H2O在15ml鉬酸銨溶液(2.5g(NH4)6MO7O24·4H2O和8mlH2SO4，用水稀釋到250ml))。將參考混合物37℃保溫5分鐘。然后于750nm處以分光光度法檢測藍色強度。
將酶樣品37℃保溫30分鐘。于T=30分鐘時加入100μl鐵試劑。37℃保溫樣品5分鐘并于750nm進行分光光度檢測。以酶樣品和參考樣品之間的差異作為相對于磷酸鹽校正曲線的所釋放之磷酸鹽的量的指標。
溫度穩(wěn)定性在下表中指出的溫度下將酶樣品預保溫20分鐘，然后冷卻至室溫并檢測殘留活性，借以檢測植酸酶的穩(wěn)定性。
所得到的相對于26℃保溫20分鐘后的殘留活性的檢測結果也示于下表中。<
<p>最適pH還使用上述植酸酶活性檢測法檢測粗培養(yǎng)物發(fā)酵液上清的pH分布曲線。在下列緩沖液中制備5mM植酸溶液pH3.0(0.1M甘氨酸/HCl)、pH4.0(0.1M乙酸鈉)、pH5.0(乙酸鈉)、pH5.5(乙酸鈉)、pH6.0(50mMMES)、pH7.0(0.1M Tris-HCL)、pH8.0(0.1M Tris-HCl)、pH9.0(0.1M甘氨酸/NaOH)。
結果以相對值示于下表中，指數100代表pH5.0時的活性。
實施例4純化的Peniophora lycii植酸酶的特征鑒定按實施例2中所述方法在曲霉中表達并純化Peniophora lycii的植酸酶。
使用下述檢測法檢測植酸酶活性將10μl稀釋的酶樣品(在0.1M乙酸鈉、0.01％Tween20,pH5.5中稀釋)加到溶于0.1M乙酸鈉、0.01％Tween20,pH5.5的250μl植酸鈉(Sigma)中(溶解植酸鈉后調整pH；預加熱底物)，并于37℃保溫30分鐘。加入250μl10％TCA以終止反應，并加入500μl溶于100ml鉬酸鹽試劑(2.5g(NH4)6Mo7O24·4H2O加在8ml H2SO4中，稀釋到250ml)中的7.3g FeSO4的溶液以檢測游離磷酸鹽。在96孔微量滴定板中檢測200μl樣品的750nm吸光率。實驗中包括底物和酶空白對照，還包括磷酸鹽標準曲線(0-2mM磷酸鹽)。1FYT等于在給定的條件下每分鐘釋放1μmol磷酸鹽所需的酶量。
在不同溫度(預加熱底物)下進行檢測，以得到溫度分布型。
在檢測殘留活性之前于不同溫度下預保溫溶于0.1M磷酸鈉(pH5.5)中的植酸酶，以研究溫度穩(wěn)定性。
將酶于pH3(25mM甘氨酸/HCl)、pH4-5(25mM乙酸鈉)、pH6(25mM MES)、pH7-9(25mM Tris-HCl)條件下40℃保溫1小時，然后檢測殘留活性，以測定pH穩(wěn)定性。
使用同樣的緩沖系統(tǒng)(50mM，當溶解底物時重新調整pH)，在不同pH條件下進行檢測，得到pH分布型。
上述pH分布型、pH穩(wěn)定性、溫度分布型和溫度穩(wěn)定性研究的結果分別示于圖1、2、3和4中。
從圖1可以看出，Peniophora lycii的植酸酶在pH3-6時具有合理的活性(即最大活性的40％以上)。在pH3.5-5.5時見有60％以上的最大活性，pH3.8-5.0時為最大活性的90％以上。最適pH似乎在pH4-5范圍內。
從圖2可以看出，在pH3-9的整個范圍內，40℃保溫1小時后Peniophora lycii的植酸酶是很穩(wěn)定的(為保留最大活性的80％以上)。
就溫度分布型而言，從圖3可以看出，在30-65℃溫度范圍內，Peniophora lycii植酸酶具有合理的活性(即最大活性的60％以上)，而在35-62℃時，活性為最大活性的70％以上，并且最適溫度可能接近50℃。
最后，就圖4所示的溫度穩(wěn)定性來說，本發(fā)明的植酸酶在0至大約50℃時是很穩(wěn)定的(即有90％以上的殘留活性)。在50℃以上預保溫后，可見殘留活性有一定的降低。但無論如何，在60-80℃時仍保留大約50-60％的殘留活性。
這一事實可能是由于在酶經過熱變性后能夠很好地重新折疊。重新折疊的程度將取決于準確的條件(pH、酶濃度)。
圖5顯示對隔孢伏革菌植酸酶所作差式掃描量熱法(DSC)檢測的結果。
在DSC中，相對于參考小室，測得樣品小室中的熱消耗保持一個恒定的溫度增加。保持了恒定的加熱率(如90℃/小時)。由于轉移到小室中的熱量增加，以保持恒定溫度增加，從而觀察到吸熱過程(熱消耗過程-例如酶/蛋白質的解折疊)。
