專利名稱：用持久的生物標(biāo)記測定對電離輻射劑的暴露的制作方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及測定受試者是否曾暴露于電離輻射的方法，測定中所用的生物指示劑，尤其是核酸指示劑，還涉及鑒定可用于測定對電離輻射之暴露的生物指示劑的方法。
暴露于電離輻射的潛在后果使得過去曾暴露于輻射的生物指示劑非常合乎需要。但在這點(diǎn)上常規(guī)方法所能獲得的過去暴露于的證據(jù)主要限于總體病理學(xué)或詳盡的證據(jù)，如處于暴露中的受試者在懷孕頭三個(gè)月出現(xiàn)的毛細(xì)管擴(kuò)張(新管)形成，皮膚或其它器官的纖維變性，脫發(fā)，白內(nèi)障形成，絕育和畸胎形成(先天缺陷)。
既往照射的分子證據(jù)也很有限，例如，CBA/Ca小鼠經(jīng)暴露于200cGy誘發(fā)劑量的電離輻射之后患有白血病，在該小鼠的造血細(xì)胞中鑒定出染色體-2特異性缺失。CBA/Ca小鼠出現(xiàn)了一系列的染色體異常。
盡管在造血細(xì)胞中已可再現(xiàn)地闡明特異性的染色體變化，但無人報(bào)道γ射線的照射能直接或間接地，例如通過對骨髓基質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境的作用，對造血干細(xì)胞產(chǎn)生其它可測的影響。
也已報(bào)道了短壽命的生化指示劑，例如，將細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于電離輻射之后，可觀察到其中c-jun,c-fos和p53之mRNA的表達(dá)有所增加。增加的表達(dá)是瞬時(shí)的，快至暴露后1小時(shí)即回復(fù)到正常的水平。在放射治療中暴露于至少3000cGy的X-射線的病人中也類似地觀察到蛋白質(zhì)TGF-β循環(huán)水平的升高。在未發(fā)展成局部急性肺炎的病人中，放射治療結(jié)束時(shí)此水平回復(fù)正常，而在大多數(shù)發(fā)展成局部急性肺炎的病人中，放射治療結(jié)束時(shí)此水平持久升高。另外，個(gè)體和個(gè)體之間TGF-β的表達(dá)也有差異。
TGF-β短暫升高及其在不同個(gè)體中表達(dá)的差異都表示這種形式的升高不適于作為既往暴露的指示劑。實(shí)際上，至今仍未報(bào)道過在暴露數(shù)周或數(shù)月后仍可被檢測到的生物指示劑。
過去曾暴露于電離輻射的持久的，可檢測的指示劑對于基礎(chǔ)輻射生物學(xué)和法醫(yī)病理學(xué)有價(jià)值。在毫無疑問地或有所懷疑地將輻射暴露既往史作為給定病理學(xué)狀態(tài)的病原因子的情況下，這種需要尤其明顯。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的目的是提供暴露于電離輻射的生物指示劑，所述指示劑在暴露數(shù)周或數(shù)月后仍可被檢測到。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供鑒定輻射的生物指示劑的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供通過檢測根據(jù)本發(fā)明鑒定的生物指示劑水平的變化來確定對電離輻射的既往暴露的方法。
在實(shí)現(xiàn)這些和其它的目的時(shí)，本發(fā)明一方面提供了鑒定暴露于電離輻射的生物指示劑的方法，所述方法包括步驟將細(xì)胞群體暴露于電離輻射；使用示差法將暴露于電離輻射的細(xì)胞群體的基因表達(dá)與未暴露于電離輻射的對照細(xì)胞群體的基因表達(dá)相比較；在暴露的細(xì)胞群體中選擇使基因表達(dá)水平與對照細(xì)胞群體相比有所變化的基因或基因片段，所述表達(dá)水平在暴露于電離輻射之后可以持續(xù)。
本發(fā)明另外還提供了確定個(gè)體是否曾暴露于輻射中的方法，所述方法包括步驟從個(gè)體中得到細(xì)胞，然后檢測細(xì)胞中以前曾暴露于輻射的持久的生物指示劑的存在。
本發(fā)明還提供了檢測對電離輻射的既往暴露的試劑盒，其中包括特異于基因或基因片段的引物，所述基因或基因片段為電離輻射既往暴露之持久指示劑；用于RT-PCR分析的試劑；和在確定取自受試者的細(xì)胞是否含有以前曾暴露于電離輻射的持久生物指示劑的試驗(yàn)中使用引物和試劑的說明。
從下列詳細(xì)的描述中可明顯看出本發(fā)明的其它目的，特征和優(yōu)點(diǎn)。然而，應(yīng)理解在表明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案時(shí)，給出的詳細(xì)描述和具體實(shí)施例只是為了闡明本發(fā)明，因?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)此詳細(xì)描述可輕而易舉地作出不超出本發(fā)明精神和范圍的多種改變和修飾。例如，很顯然，根據(jù)本文所述方法可鑒定能指示對系統(tǒng)毒素，化療烷化劑，化學(xué)致癌劑和其它能使DNA鏈斷裂并誘導(dǎo)照射修復(fù)的試劑的暴露情況的生物指示劑。
附圖簡述

圖1是分離自示差凝膠，并按本文所述亞克隆和測序的C122帶與血清淀粉樣A3基因的序列比較。
圖2A和2B是分離自示差凝膠，并按本文所述亞克隆和測序的C31帶與MSSP-1和MSSP-2結(jié)合蛋白基因的序列比較。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述已發(fā)現(xiàn)一類生物指示劑，具體地包括對應(yīng)于基因或基因片段的核酸指示劑，該指示劑是通過暴露于電離輻射數(shù)周或數(shù)月后的持久性來鑒定的。換句話說，由本發(fā)明的生物指示劑提供的信號可鑒別這種暴露，并在暴露后相當(dāng)長的時(shí)期內(nèi)仍能持續(xù)作用。
