一種miR-486-5p作為生物標(biāo)記物在胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種miR-486-5p作為生物標(biāo)記物在胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)及在胃癌細(xì)胞系應(yīng)用的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]2008年，全世界有989，600個(gè)胃癌新發(fā)病例和738，000個(gè)胃癌相關(guān)的死亡病例，其中70%的胃癌發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，中國(guó)約占40%以上。胃癌位于癌癥死亡的第四位，在中國(guó)的發(fā)病率高，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)多處于晚期，胃癌5年生存率為20-25%，即便胃癌早期切除后，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移也容易發(fā)生。由于胃癌的發(fā)生受到環(huán)境因素、多基因多階段等復(fù)制因素影響，目前對(duì)胃癌的發(fā)病機(jī)制、預(yù)后評(píng)估等方面尚未闡明。
[0003]目前對(duì)胃癌預(yù)后的評(píng)估最經(jīng)典的方式是病理TW，即病理分期中腫瘤病理類(lèi)型、月中瘤大小、腫瘤侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移情況影響著患者預(yù)后。但由于胃癌患者個(gè)體差異大，腫瘤細(xì)胞也存在異質(zhì)性。僅僅通過(guò)?!分期難以滿足臨床需要，在判斷胃癌預(yù)后及個(gè)體化治療等方面存在缺陷。因此，需要尋找發(fā)現(xiàn)新型的分子生物標(biāo)記物用于胃癌預(yù)后的評(píng)估。
[0004]影像診斷方法如CT，PET-CT等檢查方法必須腫瘤體積足夠大才能檢測(cè)到，其檢測(cè)靈敏度有限。根據(jù)臨床循證醫(yī)學(xué)和實(shí)驗(yàn)研宄發(fā)現(xiàn)，盡管可切除胃癌進(jìn)行了胃癌根治治療，但5年生存期也不樂(lè)觀，甚至I期的胃癌在根治切除后，依然能夠發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，提示腫瘤的播散轉(zhuǎn)移未必是晚期尸檢，可能在早期發(fā)生。
[0005]血清/血漿等腫瘤標(biāo)記物在胃癌的早期診斷、復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)及預(yù)后的評(píng)估應(yīng)用有限，如CEA、胃蛋白酶、CA19-9等標(biāo)記物其靈敏度和特異度有很大局限，難以滿足胃癌個(gè)體化診斷治療的臨床需要。并且不同胃癌的患者具有不同的遺傳背景，其分子和基因表型不同，因此，迫切需要新型的分子標(biāo)記物用于胃癌的預(yù)后評(píng)估，為胃癌的個(gè)體化診斷治療提供新型的分子標(biāo)記物。
[0006]miRNA在癌癥的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等方面扮演重要作用，目前是腫瘤細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的研宄熱點(diǎn)之一。miRNA在細(xì)胞發(fā)育的不同階段具有不同的形式，當(dāng)其成熟時(shí)為19-23個(gè)核苷酸單鏈RNA，進(jìn)化上具有高度保守性，廣泛存在不同類(lèi)型的真核生物中，它不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，但不具有開(kāi)放性閱讀框(ORF)。
[0007]miRNA被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)控線蟲(chóng)時(shí)序發(fā)育。miRNA在2002和2003被評(píng)為Science的10大科技突破。通過(guò)生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)，miRNA可調(diào)控?cái)?shù)以千計(jì)的靶分子，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)及生理活動(dòng)。當(dāng)miRNA表達(dá)發(fā)生異常，將可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲等行為異常，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。
[0008]有些miRNA在胃癌中具有癌基因功能，有些miRNA在胃癌具有抑癌基因功能。MiR-486-5p在胃癌的發(fā)生發(fā)展的作用尚不清楚，尤其miR-486-5p的異常表達(dá)與胃癌的診斷、預(yù)后評(píng)估尚不清楚。MiR486-5p在胃癌組織及細(xì)胞中基因表達(dá)收到抑制，可能是一種能夠癌基因功能。MiR486-5p在非細(xì)胞細(xì)胞肺癌中表達(dá)也降低，在非小細(xì)胞肺癌中，⑶K4可能miR486-5p的靶基因，miR486_5p通過(guò)調(diào)控⑶K4調(diào)控非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)、增殖、侵襲作用。在肺癌中，下調(diào)的miR486-5p通過(guò)調(diào)控促癌基因ARHGAP5，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移作用。在乳腺癌中，miR486-5p通過(guò)調(diào)控PM-1基因抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種miR-486-5p作為生物標(biāo)記物在胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)及對(duì)胃癌生長(zhǎng)、增殖及凋亡影響的方法，旨在解決目前對(duì)胃癌預(yù)后的評(píng)估采用病理TNM，由于胃癌患者個(gè)體差異大，腫瘤細(xì)胞也存在異質(zhì)性，僅僅通過(guò)期難以滿足臨床需要，在判斷胃癌預(yù)后及個(gè)體化治療存在個(gè)體差異大，難以在臨床實(shí)施個(gè)體化治療和預(yù)后評(píng)估。胃癌患者具有相同的?m分期其預(yù)后差異大，對(duì)手術(shù)治療、放化療等治療的敏感性反映的差異也很大，因此，迫切需要在分子水平上尋找和發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)記物實(shí)施于胃癌的個(gè)體化治療和預(yù)后評(píng)估。