使用MicroCal的MC2裝置進行DSC檢測。在以90℃/小時的掃描速率掃描到90℃之前于20℃將小室平衡20分鐘。裝添溶于0.1M乙酸鈉(pH5.5)中的約2.5mg/ml的隔孢伏革菌植酸酶樣品。
DSC進一步證實了溫度穩(wěn)定性研究結果，因為從圖5可以看出，隔孢伏革菌植酸酶在pH5.5時具有大約60℃的變性或“熔解”溫度。實施例4a隔孢伏革菌植酸酶比活性的檢測對高度純化的植酸酶樣品(提前在顯示只存在一種成分的SDS聚丙烯酰胺凝膠上檢查純度)進行比活性檢測。
以下述氨基酸分析法測定植酸酶樣品中的蛋白質濃度于110℃，在抽真空的玻璃管中用6NHCl,0.1％苯酚水解植酸酶的等分樣品。使用按說明書操作的Applied Biosystems 420A氨基酸分析系統(tǒng)定量分析所得到的氨基酸。可根據測得的氨基酸量計算出水解的等分樣品中蛋白質的總質量，以及濃度。
以FYT單位確定活性。1FYT等于于pH5.5和37℃條件下每分鐘從植酸鹽(5mM)中釋放1μmol無機磷酸鹽所需酶量；檢測法參見實施例4。
計算的比活性為987FYT/mg酶蛋白。實施例5以1H NMR光譜法定時分辨的植酸酶催化植酸水解的產物分布圖形在24小時過程中，以1H NMR法繪制產品混合物分布圖，以研究由隔孢伏革菌植酸酶和市售黑曲霉植酸酶(Phytase Novo)催化的植酸(PA)水解(27mM植酸鹽，1FYT/ml,pH5.5和3.5，和27℃)。
下文中Ins(p、q、r、…)Pn代表攜帶總共n個連接到位置p、q、r、…上的磷酸基團的肌醇。為方便起見將Ins(1,2,3,4,5,6)P6(植酸)簡寫為PA。詳細說明請參見本申請一般描述部分中“植酸酶的命名和位置特異性”一節(jié)。
該技術提供關于酶在PA分子上攻擊起始點的特定信息和關于認定終產物的信息。在其他方面，反映中間產物混合物組成之峰值的推定圖形為鑒定個別酶之間的相似性和差異提供定性手段，即指紋檢測。
NMR如大多數其他分析方法一樣，可區(qū)分不是鏡像的立體異構體(非對映體)，但不能區(qū)分一組是鏡像的異構體(對映體)，因為它們表現有相同的NMR光譜。
因此，Ins(1,2,4,5,6)P5(除去了3-磷酸)表現有不同于Ins(1,2,3,4,5)P5(除去了6-磷酸)的NMR光譜(由于這些異構體是非對映體)。
但由于Ins(1,2,4,5,6)P5和Ins(2,3,4,5,6)P5(除去了1-磷酸)是對映異構體，所以兩者的NMR光譜是完全相同的。Ins(1,2,3,4,5)P5和Ins(1,2,3,5,6)P5(除去了4-磷酸)這一對異構體也是這種情況。
因此單靠NMR不可能區(qū)分3-和1-植酸酶，并且不可能區(qū)分6-和4-植酸酶(或使用最低位標規(guī)則的L-6-和D-6-植酸酶)。
與文獻中對3-和6-植酸酶的描述不同，我們已將術語3-和6-植酸酶用于定義我們的酶，盡管不大可能，但我們并不真正知道是否還有1-和4-植酸酶。
實驗在配有5mm選擇性倒轉探頭的Bruker DRX400裝置上于300K(27℃)記錄NMR光譜。使用由8K數據點覆蓋的2003Hz(5ppm)掃描寬度累積4個模擬掃描之前的16個掃描。經3秒預飽和期間達到殘留HOD共振的衰減。光譜涉及HOD信號(δ4.70)。
按下述方法制備用于NMR分析的PA樣品將PA(100mg，植酸二鉀鹽，Sigma P-5681)溶解于去離子水(4.0ml)中并加入NaOH水溶液(4N)將pH調到5.5或3.5。加入去離子水(加至5ml)，將各相當于20mg植酸的1ml部分轉入螺旋帽小瓶中并蒸發(fā)(真空離心)除去溶劑。將干燥樣品溶解于氧化氘(2ml,Merck99.5％D)中并再次蒸發(fā)至干(貯存于-18℃?zhèn)溆?。
為了進行NMR分析，將一份20mg植酸樣品溶解于氧化氘(1.0ml，Merck99.95％D)中。將溶液轉移到NMR管中并記錄1H NMR光譜。加入酶溶液(1FTU，根據需要用氧化氘溶解/稀釋)，然后徹底混合(1分鐘)。加入酶后立即(t=0)及5、10、15、20、25、30、45、60、75、90、105、120、135、150、165、180、195、210分鐘(=3.5小時)和4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、11.5、13.5、15.5、17.5、19.5、21.5和23.5小時后記錄1H NMR光譜。檢測NMR管中的pH。48和120小時(5天)后獲得附加光譜，其中加入一部分底物(PA,6mg)以探查酶是否保留其催化活性。