通過測定細(xì)胞培養(yǎng)物，尤其是骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(BMSCC)體外暴露于電離輻射之后，生物指示劑水平的變化即可鑒定出本發(fā)明內(nèi)推定的生物指示劑。進(jìn)一步評價(jià)推定的指示劑以測定受試者活體暴露于電離輻射之后，生物指示劑水平是否有相應(yīng)的變化。那些在受試者暴露于電離輻射之后，表現(xiàn)出持久的，可測的體內(nèi)水平變化的生物指示劑可用作電離輻射既往暴露的生物指示劑。
本發(fā)明生物指示劑水平“持久”的變化被定義為在暴露于電離輻射后至少能持續(xù)1周的變化，更具體地是暴露后至少能持續(xù)3周的變化，優(yōu)選暴露后至少能持續(xù)3個(gè)月，更優(yōu)選至少能持續(xù)1年或更長時(shí)間。
本發(fā)明生物指示劑水平“可測”的變化被定義為與未暴露于相當(dāng)高水平的電離輻射，即僅暴露于環(huán)境中通常存在的電離輻射水平的對照群體中天然存在的生物指示劑的表達(dá)水平相比，其表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著變化。可測的變化更具體地被定義為表達(dá)水平至少為對照群體中的2倍，優(yōu)選通過常規(guī)技術(shù)實(shí)際上檢測不到對照群體中生物指示劑的水平。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，生物指示劑是對應(yīng)于基因或基因片段的核酸指示劑。通過使用示差技術(shù)鑒定體外照射細(xì)胞培養(yǎng)物后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)變化即可鑒定出這些核酸指示劑。示差法是比較兩個(gè)或多個(gè)RNA群體之間的基因表達(dá)的很有用的技術(shù)，例見Liang和Pardee，科學(xué)，257:967-71(1992)，和Liang等，核酸研究，21:3269-75(1993)，這兩篇文章的內(nèi)容皆列入本文作為參考。該技術(shù)能夠同時(shí)顯示出兩個(gè)或多個(gè)RNA群體之間被誘導(dǎo)的和受抑制的轉(zhuǎn)錄物的總的差異譜。由于該技術(shù)基于PCR，故可以分離含量極少的mRNA。因此，示差法可提供優(yōu)于傳統(tǒng)的扣除雜交技術(shù)的長處。
在示差法中，通過PCR擴(kuò)增mRNA，然后根據(jù)其大小分布于變性的聚丙烯酰胺凝膠上。該技術(shù)的要素是使用一套寡核苷酸引物，其中一個(gè)錨定mRNA亞套的聚腺苷酸化尾，另一個(gè)相對于第一個(gè)引物來說較短，且是任意的，并在不同的位置退火。逆轉(zhuǎn)錄后，擴(kuò)增由這些引物對限定的mRNA亞群，并在變性的聚丙烯酰胺凝膠上分辨。示差法不僅能同時(shí)顯示多個(gè)RNA群體之間總的差異譜，也能夠分離和鑒定這些差異。
示差技術(shù)能可再現(xiàn)地鑒定暴露于電離輻射之后表達(dá)水平有所變化的基因或基因片段。例如，根據(jù)本發(fā)明，鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞系體外暴露于電離輻射能可再現(xiàn)地產(chǎn)生多個(gè)對應(yīng)于表達(dá)水平可測的增加或降低的示差片段，這一點(diǎn)將在下文中描述。因此，根據(jù)本發(fā)明能可再現(xiàn)地鑒定因暴露于電離輻射而使其表達(dá)穩(wěn)定地增加或降低的推定的鼠生物指示劑。
示差技術(shù)可類似地應(yīng)用于人細(xì)胞，從而通過類似于本文所述用于小鼠的方法鑒定體外照射人細(xì)胞系后，表達(dá)水平可測地增加或降低的轉(zhuǎn)錄物，也可使用示差法鑒定由電離輻射誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物。或者，一旦在小鼠中鑒定出生物指示劑，即可使用特異于一個(gè)或多個(gè)人同源基因的引物來擴(kuò)增同源的人基因。
本發(fā)明特別優(yōu)選的生物指示劑是血清淀粉樣A(SAA)家族，即由肝臟在全身性炎癥反應(yīng)期產(chǎn)生和由內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞對包括IL-1,IL-6和TNF-α的多種細(xì)胞因子反應(yīng)而局部產(chǎn)生的主要急性期炎癥和氧化應(yīng)力基因家族，Steel等，Immunol.Today,15:81-88(1994)。SAA是淀粉樣A(AA)蛋白的前體，所述蛋白是與慢性炎癥相關(guān)的淀粉樣變性疾病組織中沉積的淀粉樣原纖維的主要成分。包括組織損傷和如脂多糖(LPS)的炎癥劑的多種刺激能有效提高SAA的水平。
小鼠SAA家族的成員包括SAA1,SAA2,SAA3和SAA4。肝臟是SAA合成的主要位點(diǎn)，但LPS注射后對肝臟外組織的Northern印跡分析揭示了SAA1,SAA2和SAA3的不同表達(dá)模式。SAA3是主要的肝臟外SAA，在肺，腎臟，腎上腺，腸道，心臟，脾臟，睪丸，骨骼肌，胃，腦，腦垂體和胰腺中可檢測到SAA3。SAA3誘導(dǎo)蛋白酶和細(xì)胞粘附分子的產(chǎn)生，已顯示出可誘導(dǎo)造血細(xì)胞定向遷移和粘附。Steel等，Lmmunol.Today；14(2):797-809(1986)。在多種組織中發(fā)現(xiàn)了SAA3意味著可檢測多種組織，尤其是皮膚和肝臟以測定對電離輻射的既往暴露。
