一種葉酸和細菌纖維素共同修飾的羧化石墨烯氧化物及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于抗癌藥物靶向傳遞技術領域，具體涉及一種葉酸和細菌纖維素共同修飾的石墨烯氧化物及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002]目前癌癥已成為威脅人類健康的頭號殺手，其診斷與治療方法引起了醫(yī)學和生物界的廣泛關注。治療癌癥的方法主要是采用化學藥物治療，但是化療藥物在遏制了腫瘤組織生長的同時，對周圍正常組織會產生嚴重的毒副作用，給病患帶來極大的痛苦。因此，醫(yī)學界探索出一種定向給藥的載體系統(tǒng)，克服了傳統(tǒng)化學藥物治療對正常組織產生嚴重毒副作用，且對腫瘤靶向治療效果不明顯的缺點。其中，非共價藥物載體具有良好的緩釋效果、能夠降低藥物的毒副作用、不會破壞藥物結構等優(yōu)點，而成為靶向給藥的優(yōu)良載體。非共價藥物載體包括脂質體、無機納米粒子、囊泡以及碳納米材料等。石墨稀氧化物一種碳納米材料，由于其材料成本低、合成方便、與含共軛基團藥物非共價作用力強、載藥量大以及生物相容性好、低毒性等優(yōu)點成為當前研宄的熱門載體材料。
[0003]但是，石墨烯氧化物用于生物醫(yī)藥領域仍舊存在一定的細胞毒性，因此需對其進行生物相容性修飾以進一步降低潛在的細胞毒性。目前用于生物相容性修飾的材料有很多，無機化合物包括金、銀、鈀、銅、鉑等金屬納米粒，氧化鋅、四氧化三鐵、二氧化錫、氧化鈷、氧化錳、氧化銅等金屬氧化物納米粒，硅、介孔生物活性玻璃等非金屬納米粒子，有機化合物包括聚乳酸-羥基乙酸納米微球、聚乳酸納米微球、脂質體、明膠納米球、微凝膠聚乙二醇胺、聚多巴胺、纖維素等有機高分子納米粒。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明需要解決的技術問題是提供一種葉酸和細菌纖維素共同修飾的羧化石墨烯氧化物。
[0005]本發(fā)明還要解決的技術問題是提供上述葉酸和細菌纖維素共同修飾的羧化石墨烯氧化物的制備方法。
[0006]本發(fā)明最后要解決的技術問題是提供上述葉酸和細菌纖維素共同修飾的羧化石墨烯氧化物作為藥物載體在制備抗癌納米復合物中的應用。
[0007]為解決以上技術問題，本發(fā)明采用如下技術方案:
[0008]一種葉酸和細菌纖維素共同修飾的羧化石墨烯氧化物的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0009](I)細菌纖維素修飾的羧化石墨烯氧化物的制備:
[0010](Ia)將羧化石墨烯氧化物溶解于水中，超聲處理，得到納米羧化石墨烯氧化物的分散液；
[0011](Ib)將步驟(Ia)得到的納米羧化石墨烯氧化物的分散液與細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基以體積比1:5?10比例混合，得到含有納米羧化石墨烯氧化物的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基;
[0012](Ic)將細菌纖維素生產菌接種到步驟(Ib)得到的含有納米羧化石墨烯氧化物的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后發(fā)酵，發(fā)酵結束后，離心收集上清，再對上清超濾處理，得到純凈的細菌纖維素修飾的石墨烯氧化物溶液；
[0013](2)葉酸和細菌纖維素共同修飾的石墨烯氧化物的制備:
[0014](2a)向步驟(Ic)得到的細菌纖維素修飾的石墨烯氧化物水溶液中加入葉酸溶液，其中，葉酸溶液與細菌纖維素修飾的石墨烯氧化物水溶液的比例為10?200:1，攪拌均勻，得到混合體系a;
[0015](2b)向步驟(2a)得到的混合體系a中加入1-乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽，再超聲處理，得到混合體系b ;
[0016](2c)向步驟(2b)得到的混合體系b中加入N-羥基磺?；牾啺封c鹽，得到混合體系C，用濃鹽酸溶液調節(jié)pH為7.0?8.0，在室溫下避光攪拌，得到葉酸和細菌纖維素共同修飾的石墨烯氧化物粗品；
[0017](2d)將步驟(2c)得到的葉酸和細菌纖維素共同修飾的石墨烯氧化物粗品過濾，然后水洗，得到葉酸和細菌纖維素共同修飾的石墨烯氧化物純品。
[0018]其中，步驟(Ia)中，所述的納米羧化石墨烯氧化物的分散液，其中納米羧化石墨稀氧化物的濃度為0.1?1.0mg/ml，優(yōu)選為0.5?1.0mg/ml，最優(yōu)選為lmg/ml。
[0019]步驟(Ia)所述的超聲處理，其超聲條件為300?600W超聲0.5?2小時。
[0020]其中，步驟(Ib)中，所述的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為:甘露醇50?10g/L、大豆蛋白胨5?9g/L、十二水磷酸氫二鈉4?8g/L及醋酸3?5g/L，溶劑為水，pH為
5?8ο
[0021]其中，步驟(Ic)中，所述的細菌纖維素生產菌為木葡糖醋酸桿菌。
[0022]其中，步驟(Ic)中，所述的發(fā)酵，其發(fā)酵條件為溫度25?30°C，優(yōu)選28?30°C，發(fā)酵時間為I?12h，優(yōu)選I?3h。
[0023]其中，步驟(Ic)中，所述的細菌纖維素修飾的石墨烯氧化物水溶液，其中細菌纖維素修飾的石墨稀氧化物的濃度為0.1?1.0mg/ml，優(yōu)選為0.5?1.0mg/ml。