借助對部分消化PA所得到的磷酸肌醇酯混合物的2D NMR分析，結合已公布的NMR數據(Scholz,p.；Bergmann,G.，和Mayr,G.W.,Methods in Inositide Research(Ed.Irvine,R.F.),PP.65-82,Raven出版有限公司，紐約(1990))，鑒定貢獻于Ins(1,2,3,4,5,6)P6(PA)、Ins(1,2,4,5,6)P5、Ins(1,2,3,4,5)P5、Ins(1,2,5,6)P4、Ins(1,2,6)P3、Ins(1,2)P2和Ins(2)P的特征性1HNMR信號，并允許在反應過程中相對量化這些衍生物。
圖6和圖7中分別給出了在pH5.5條件下，24小時反應時間內曲霉植酸酶和隔孢伏革菌植酸酶產物分布型的疊層曲線。
δ3.25(t)處的信號代表Ins(1,2)P2中的H-5，而δ3.18(t)處的信號則代表Ins(2)P中的H-5。用曲霉植酸酶約反應4小時后和用隔孢伏革菌植酸酶約反應1小時后Ins(1,2)P2開始聚積。用曲霉植酸酶約反應10小時后和用隔孢伏革菌植酸酶反應約3小時后觀察到Ins(2)P。反應24小時后Ins(1,2)P2的量或水平對于兩種植酸酶來說都很低，而24小時后對于兩種植酸酶來說Ins(2)P的量最大。
因此，反應24小時后觀察到的分布型證明兩種植酸酶均將PA降解成Ins(2)P。
對于兩種酶，24小時的反應混合物除含有Ins(2)P外還含有很小量Ins(1,2)P2。延長反應時間(數日)導致了殘留的Ins(1,2)P2的消失，但完全未見有徹底去磷酸化的肌醇(Ins)。酶的不可逆抑制作用/變性作用不能解釋這一觀察結果，因為如根據其在室溫下保存5天后仍能消化加到NMR管中的新鮮PA的能力所證明的，酶長時間保留了它們的催化活性。
現在轉向圖8和9，這些圖更詳細地描繪初始4.5小時期間(pH5.5)演化的分布圖。從圖10推論出Ins(1,2,4,5,6)P5(指定為A)中的H-3顯示δ3.66(dd)處的信號，Ins(1,2,3,4,5)P5(B)中的H-6顯示δ3.87(t)處的信號，Ins(1,2,5,6)P4(C)中的H-3則顯示δ3.56(dd)處的信號。這樣，化合物A即相當已被水解的位置3中的磷酸，化合物B相當于位置6中的磷酸，而C則相當于位置3和4中的磷酸。
從圖8中可以看出，化合物A表現為使用曲霉植酸酶得到的主要基本產物(t=5分鐘)，而化合物B則未出現?；衔顲在20-25分鐘后出現。
從圖9(隔孢伏革菌植酸酶)可推論出，化合物B是作為使用隔孢伏革菌植酸酶得到的主要基本產物(t=5分鐘)出現的。
δ4.82(dt,H-2)、4.38(q,H-4/H-6)、4.13(q,H-5)和4.11(dt,H1/H3)處的信號可歸因于底物植酸(PA)。比較圖8和9可以看出，用隔孢伏革菌植酸酶比用曲霉植酸酶使這些峰更快地縮小。
這些差異在圖10a中特別明顯，其給出在pH5.5反應20分鐘后觀察到的分布圖形，指出了標示的判定信號(A、B、C)。
圖10b顯示于pH5.5水解植酸(即相當于圖6和7的上行)的最后結果(在這些條件下)。在上方隔孢伏革菌實例中標出的所有信號均代表化合物Ins(2)P，即其質子，從右至左H-5、H1和H3、H4和H6，最后是H-2。相對強度1∶2∶2∶1。在下方曲霉實例上發(fā)現有相應的信號。這意味著兩實例中的終產物都是Ins(2)P。但兩實例中也檢測到很小量Ins(1,2)P2，只在曲霉實例處指出相應的峰。
觀察到的顯著差異曲霉鑒定初始主產物為Ins(1,2,4,5,6)P5(A)然后出現Ins(1,2,5,6)P4(C)和Ins(1,2,6)P3(D)(11/2小時后在δ3.49(dd)處的H-3)，此相當于連續(xù)去除3-、4-和5-位中的磷酸基團。Ins(1,2)P2(E)的濃度在4小時起始緩慢升高并在12和14小時間很陡峭地降低，伴隨有Ins(2)P(F)水平的迅速增加。這一點在圖11中可以看出，如通過檢測分別相當于Ins(1,2)P2(δ3.25(t))和Ins(2)P(δ3.18(t))中H-5的信號下的面積(相對于相應底物信號(t=0)下的面積)所確定的，其分別代表Ins(1,2)P2和Ins(2)P的時間依賴性濃度。