注射LPS后廣泛的組織中含有可測水平的SAA3進(jìn)一步暗示在每種組織中存在的單個(gè)，分散的細(xì)胞系統(tǒng)負(fù)責(zé)SAA3的表達(dá)。原位雜交研究表明脂肪細(xì)胞是肝臟外SAA3表達(dá)的主要來源，例見Benditt&Meek，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，169:1841-46(1989)；和Benditt&Meek，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，164:2006-17(1986)；和Meek等，“小鼠SAA3在具有特異性抗體的小鼠組織中檢測”，AMYLOID AND AMYLOIDOSIS(Kluwer,1991)。因此，在測定對電離輻射的既往暴露時(shí)，描述了在脂肪細(xì)胞或特別是前脂肪細(xì)胞中檢測SAA3水平。
體外照射BMSCC4天后可誘導(dǎo)小鼠的SAA3基因，照射后至少3周仍維持高水平的mRNA。結(jié)果表明細(xì)胞體外暴露于電離輻射能誘導(dǎo)長期產(chǎn)生SAA3 mRNA。劑量-反應(yīng)曲線表明體外100cGy的電離輻射后檢測到mRNA水平，暴露于500,1000和5000cGy后，誘導(dǎo)的水平達(dá)到最高。
盡管SAA3是本發(fā)明優(yōu)選的生物指示劑，但照射后顯示出持久的，可測的水平變化的其它示差片段也是有用的。對BMSCC體外暴露后鑒定出的其它示差片段的初步分析表明它們由不同于SAA3的基因產(chǎn)生。這些結(jié)果涉及由暴露于電離輻射之后，表達(dá)水平可測的，持久的變化鑒定的一系列基因。
優(yōu)選暴露于電離輻射后表達(dá)水平有所增加的那些基因，但原則上也可以使用暴露后表達(dá)水平有所降低的基因。根據(jù)本發(fā)明，鑒定出幾種示差轉(zhuǎn)錄物，它們在暴露于電離輻射后表達(dá)水平有所降低。例如，描述了一種示差片段，該片段與編碼位于c-myc上游的單鏈結(jié)合蛋白MSSP-1/MSSP-2的基因同源。
通過比較由暴露于照射中的受試者建立的BMSCC和由對照受試者建立的BMSCC的基因或基因片段水平，來研究本發(fā)明中經(jīng)體外技術(shù)鑒定的基因或基因片段的表達(dá)。CBA/Ca小鼠及其亞系是體內(nèi)表達(dá)研究的適當(dāng)模型。用200cGy全身照射后，CBA/Ca小鼠發(fā)展成骨髓白血病。由暴露于200cGy電離輻射的CBA/Ca小鼠和未暴露的CBA/Ca小鼠建立BMSCC。
除了由體外分析鑒定的基因表達(dá)水平有可測的差別外，經(jīng)照射的受試者的BMSCC與對照受試者存在的BMSCC相比，其永久基質(zhì)細(xì)胞系和克隆亞系的建立模式也有可定量的差別。從這些細(xì)胞系中也觀察到與對照受試者相比，由經(jīng)照射的受試者建立的基質(zhì)細(xì)胞系的照射生物學(xué)和造血支持能力有差異。數(shù)據(jù)表明造血微環(huán)境的基質(zhì)細(xì)胞中由活體照射誘導(dǎo)的變化在外植培養(yǎng)后數(shù)月仍能持續(xù)。在干細(xì)胞中這些變化能與照射誘導(dǎo)的染色體變化聯(lián)合以影響白血病的形成。
骨髓基質(zhì)細(xì)胞分離自對照小鼠和暴露于200cGy的電離輻射不到100天的小鼠。體外在BMSCC中將分離到的細(xì)胞培養(yǎng)3個(gè)月。由對照培養(yǎng)物和以前經(jīng)照射的小鼠建立的培養(yǎng)物中建立骨髓基質(zhì)細(xì)胞系。
在檢測SAA3 mRNA水平之前，將所得細(xì)胞系培養(yǎng)幾個(gè)月或更長一段時(shí)間。得自對照培養(yǎng)物的細(xì)胞系直至體外暴露于50Gy的電離輻射1周后仍不含顯著水平的SAA3 mRNA。這些結(jié)果與經(jīng)體外照射的BMSCC所得結(jié)果類似。形成鮮明對照的是由以前經(jīng)照射的小鼠建立的細(xì)胞系含有大量SAA3 mRNA。體外照射后一細(xì)胞系的細(xì)胞甚至可進(jìn)一步地增加SAA3 mRNA水平將此細(xì)胞系體外暴露于50Gy的電離輻射1周后，SAA3 mRNA的豐度增加了2-3倍。
因此，將小鼠活體暴露于電離輻射可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的SAA3mRNA，暴露1年后仍可檢測到增加的mRNA水平。因此，檢測骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的SAA3水平即可說明性地檢測根據(jù)本發(fā)明的既往暴露。盡管本文的例子報(bào)道了骨髓基質(zhì)細(xì)胞中增加的表達(dá)，但其它細(xì)胞，包括肺，脾臟，腎臟，肝臟，心臟，胸腺和腦的細(xì)胞也可用作檢測暴露后SAA3水平增加的靶細(xì)胞。如上文所述，脂肪細(xì)胞和前-脂肪細(xì)胞用于檢測SAA mRNA水平的增加特別有利。
通過在不同時(shí)間點(diǎn)收集對照和以前經(jīng)照射的小鼠的全部骨髓和其它組織并立即分離RNA來研究體內(nèi)表達(dá)。分析總RNA在體外被鑒定為表達(dá)水平有所變化的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。類似地發(fā)現(xiàn)體外照射后顯示出水平變化的轉(zhuǎn)錄物也顯示出體內(nèi)表達(dá)水平的持續(xù)變化。例如，在對照樣品中未檢測到SAA3的mRNA，但活體暴露一段時(shí)間后可檢測到SAA3mRNA。