[0024]其中，步驟(2a)中，所述的葉酸溶液為葉酸與鈉離子的混合水溶液，其中，葉酸濃度為3_6mg/ml，優(yōu)選為5.5-6.0mg/ml ;鈉離子的濃度為0.1?0.5mol/L，優(yōu)選為0.1?0.2mol/L ;所述的鈉離子來源于氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉中的任意一種，優(yōu)選氫氧化鈉。
[0025]其中，步驟(2b)中，所述的混合體系b，其中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的濃度為2?5mg/ml，優(yōu)選為3?4mg/ml ；
[0026]其中，步驟(2c)中，所述的混合體系c，其N-羥基磺?；牾啺封c鹽的濃度為0.5 ?1.5mg/ml，優(yōu)選為 0.5 ?lmg/ml。
[0027]上述方法制備得到的葉酸和細菌纖維素共同修飾的羧化石墨烯氧化物在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0028]上述葉酸和細菌纖維素共同修飾的羧化石墨烯氧化物作為藥物載體在制備抗癌納米復合藥物中的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0029]有益效果:
[0030]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有以下優(yōu)勢:
[0031](I)利用葉酸和細菌纖維素共同修飾羧化石墨烯氧化物，降低了石墨烯氧化物對正常細胞的細胞毒性，，也提高了藥物對腫瘤細胞的細胞毒性。
[0032](2)利用本發(fā)明提供的葉酸和細菌纖維素共同修飾羧化石墨烯氧化物作為藥物載體，負載抗腫瘤藥物紫杉醇，能明顯降低毒副作用，增強藥物水溶性，提高藥物療效。
[0033](3)本發(fā)明還具有制備過程簡單、材料成本低等優(yōu)點，在癌癥定向治療方法應用上有很大前景。
【附圖說明】
[0034]圖1石墨烯氧化物的原子力顯微鏡圖。
[0035]圖2石墨烯氧化物的透射電子顯微鏡圖。
[0036]圖3藥物對卵巢癌細胞A2780的抑制效果圖。
[0037]圖4載體藥物靶向卵巢癌細胞A2780的效率圖。
[0038]圖5空白載體對正常細胞的抑制效果圖。
[0039]圖6葉酸和細菌纖維素共修飾載體藥物對卵巢癌細胞A2780的抑制效果圖。
【具體實施方式】
[0040]根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。
[0041]實施例1:石墨烯氧化物的制備。
[0042]石墨稀氧化物采用改善過的Hummer’s方法合成。
[0043]首先稱取1.0g石墨加入250mL兩頸圓底燒瓶中，再向其中加入23mL濃硫酸，以磁攪拌使二者充分混合；將此兩頸圓底燒瓶移入冰水浴中繼續(xù)攪拌，待混合液溫度降到10°C以下后，采用少量多次的辦法開始緩慢的向體系中加入固體高錳酸鉀3g，通過控制加入速度使混合液的溫度始終保持在20°C以下，加入完畢后，繼續(xù)于冰水浴中攪拌30min ;將反應體系升溫到35°C再反應30min至2小時；向圓底燒瓶中加入46ml蒸餾水后反應體系溫度迅速升高，將反應體系移入95°C油浴中反應溫度恒溫至95°C;在加入蒸餾水并恒溫30min后，再向體系中傾入140mL蒸餾水并加2.5mL雙氧水；將反應液過濾，收集固體物質，先以5%的鹽酸溶液多次洗滌后，再以蒸餾水反復洗至溶液中性，最后以純凈水滲析一周，所得溶液自然干燥或冷凍干燥得到氧化石墨；將得到的石墨烯氧化物以磁攪拌分散于水中后，超聲4小時或更長時間，得到石墨烯氧化物的水溶液。
[0044]實施例2:羧化石墨烯氧化物的制備。
[0045]將得到的石墨烯氧化物50mg置于50ml水中，在500?600W條件下超聲2?3小時，得到納米石墨烯氧化物的水懸浮液；向該納米石墨烯氧化物的水懸浮液中加入氫氧化鈉1.2g、一氯乙酸鈉濃度為1.0mg/ml的水溶液，在500W條件下超聲3?4小時，得到羧化石墨烯氧化物粗產品；再將該粗產品反復漂洗過濾純化得到純凈的羧化石墨烯氧化物。
[0046]實施例3:細菌纖維素修飾載體。
[0047](I)配制細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基
[0048]取50mg羧化石墨稀氧化物加入50ml無菌水中，于500?600W超聲0.2?I小時得到納米羧化石墨烯氧化物分散液。
[0049]配制含甘露醇100g/L、大豆蛋白胨9g/L、十二水磷酸氫二鈉8g/L及醋酸5g/L的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0050]將兩者以體積比為1:5?10比例混合，即得含羧化石墨烯氧化物的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0051](2)制備細菌纖維素修飾的羧化石墨烯氧化物。
[0052]將新活化木葡糖醋酸桿菌(購自ATCC，該菌的編號為ATCC 23769)按照體積比5-10%轉接到上述含羧化石墨烯氧化物的細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C條件下，以150rpm，發(fā)酵培養(yǎng)I?12h，發(fā)酵結束后離心收集上清，然后將上清超濾，即得到純凈的細菌纖維素修飾的羧化