隔孢伏革菌在pH5.5時，只有6位開始受到攻擊。征象性特點是與曲霉植酸酶相比，PA以更快的速度被消化。其他征象性特點是終產物，Ins(2)P(F)出現很早(3小時)并緩慢升高，與用曲霉植酸酶觀察到的反應將結束時Ins(2)P水平很快增加相反。
圖10c是與圖10a相似的作圖，但是在pH3.5條件下記錄的。令人驚奇的是，在此pH時隔孢伏革菌植酸酶轉向對PA的6-及3-位有高初始親合性(觀察B及A)，此可能對6位稍有偏愛。
所產生的數據尤其可得出下列結論在pHS.5及3.5時，曲霉植酸酶以高度選擇性在3位攻擊PA，而隔孢伏革菌植酸酶在pH5.5時以高度選擇性在6位攻擊PA，但在pH3.5時它似乎以差不多的速度在3和6位上水解磷酸鹽基團。
在pH5.5時，與曲霉植酸酶相比，隔孢伏革菌植酸酶以更快的速率消化PA。
在pH3.5及5.5時，在所應用的條件下，終產物是Ins(2)P(F)。
整體反應速率(PA→Ins(2)P)是可比較的，約為20小時(圖11，pHS.5)。
因此，曲霉植酸酶證明是基本上純凈的3-植酸酶，而隔孢伏革菌植酸酶在pH5.5時似乎是基本上純凈的6-植酸酶，并且在pH3.5時為迄今未知類型的植酸酶，即3+6-植酸酶。實施例6曲霉和隔孢伏革菌植酸酶從玉米中釋放無機磷酸鹽的比較試驗本實施例給出在pH3.5和5.5條件下，植酸酶催化的從玉米中釋放三價磷的簡單試驗。兩個參數已集中于速度和磷釋放的水平上。
材料和方法玉米得自北卡羅來納州立大學(樣品號R27)并在粉碎機(BuhlerUniversal)(點6.8處)上磨碎。
將20g磨碎的玉米稱入250ml藍帽瓶中并加入100ml緩沖液以制備玉米懸液(16.7％w/w)。所使用的緩沖液是pH5.5,0.22M乙酸鹽緩沖液。用8N HCl/NaOH將pH值調到3.5。
試驗的酶試驗兩種植酸酶市售的黑曲霉植酸酶(Phytase Novo)和按實施例3和4中所述方法純化的本發(fā)明的隔孢伏革菌植酸酶。
劑量所有的酶均以25FYT/20g玉米(相當于1250FYT/kg)應用。
用帽密閉合玉米懸液的瓶子，立即放在37℃水浴中并持續(xù)攪拌。在此階段測pH并在24小時后再次測pH。攪拌30分鐘后收集5ml樣品。
然后以25FYT/20g玉米的劑量加入植酸酶。
加入植酸酶后5、10、15、20、25、30、40、50、60和120分鐘時收集樣品并按下述方法測定所釋放的P的量在緩沖液中1∶4稀釋含植酸酶的樣品。然后以3,000rpm將樣品離心5分鐘，并收集1.0ml上清液。加入2.0ml緩沖液和2.0ml MoV終止溶液(參見實施例6的FYT檢測法)。將樣品放在3-5℃冰箱中直到可于415nm進行分光光度檢測。于0和20小時檢測pH。
為了進行檢測，制備所使用的磷酸鹽標準品和貯備溶液。使用緩沖液將0.5、1.0、1.5和2.0ml原液稀釋到50ml總體積。將3.0ml各溶液加入2.0ml MoV終止溶液。
在pH5.5和pH3.5時進行兩次實驗。圖12和13(分別為pH5.5和3.5)顯示了分析結果。這些附圖中，符號“◆”代表對照實驗，“▲”代表隔孢伏革菌植酸酶，“■”代表曲霉植酸酶。
結果和討論圖12(pH5.5)顯示，在此pH下，與曲霉植酸酶相比，隔孢伏革菌植酸酶以明顯改善的速率從玉米中釋放P。
從圖13(pH3.5)可以看出，在此pH下隔孢伏革菌植酸酶從磨碎的玉米中釋放三價磷的速度比曲霉植酸酶(0-120分鐘)快得多。
例如無論pH高低，雞/雛雞消化系統(tǒng)的通過時間正常情況下是30分鐘至2小時數量級的，所以觀察到的差異是有一定重要性的。不過3.5pH值在這方面比pH5.5值更為相關。
這就說明，在例如肉用仔雞的消化系統(tǒng)中，作為P釋放劑，隔孢伏革菌酶顯然比已知的曲霉植酸酶更為有效。
序列表SEQ ID No.1顯示本發(fā)明的克隆的DNA序列，包括編碼有植酸酶活性之酶的DNA序列。(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度1320堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅵ)來源(A)生物體Peniophora lycii(B)菌株 CBS 686.96(ⅸ)特征(A)名稱/鍵CDS(B)定位1..1320(xⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:ATG GTT TCT TCG GCA TTC GCA CCT TCC ATC CTA CTT AGC TTG