在人中也觀察到類似于小鼠中的結(jié)果，人SAA基因家族至少含有4個(gè)成員。以類似于本文所述的用于小鼠的方法，將人細(xì)胞系，優(yōu)選將骨髓基質(zhì)細(xì)胞系體外暴露于電離輻射中，使用示差法鑒定由電離輻射誘導(dǎo)的SAA基因家族的那些成員。在計(jì)劃移植自身骨髓的白血病，淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤或包括乳腺癌的實(shí)體腫瘤治療過程中，在暴露于電離輻射的病人中可進(jìn)一步證實(shí)SAA基因的體內(nèi)表達(dá)。使用針對家族各個(gè)成員產(chǎn)生的特異性引物，和用這些引物逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)PCR擴(kuò)增此家族中的各個(gè)SAA基因即可測定被誘導(dǎo)的人SAA基因家族內(nèi)的基因或基因片段。特別有用的是人基因SAA1和SAA2，人SAA2基因與小鼠SAA3基因的表現(xiàn)相似，即在對照中實(shí)際上檢測不到，但暴露于電離輻射之后顯示出持久的，可測的增加。在對照中和經(jīng)照射的培養(yǎng)物中都存在人SAA1基因。
一旦鑒定出本發(fā)明的生物指示劑，即可將它用于測定受試者以前是否曾暴露于電離輻射。使用試驗(yàn)測量可能曾暴露于電離輻射的細(xì)胞群體中生物指示劑的表達(dá)水平，將此水平與未曾暴露于顯著水平的電離輻射的對照群體的表達(dá)水平相比較。被檢測的細(xì)胞可以是剛從受試者體內(nèi)取出的細(xì)胞，也可以是以前從受試者體內(nèi)取出，再經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞。此試驗(yàn)利用了Northern印跡或RT-PCR技術(shù)。當(dāng)使用RT-PCR檢測既往暴露時(shí)，特異于由本發(fā)明的示差法分析鑒定的照射-誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物的序列被用作引物。
測定受試者以前是否曾暴露于電離輻射的成分在試劑盒中被方便地包裝在一起以檢測對電離輻射的既往暴露。試劑盒中包括特異于基因或基因片段的引物，所述基因或基因片段為電離輻射既往暴露之持久指示劑；用于RT-PCR分析的試劑；和在確定取自受試者的細(xì)胞是否含有以前曾暴露于電離輻射的持久指示劑的試驗(yàn)中使用引物和試劑的說明。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒包括特異于SAA基因，尤其是人SAA1或人SAA2的引物。
下列實(shí)施例闡明了鑒定指示對電離輻射的既往暴露的持久的，可測的生物指示劑的具體方案。應(yīng)理解在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)可對所述方案進(jìn)行多種改變和修飾。實(shí)施例1．體外照射鼠細(xì)胞和分離RNA根據(jù)本發(fā)明，將多個(gè)鼠細(xì)胞系體外暴露于電離輻射中，其中主要的細(xì)胞系是以前曾被描述過的D2XRII細(xì)胞系，即最早分離自C3H/HeJ長期骨髓培養(yǎng)物的鼠成纖維細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞系。已將這些細(xì)胞分類為骨髓成纖維細(xì)胞或前-脂肪細(xì)胞，Naparstek等，細(xì)胞生理學(xué)雜志，126:407(1986)。在含有10％FBS的DMEM中使D2XRII細(xì)胞生長至鋪滿的單層，然后以200cGy/分鐘的劑量速率暴露于1,5,10或50Gy的6MeV X-射線中，照射1小時(shí)，1天，4天，1周，2周和3周后收獲細(xì)胞，根據(jù)Chomcynski和Sacchi，分析生物化學(xué)，162:156(1987)的方法，使用總RNA分離試劑盒(Promega公司，Madison,WI)分離總RNA，在Northern印跡，RT-PCR和示差分析中使用經(jīng)DNA酶處理過的總RNA。實(shí)施例2．示差分析示差法使用可商購的RNAmap試劑盒(GenHunter公司，Brookline,MA)。簡單地說，將200ng經(jīng)DNA酶處理過的總RNA用作模板以使用4個(gè)基于寡聚(dT)的引物中的一個(gè)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄之后，聯(lián)合使用寡聚(dT)引物和20個(gè)任意的10-堿基引物中的一個(gè)PCR擴(kuò)增cDNA，聯(lián)合使用4個(gè)下游的基于寡聚(dT)的引物和20個(gè)上游的任意引物擴(kuò)增的cDNA顯示出細(xì)胞中存在的10,000個(gè)mRNA種類(Liang等，1993)，擴(kuò)增后，在6％的變性聚丙烯酰胺凝膠上分離PCR產(chǎn)物，然后使凝膠干燥，通過放射自顯影檢測產(chǎn)物。
然后比較RNA群體之間每種顯示轉(zhuǎn)錄物的豐度，為了使假陽性的分離降低至最低程度，每種示差反應(yīng)對相同的RNA群體需進(jìn)行2次，僅進(jìn)一步檢查在兩套反應(yīng)中顯示出相同豐度變化的轉(zhuǎn)錄物。
從聚丙烯酰胺凝膠上直接切下顯示出差異表達(dá)的帶，從凝膠條中分離DNA，使用原有的引物和條件用Taq DNA聚合酶PCR擴(kuò)增，并連接到pT7-Blue T-載體上，用所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化XL-1 Blue細(xì)胞(Novagen公司，Madison,WI)。分離含有克隆的PCR產(chǎn)物的菌落，使用fmol DNA測序試劑盒(Promega公司，Madison,WI)測定質(zhì)粒中插入物的序列。在從亞克隆片段中得到不止1個(gè)序列的情況下，證實(shí)每一序列的表達(dá)模式以測定哪一個(gè)是所需的序列。實(shí)施例3．Northern印跡分析例如，可按已列入本文作為參考的Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，1989)的描述進(jìn)行Northern印跡。簡單地說，在1％甲醛-瓊脂糖凝膠上電泳10-20μg總RNA，將總RNA轉(zhuǎn)移到被支持的硝酸纖維素膜(Schleicher和Schuell)上并在含有1％BSA,250mM Na2HPO4,1mM EDTA和7％SDS的溶液中與代表所需PCR亞克隆的α32P-dCTP(NEN)-標(biāo)記的探針雜交，洗滌后，將印跡暴露于X-omat膠片(Kodak)上，通過光密度法定量測定帶。使用煮沸的0.1％SDS使相同的印跡脫色，并依次與代表甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(G-3-PDH)的探針雜交，以作為每個(gè)泳道RNA量的上樣對照。實(shí)施例4．RT-PCR分析在總體積為20μl的20mM Tris-HCl pH8.4,50mM KCl,5mM MgCl2,1mM dNTP,20單位RNA酶抑制劑(Pharmacia,Piscataway,NJ)中，用200單位的逆轉(zhuǎn)錄酶(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)對經(jīng)DNA酶處理的RNA(1μg)進(jìn)行寡聚(dT)-引發(fā)的逆轉(zhuǎn)錄。將反應(yīng)物在室溫下保溫10分鐘，然后在37℃保溫45分鐘，接著在99℃變性5分鐘，在缺乏逆轉(zhuǎn)錄酶的情況下進(jìn)行對照反應(yīng)。用水將反應(yīng)物稀釋至100μl，在200μM dNTP,1.5mM MgCl2,Tris-HCl pH8.4，和2.5單位的Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)存在下，用20pmol有義引物和20pmol反義引物擴(kuò)增5μl經(jīng)稀釋的反應(yīng)物(約釋放50ng的RNA)，以94℃30秒，60℃30秒和72℃1分鐘共進(jìn)行20次擴(kuò)增循環(huán)。用特異于亞克隆或所需基因的引物和G-3-PDH基因的引物進(jìn)行平行的PCR反應(yīng)，擴(kuò)增后，在瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn)物，并通過溴化乙錠染色觀察結(jié)果。實(shí)施例5．分析體外照射鼠細(xì)胞后得到的示差轉(zhuǎn)錄物體外照射D2XRII細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生了一組基因表達(dá)水平顯示出增加或降低的示差轉(zhuǎn)錄物，表達(dá)有所增加的第一組的24個(gè)克隆列于表1。
<p>G91,G101,A113,T34,T36,T101/2和C122這7個(gè)示差轉(zhuǎn)錄物在照射后1周表現(xiàn)出水平增加，選擇它們作進(jìn)一步研究，將這7個(gè)轉(zhuǎn)錄物中的一個(gè)，即克隆C122重新擴(kuò)增，亞克隆并測序。
使用差異表達(dá)序列檢索GenBank數(shù)據(jù)庫以測定與已知序列同源性的存在，比較結(jié)果表明C122與鼠血清淀粉樣A3基因的3’末端相同，比較結(jié)果示于圖1。與GenBank序列的最適性比較表現(xiàn)出與SAA3基因99％相同。
在選定片段與已報(bào)道的序列沒有同源性的情況下，可使用未知序列的PCR產(chǎn)物作為探針以篩選全長克隆的適當(dāng)cDNA文庫(對照或經(jīng)照射的)，例見Sambrook等，1989，文獻(xiàn)同上。
表2示出表達(dá)有所降低的第2組的12個(gè)克隆。
<p>在表現(xiàn)出表達(dá)降低的克隆中，發(fā)現(xiàn)克隆31與位于c-myc上游的單鏈結(jié)合蛋白MSSP-1和MSSP-2同源，比較結(jié)果分別列于圖2A和圖2B。與GenBank序列的最適性比較顯示出與MSSP-1和MSSP-2基因95％相同。