ATG TCG 48Met Val Ser Ser Ala Phe Ala Pro Ser Ile Leu Leu Ser Leu Met Ser1 5 10 15AGT CTT GCT TTG AGC ACG CAG TTC AGC TTT GTT GCG GCG CAG CTA CCT 96Ser Leu Ala Leu Ser Thr Gln Phe Ser Phe Val Ala Ala Gln Leu Pro20 25 30ATC CCC GCA CAA AAC ACA AGT AAT TGG GGG CCT TAC GAT CCC TTC TTT144Ile Pro Ala Gln Asn Thr Ser Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Pro Phe Phe35 40 45CCC GTC GAA CCG TAT GCA GCT CCG CCG GAA GGG TGC ACA GTG ACA CAG 192Pro Val Glu Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Glu Gly Cys Thr Val Thr Gln50 55 60GTC AAC CTG ATT CAG AGG CAC GGC GCG CGT TGG CCC ACA TCC GGC GCG 240Val Asn Leu Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Trp Pro Thr Ser Gly Ala65 70 75 80CGG TCG CGG CAG GTC GCC GCC GTA GCG AAG ATA CAA ATG GCG CGA CCA 288Arg Ser Arg Gln Val Ala Ala Val Ala Lys Ile Gln Met Ala Arg Pro85 90 95TTC ACG GAT CCC AAG TAT GAG TTC CTC AAC GAC TTC GTG TAC AAG TTC 336Phe Thr Asp Pro Lys Tyr Glu Phe Leu Asn Asp Phe Val Tyr Lys Phe100 105 110GGC GTC GCC GAT CTG CTA CCG TTC GGG GCT AAC CAA TCG CAC CAA ACC 384Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Phe Gly Ala Asn Gln Ser His Gln Thr115 120 125GGC ACC GAT ATG TAT ACG CGC TAC AGT ACA CTA TTT GAG GGC GGG GAT 432Gly Thr Asp Met Tyr Thr Arg Tyr Ser Thr Leu Phe Glu Gly Gly Asp130 135 140GTA CCC TTT GTG CGC GCG GCT GGT GAC CAA CGC GTC GTT GAC TCC TCG 480Val Pro Phe Val Arg Ala Ala Gly Asp Gln Arg Val Val Asp Ser Ser145 150 155 160ACG AAC TGG ACG GCA GGC TTT GGC GAT GCT TCT GGC GAG ACT GTT CTC 528Thr Asn Trp Thr Ala Gly Phe Gly Asp Ala Ser Gly Glu Thr Val Leu165 170 175CCG ACG CTC CAG GTT GTG CTT CAA GAA GAG GGG AAC TGC ACG CTC TGC 576Pro Thr Leu Gln Val Val Leu Gln Glu Glu Gly Asn Cys Thr Leu Cys180 185 190AAT AAT ATG TGC CCG AAT GAA GTG GAT GGT GAC GAA TCC ACA ACG TGG 624Asn Asn Met Cys Pro Asn Glu Val Asp Gly Asp Glu Ser Thr Thr Trp195 200 205CTG GGG GTC TTT GCG CCG AAC ATC