已在其它的體外暴露于輻射的細(xì)胞系中闡明SAA3增加的表達(dá)，例如，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞系暴露后SAA3的mRNA水平增加了2倍。實(shí)施例6．用Northern印跡證實(shí)經(jīng)體外照射之細(xì)胞表達(dá)的SAA3通過Northern印跡分析證實(shí)由克隆122表達(dá)SAA3，將D2XRII細(xì)胞暴露于10或50Gy的X-射線1小時(shí)，1天，1周或3周后，從細(xì)胞中收集RNA，在1％甲醛-瓊脂糖凝膠上電泳后，將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并與代表示差帶C122的32P-標(biāo)記的探針雜交，通過放射自顯影檢測雜交信號，對瓊脂糖凝膠的溴化乙錠染色證實(shí)了每個(gè)泳道中RNA的存在，Northern印跡分析確證在經(jīng)照射的細(xì)胞中鑒定的示差片斷不是人為的假象。實(shí)施例7．鼠細(xì)胞體外暴露不同時(shí)間后SAA3的表達(dá)和劑量-反應(yīng)曲線的繪制通過Northern印跡分析也證實(shí)了在照射后長于1周的時(shí)間里，克隆122的SAA3表達(dá)，暴露于10Gy的X-射線1小時(shí)，1天，4天或1周，2周或3周后，從D2XRII細(xì)胞中收集RNA，在1％甲醛-瓊脂糖凝膠上電泳后，將RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并與代表示差帶C122的32P-標(biāo)記的探針雜交，通過放射自顯影檢測雜交信號，對瓊脂糖凝膠的溴化乙錠染色證實(shí)了每個(gè)泳道中RNA的存在。
體外照射4天后誘導(dǎo)了SAA3基因，照射后至少3周，mRNA水平仍然較高。暴露于10Gy的X-射線后，SAA3轉(zhuǎn)錄物的豐度在暴露4天后增加約10倍，暴露1周后增加20倍，暴露2周后增加35倍，暴露3周后增加40倍。這表明將細(xì)胞體外暴露于電離輻射可誘導(dǎo)SAA3 mRNA的長期產(chǎn)生。SAA3的劑量-反應(yīng)曲線顯示出體外經(jīng)100cGy電離輻射之后檢測到mRNA水平，暴露于500,1000和5000cGy之后達(dá)到最大誘導(dǎo)。實(shí)施例8．由暴露于電離輻射的小鼠建立的細(xì)胞培養(yǎng)物中SAA3的表達(dá)CBA/Ca雄性小鼠(Brookhaven實(shí)驗(yàn)室，紐約)接受了200cGy的全身照射(250KVP,GE Maxitron，劑量速率90R/分鐘，1mm鋁和0.5mm銅濾除)，照射后100天，通過頸錯(cuò)位處死經(jīng)照射的小鼠，對照組包括相同數(shù)目的年齡相當(dāng)?shù)男坌訡BA/Ca對照小鼠。
將分別得自經(jīng)照射小鼠和對照小鼠的骨髓注入15ml圓錐形離心管中，所述離心管中含有添加了25％馬血清和10-5M氫化可的松的Fisher氏培養(yǎng)基，分別建立各個(gè)經(jīng)照射小鼠和對照小鼠的后肢(脛骨和腓骨)骨髓連續(xù)培養(yǎng)物。
4周后，根據(jù)已知方法用25％的胎牛血清替代馬血清以使培養(yǎng)物的壽命最長。每周更換一次培養(yǎng)基以維持培養(yǎng)物直至它們不再顯示出可測的圓石樣小島似的形狀或每瓶產(chǎn)生104個(gè)以上的細(xì)胞。利用代表性的瓶建立特定時(shí)間點(diǎn)的骨髓基質(zhì)細(xì)胞系，在體外將分離出的細(xì)胞培養(yǎng)3個(gè)月。
由對照小鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物和以前經(jīng)照射的小鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物建立骨髓基質(zhì)細(xì)胞系，在檢測由本發(fā)明的體外技術(shù)鑒定的推定生物指示劑的mRNA水平之前，將所得細(xì)胞系培養(yǎng)約1年。使用與本文所述的用于體外暴露于電離輻射的D2XRII細(xì)胞相同的技術(shù)評估推定生物指示劑的水平。
使用表3所示的SAA鼠基因家族成員的特異性引物擴(kuò)增對照和經(jīng)照射小鼠培養(yǎng)物中的鼠SAA1,SAA2,SAA3和SAA4基因。在對照培養(yǎng)物中未鑒定出任何一種SAA轉(zhuǎn)錄物，但在經(jīng)照射小鼠的培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)了SAA3轉(zhuǎn)錄物。表3．鼠SAA家族成員的引物序列
<p>得自對照培養(yǎng)物的代表性細(xì)胞系被稱為CC3細(xì)胞系，直至體外暴露于50Gy電離輻射1周，它仍不含顯著水平的SAA3 mRNA。此細(xì)胞系體外暴露于50Gy電離輻射1周后，SAA3 mRNA的豐度增加2-3倍，此結(jié)果與體外照射D2XRII細(xì)胞所得的結(jié)果相當(dāng)。
與之相比，被稱為CT4細(xì)胞系的由以前經(jīng)照射的小鼠建立的代表性細(xì)胞系含有大量SAA3 mRNA。體外照射CC4細(xì)胞系的細(xì)胞甚至能進(jìn)一步地增加SAA3的mRNA水平。
通過Northern印跡分析證實(shí)CC3和CT4細(xì)胞中SAA3的表達(dá)，從暴露于0-50Gy的X-射線1周后的細(xì)胞中收集RNA，將印跡與代表示差帶C122的32P-標(biāo)記的探針雜交，通過放射自顯影檢測雜交信號，對瓊脂糖凝膠的溴化乙錠染色證實(shí)了每個(gè)泳道中RNA的相同上樣量。實(shí)施例10．暴露于電離輻射的小鼠中SAA3的體內(nèi)表達(dá)使用CBA/Ca小鼠的亞系CBA/CaJ小鼠(Jackson實(shí)驗(yàn)室，BarHarbour,ME)證實(shí)活體暴露于電離輻射后SAA3表達(dá)的增加。將CBA/CaJ小鼠全身暴露于50cGy,200cGy,400cGy和700cGy的X-射線照射中，于暴露后第7天，14天，28天，3個(gè)月和7個(gè)月處死小鼠，收集全部的骨髓和其它組織。從骨髓和組織中分離RNA并立即使用RT-PCR分析SAA1,SAA2,SAA3和SAA4mRNA的存在，所述PCR使用了分別特異于實(shí)施例8所述的SAA1,SAA2,SAA3和SAA4的引物。在對照骨髓中未檢測到mRNA，但在暴露于700cGy全身照射的小鼠中，于暴露后延續(xù)的時(shí)間點(diǎn)在骨髓中檢測到SAA3 mRNA。
由包括C57B16/J和C3H/HeJ小鼠的其它小鼠細(xì)胞系的細(xì)胞已得到相似的結(jié)果，結(jié)果表明將小鼠活體暴露于電離輻射可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞中的SAA3的mRNA，在暴露后很長一段時(shí)間仍能檢測到mRNA水平的增加，這表明SAA3基因適于作為對電離輻射之暴露的生物指示劑。實(shí)施例9．體外照射人細(xì)胞后SAA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)根據(jù)本發(fā)明，將多種人細(xì)胞系體外暴露于電離輻射中，其中主要的細(xì)胞系是骨髓基質(zhì)細(xì)胞系KM101,KM102和KM104，它們被描述于FitzGerald等，Int.J.Rad.Oncol.Biol.Phys,15:1153-1159(1988)中。在含有10％FBS的DMEM中將細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿的單層，然后暴露于0Gy(對照)或10Gy的電離輻射中。使用表4所示的人SAA基因家族成員的特異性引物擴(kuò)增人SAA1,SAA2,SAA3和SAA4基因。表4．人SAA家族成員的引物序列
在所有3個(gè)細(xì)胞系中，在經(jīng)照射的細(xì)胞中觀察到SAA1轉(zhuǎn)錄物，與對照細(xì)胞相比，經(jīng)照射細(xì)胞的mRNA水平有所增加。從第4天開始在對照KM101細(xì)胞中觀察到SAA1轉(zhuǎn)錄物，在任何時(shí)間，任何對照細(xì)胞中都未觀察到SAA2轉(zhuǎn)錄物，但在經(jīng)照射細(xì)胞中觀察到SAA2轉(zhuǎn)錄物，并在暴露后能持續(xù)，在對照或經(jīng)照射細(xì)胞中都未觀察到SAA3和SAA4轉(zhuǎn)錄物。實(shí)施例10．人活體暴露于電離輻射后SAA轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)為了證實(shí)SAA轉(zhuǎn)錄物在人中的表達(dá)，在計(jì)劃移植自身骨髓的白血病，淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤或包括乳腺癌的實(shí)體腫瘤治療過程中，在暴露于電離輻射之前的病人體內(nèi)取樣，深低溫保存樣品，然后使病人接受全身照射，當(dāng)臨床跡象再現(xiàn)時(shí)，或在照射后特定的時(shí)間點(diǎn)，抽取骨髓供分析并進(jìn)行組織培養(yǎng)。得到并擴(kuò)展人骨髓基質(zhì)細(xì)胞的技術(shù)描述于Greenberger,In Vitro,15(10):823-828(1979)，該文獻(xiàn)的內(nèi)容列入本文作為參考。
取出部分樣品供臨床組織病理學(xué)分析，然后將抽取的骨髓置于組織培養(yǎng)瓶中，所述瓶中含有添加了10-6M氫化可的松和McCoys 5A培養(yǎng)基的25％胎牛血清，在33℃,7％CO2，高濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，通過胰蛋白酶消化和重新平鋪細(xì)胞來擴(kuò)展貼附于培養(yǎng)瓶表面的基質(zhì)細(xì)胞。
將得自用電離輻射治療前的相同病人的骨髓細(xì)胞深低溫保存等分試樣融化，并在相同條件下培養(yǎng)細(xì)胞，擴(kuò)展在25％胎牛血清和10-6M氫化可的松存在下生長成貼附于培養(yǎng)瓶表面的單層的基質(zhì)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長至適當(dāng)數(shù)目，即每個(gè)制品約107個(gè)細(xì)胞之后，通過刮擦或胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞。提取總RNA，使用人SAA轉(zhuǎn)錄物通過RT-PCR擴(kuò)增總RNA，通過上文所述的Northern印跡評估和證實(shí)每種SAA轉(zhuǎn)錄物的水平。實(shí)施例11．測定人受試者對電離輻射的既往暴露的試驗(yàn)對人受試者的骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行活組織檢查以檢測受試者相對于對照群體而言是否表現(xiàn)出增加的SAA表達(dá)，所述對照群體未曾暴露于顯著水平的電離輻射中?？墒褂蒙衔膶?shí)施例9中所述的方法和引物立即檢測細(xì)胞，或者從受試者體內(nèi)取出后先培養(yǎng)，然后再分析SAA的水平。
除了用于鑒定對既往照射的暴露的生物指示劑外，上文中所述方法還可用于鑒定對疾病引發(fā)劑，例如，對系統(tǒng)毒素，化療烷化劑，化學(xué)致癌劑和其它能使DNA鏈斷裂并誘導(dǎo)照射修復(fù)的試劑的暴露的生物指示劑。更具體地，可使用示差法檢測取自暴露于上述引發(fā)劑的受試者的組織中本發(fā)明生物指示劑表達(dá)水平的提高。
權(quán)利要求