ACC GCG CGA TTG AAC GCT GCT GCG 672Leu Gly Val Phe Ala Pro Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala Ala210 215 220CCG AGT GCC AAC CTC TCA GAC AGC GAC GCG CTC ACT CTC ATG GAT ATG 720Pro Ser Ala Asn Leu Ser Asp Ser Asp Ala Leu Thr Leu Met Asp Met225 230 235 240TGC CCG TTC GAC ACT CTC AGC TCC GGG AAC GCC AGC CCC TTC TGT GAC 768Cys Pro Phe Asp Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ala Ser Pro Phe Cys Asp245 250 255CTA TTT ACC GCG GAG GAG TAT GTG TCG TAC GAG TAC TAC TAT GAC CTC 816Leu Phe Thr Ala Glu Glu Tyr Val Ser Tyr Glu Tyr Tyr Tyr Asp Leu260 265 270GAC AAG TAC TAT GGC ACG GGC CCC GGG AAC GCT CTC GGT CCT GTC CAG 864Asp Lys Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Gly Asn Ala Leu Gly Pro Val Gln275 280 285GGC GTC GGA TAC GTC AAT GAG CTG CTT GCA CGC TTG ACC GGC CAA GCC 912Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Gly Gln Ala290 295 300GTT CGA GAC GAG ACG CAG ACG AAC CGC ACG CTC GAC AGC GAC CCT GCA 960Val Arg Asp Glu Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Asp Pro Ala305 310 315 320ACA TTC CCG CTG AAC CGT ACG TTC TAC GCC GAC TTC TCG CAT GAT AAC 1008Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn325 330 335ACC ATG GTG CCC ATC TTT GCG GCG CTC GGG CTC TTC AAC GCC ACC GCC 1056Thr Met Val Pro Ile Phe Ala Ala Leu Gly Leu Phe Asn Ala Thr Ala340 345 350CTC GAC CCG CTG AAG CCC GAC GAG AAC AGG TTG TGG GTG GAC TCT AAG 1104Leu Asp Pro Leu Lys Pro Asp Glu Asn Arg Leu Trp Val Asp Ser Lys355 360 365CTG GTA CCG TTC TCT GGA CAT ATG ACG GTC GAG AAG CTG GCA TGT TCT 1152Leu Val Pro Phe Ser Gly His Met Thr Val Glu Lys Leu Ala Cys Ser370 375 380GGG AAG GAG GCG GTC AGG GTG CTC GTG AAC GAC GCG GTG CAG CCG CTG 1200Gly Lys Glu Ala Val Arg Val Leu Val Asn Asp Ala Val Gln Pro Leu385 390 395 400GAG TTC TGC GGA GGT GTT GAT GGG GTG TGC GAG CTT TCG GCT TTC GTA 1248Glu Phe Cys Gly Gly Val Asp Gly Val Cys Glu Leu Ser Ala Phe Val405 410 415GAG AGC CAG ACG TAT GCG CGG GAG AAT GGG CAA GGC GAC TTC GCC AAG 1296Glu Ser Gln Thr Tyr Ala Arg Glu Asn Gly Gln Gly Asp Phe Ala Lys420 425 430TGC GGC TTT GTT CCG TCG GAA TAG 1320Cys Gly Phe Val Pro Ser Glu *435 440SEQ ID No.2顯示本發(fā)明植酸酶的氨基酸序列。2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特征(A)長度439個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Val Ser Ser Ala Phe Ala Pro Ser Ile Leu Leu Ser Leu Met Ser1 5 10 15Ser Leu Ala Leu Ser Thr Gln Phe Ser Phe Val Ala Ala Gln Leu Pro20 25 30Ile Pro Ala Gln Asn Thr Ser Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Pro Phe Phe35 40 45Pro Val Glu Pro Tyr Ala Ala Pro Pro Glu Gly Cys Thr Val Thr Gln50 55 60Val Asn Leu Ile Gln Arg His Gly Ala Arg Trp Pro Thr Ser Gly Ala65 70 75 80Arg Ser Arg Gln Val Ala Ala Val Ala Lys Ile Gln Met Ala Arg Pro85 90 95Phe Thr Asp Pro Lys Tyr Glu Phe Leu Asn Asp Phe Val Tyr Lys Phe100 105 110Gly Val Ala Asp Leu Leu Pro Phe Gly Ala Asn Gln Ser His Gln Thr115 120 125Gly Thr Asp Met Tyr Thr Arg Tyr Ser Thr Leu Phe Glu Gly Gly Asp130 135 140Val Pro Phe Val Arg Ala Ala Gly Asp Gln Arg Val Val Asp Ser Ser145 150 155 160Thr Asn Trp Thr Ala Gly Phe Gly Asp Ala Ser Gly Glu Thr Val Leu165 170 175Pro Thr Leu Gln val Val Leu Gln Glu Glu Gly Asn Cys Thr Leu Cys180 185 190Asn Asn Met Cys Pro Asn Glu Val Asp Gly Asp Glu Ser Thr Thr Trp195 200 205Leu Gly Val Phe Ala Pro Asn Ile Thr Ala Arg Leu Asn Ala Ala Ala210 215 220Pro Ser Ala Asn Leu Ser Asp Ser Asp Ala Leu Thr Leu Met Asp Met225 230 235 240Cys Pro Phe Asp Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ala Ser Pro Phe Cys Asp245 250 255Leu Phe Thr Ala Glu Glu Tyr Val Ser Tyr Glu Tyr Tyr Tyr Asp Leu260 265 270Asp Lys Tyr Tyr Gly Thr Gly Pro Gly Asn Ala Leu Gly Pro Val Gln275 280 285Gly Val Gly Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Gly Gln Ala290 295 300Val Arg Asp Glu Thr Gln Thr Asn Arg Thr Leu Asp Ser Asp Pro Ala305 