1．鑒定暴露于電離輻射的生物指示劑的方法，所述方法包括步驟將細(xì)胞群體暴露于電離輻射；使用示差法將暴露于電離輻射的細(xì)胞群體的基因表達(dá)與未暴露于電離輻射的對照細(xì)胞群體的基因表達(dá)相比較；在暴露的細(xì)胞群體中選擇基因表達(dá)水平與對照細(xì)胞群體相比有所變化的基因或基因片段，所述表達(dá)水平在暴露于電離輻射之后可以持續(xù)。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，另外包括測定基因或基因片斷序列的步驟。
3．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將細(xì)胞群體暴露于電離輻射的步驟是體外暴露細(xì)胞培養(yǎng)物的步驟。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將細(xì)胞群體暴露于電離輻射的步驟是活體暴露細(xì)胞的步驟。
5．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中基因或基因片斷對應(yīng)于編碼血清淀粉樣成分的基因。
6．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中血清淀粉樣成分是鼠血清淀粉樣A3。
7．根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中血清淀粉樣成分是人血清淀粉樣A1或A2。
8．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞是骨髓細(xì)胞。
9．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中基因或基因片斷在暴露的細(xì)胞群體中的基因表達(dá)水平比在對照細(xì)胞群體中的有所增加。
10．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中增加的表達(dá)水平至少為對照群體中的2倍。
11．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中通過常規(guī)技術(shù)實(shí)際上檢測不到對照群體中的生物指示劑水平。
12．根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中基因或基因片斷在暴露的細(xì)胞群體中的基因表達(dá)水平比在對照細(xì)胞群體中的有所降低。
13．確定個(gè)體是否曾暴露于輻射中的方法，所述方法包括步驟從個(gè)體中得到細(xì)胞，然后檢測細(xì)胞中以前曾暴露于輻射的持久的生物指示劑的存在。
14．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，另外包括在檢測細(xì)胞步驟之前的培養(yǎng)細(xì)胞的步驟。
15．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中在檢測步驟中使用Northern印跡分析。
16．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中在檢測步驟中使用RT-PCR分析。
17．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中生物標(biāo)記是對應(yīng)于編碼血清淀粉樣成分之基因的基因或基因片斷。
18．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中血清淀粉樣成分是鼠血清淀粉樣A3。
19．根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中血清淀粉樣成分是人血清淀粉樣A1或A2。
20．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中細(xì)胞是骨髓細(xì)胞。
21．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中基因或基因片斷在暴露的細(xì)胞群體中的基因表達(dá)水平比在對照細(xì)胞群體中的有所增加。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中增加的表達(dá)水平至少為對照群體中的2倍。
23．根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中通過常規(guī)技術(shù)實(shí)際上檢測不到對照群體中的生物指示劑水平。
24．根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中基因或基因片斷在暴露的細(xì)胞群體中的基因表達(dá)水平比在對照細(xì)胞群體中的有所降低。
25．檢測對電離輻射的既往暴露的試劑盒，其中包括特異于一種基因或基因片段的引物，所述基因或基因片段為電離輻射既往暴露之持久指示劑；用于RT-PCR分析的試劑；和在確定取自受試者的細(xì)胞是否含有以前曾暴露于電離輻射的持久生物指示劑的試驗(yàn)中使用引物和試劑的說明。
26．權(quán)利要求25中要求的試劑盒，其中細(xì)胞是骨髓細(xì)胞。
27．權(quán)利要求26中要求的試劑盒，其中引物特異于SAA基因或其片斷。
全文摘要
使用暴露于電離輻射的持久的生物指示劑,尤其是核酸指示劑可測定受試者是否曾暴露于電離輻射,通過示差技術(shù)可鑒定這種生物指示劑。
文檔編號C12Q1/68GK1216069SQ97193746
公開日1999年5月5日 申請日期1997年2月18日 優(yōu)先權(quán)日1996年2月15日
發(fā)明者K·L·戈特里理, J·S·格林伯格 申請人:匹茲堡大學(xué)