310 315 320Thr Phe Pro Leu Asn Arg Thr Phe Tyr Ala Asp Phe Ser His Asp Asn325 330 335Thr Met Val Pro Ile Phe Ala Ala Leu Gly Leu Phe Asn Ala Thr Ala340 345 350Leu Asp Pro Leu Lys Pro Asp Glu Asn Arg Leu Trp Val Asp Ser Lys355 360 365Leu Val Pro Phe Ser Gly His Met Thr Val Glu Lys Leu Ala Cys Ser370 375 380Gly Lys Glu Ala Val Arg Val Leu Val Asn Asp Ala Val Gln Pro Leu385 390 395 400Glu Phe Cys Gly Gly Val Asp Gly Val Cys Glu Leu Ser Ala Phe Val405 410 415Glu Ser Gln Thr Tyr Ala Arg Glu Asn Gly Gln Gly Asp Phe Ala Lys420 425 430Cys Gly Phe Val Pro Ser Glu*435 440
權利要求
1．表現有植酸酶活性的，并包括SEQ ID NO:2之氨基酸序列，或與該序列至少70％同源的氨基酸序列的分離的多肽。
2．表現有植酸酶活性的，并包括SEQ ID NO:2之氨基酸序號31至439的氨基酸序列，或包括至少與該序列70％同源的氨基酸序列的分離的多肽。
3．表現有植酸酶活性并由下列序列的植酸酶編碼部分編碼的分離的多肽ⅰ)SEQ ID NO:1，或ⅱ)克隆到存在于大腸桿菌DSM11312中之質粒pYES2.0中的DNA序列，或與所說的多肽至少70％同源的類似物或衍生物。
4．編碼有植酸酶活性的多肽的分離的DNA序列，所說的DNA序列選自于(a)SEQ ID NO:1的植酸酶編碼部分；(b)克隆到存在于大腸桿菌DSM11312中之質粒pYES2.0中的DNA序列的植酸酶編碼部分；(c)(a)或(b)中限定的DNA序列的至少與所說的DNA序列70％同源的類似物；(d)能夠在中度/高度嚴格性條件下與(a)或(b)的DNA序列雜交的DNA序列；(e)由于遺傳密碼的簡并性而不與(a)或(b)的序列雜交的，但編碼包括SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列之多肽的DNA序列。
5．包含根據權利要求4之克隆的DNA序列的載體。
6．包含根據權利要求4之克隆的DNA序列或根據權利要求5之載體的宿主細胞。
7．制備有植酸酶活性的多肽的方法，該方法包括在得以產生該多肽的條件下培養(yǎng)根據權利要求6的細胞，并從培養(yǎng)液中回收該多肽。
8．包含權利要求1-3中任何一項的至少一種多肽的飼料或食品。
9．制備根據權利要求8的飼料或食品的方法，其中在食品或飼養(yǎng)成分中加入至少一種多肽。
10．包含權利要求1-3之任一項的多肽的組合物。
11．適用于食品或飼料制品中的根據權利要求10的組合物。
12．根據權利要求10-11之任一項的組合物，其為動物飼料添加劑。
13．降低動物糞尿中植酸鹽水平的方法，包括用有效量的根據權利要求8的，或可按照權利要求9的方法得到的飼料喂飼動物。
14．權利要求1-3中任何一項的多肽用于從植酸中釋放無機磷酸鹽的應用。
15．權利要求1-3中任何一項的多肽或權利要求10-12中任何一項的組合物用于改善食品或飼料利用率的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及表現有植酸酶活性的分離的多肽、相應的克隆的DNA序列、制備該多肽的方法,及其在許多工業(yè)用途中,特別是在動物飼料中的應用。新的植酸酶衍生于Peniophora lycii并具有某些令人感興趣的特征,例如對植酸的6－位有高的初始親和性、從植酸中釋放磷酸鹽的高初始速率,以及特別高的比活性。
文檔編號C12R1/69GK1234070SQ97199018
公開日1999年11月3日 申請日期1997年12月10日 優(yōu)先權日1996年12月20日
發(fā)明者S·F·拉森, L·比克, C·C·夫格桑, J·布林霍特, A·奧赫曼, P·R·奧斯特加德 申請人:諾沃挪第克公司