[0010]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種miR-486-5p作為生物標(biāo)記物在胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)的方法，該miR-486-5p作為生物標(biāo)記物在胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)的方法通過(guò)地高辛標(biāo)記miR-486-5p探針，利用原位雜交方法比較miR-486_5p表達(dá)在胃癌及癌旁正常表達(dá)的差異，通過(guò)胃癌和癌旁組織miR-486-5p探針染色的顏色判斷miR-486_5p在胃癌的表達(dá)的變化，是增高、降低還是不變，判斷miR-486-5p在胃癌組織表達(dá)的高低在在胃癌患者的預(yù)后的作用。同時(shí)，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)miR-486_5p的作用革El點(diǎn)FGF9在胃癌的預(yù)后也扮演重要角色，胃癌患者FGF9蛋白的升高其預(yù)后較差。
[0011]本發(fā)明提供的miR-486-5p作為生物標(biāo)記物在胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)的方法，通過(guò)miRNA芯片篩選胃癌中異常表達(dá)的miRNA譜，其中miR-486-5p在胃癌血漿中異常高表達(dá)，利用miRNA原位雜交方法檢測(cè)miR-486-5p在90例配對(duì)的胃癌組織及癌旁正常胃粘膜組織芯片，miR-486-5p主要定位在胃癌細(xì)胞及癌旁正常胃粘膜的胞漿中，miR-486_5p在63.1%(53/84)胃癌組織中表達(dá)下降，在32.1% (27/84)的胃癌組織中表達(dá)升高，在4.8% (4/84)的胃癌組織中表達(dá)沒(méi)有明顯改變。通過(guò)對(duì)胃癌患者平均5年的隨訪，評(píng)價(jià)miR-486-5p在胃癌的預(yù)后評(píng)估作用。miR-486-5p在胃癌的低表達(dá)組其總體生存期明顯低于miR-486_5p高表達(dá)組(P < 0.01)。同時(shí)在胃癌細(xì)胞系中研宄miR-486-5p的表達(dá)異常對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖凋亡等功能影響。體外轉(zhuǎn)染miR-486-5p類(lèi)似物明顯抑制胃癌細(xì)胞BGC803和SGC7901的生長(zhǎng)增殖、促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)FGF9是miR-486-5p作用靶點(diǎn)。免疫組化染色顯示FGF9在69.0% (58/84)的胃癌中低表達(dá)，在31.0% (26/84)的胃癌中高表達(dá)。miR-486-5p的低表達(dá)和FGF9蛋白高表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。并且FGF9在胃癌中高表達(dá)與胃癌患者總體生存期較差有關(guān)(P = 0.001)。
[0012]本發(fā)明的miR-486-5p作為新型的生物標(biāo)記物評(píng)估胃癌的預(yù)后，是對(duì)經(jīng)典的??Μ分期評(píng)估胃癌預(yù)后的有效的補(bǔ)充，為胃癌的個(gè)體化治療及預(yù)后評(píng)估提供新型的分子標(biāo)記物，同時(shí)闡明miR-486-5p的異常表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡影響，為胃癌靶向治療提供了新的治療靶點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的miR-486-5p作為生物標(biāo)記物在胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)的方法流程圖；
[0014]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)示意圖；
[0015]圖中:A-C，miR-486-5p類(lèi)似物及對(duì)照；A轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC803 ；24小時(shí)B和48小時(shí)C后，細(xì)胞克隆計(jì)數(shù)。
[0016]D-F, miR-486-5p類(lèi)似物及對(duì)照；D轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC7901 ；24小時(shí)和48小時(shí)后，細(xì)胞克隆計(jì)數(shù)；
[0017]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的胃癌細(xì)胞凋亡形態(tài)改變示意圖；
[0018]圖中:圖A為BGC803對(duì)照，圖B為miR-486_5p類(lèi)似物轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC80324小時(shí)DAPI染色(400X)，部分細(xì)胞核發(fā)生固縮，凋亡形態(tài)改變。
[0019]圖C為BGC803對(duì)照，圖D為miR-486_5p類(lèi)似物轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SGC790124小時(shí)DAPI染色(200X)，部分細(xì)胞核發(fā)生固縮，凋亡形態(tài)改變；
[0020]圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的miR-486-5p在胃癌及癌旁正常組織的原位雜交示意圖；
[0021]圖中:圖a胃癌HE染色圖，圖b為miR-486_5p在胃癌低表達(dá)，圖c為癌芳正常粘膜圖，圖d為miR-486-5p在癌旁正常粘膜高表達(dá)；圖e胃癌HE染色圖，圖f為miR-486_5p在胃癌尚表達(dá)；
[0022]圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的miR-486-5P類(lèi)似物促進(jìn)在胃癌BGC803細(xì)胞系凋亡示意圖；
[0023]圖中:A圖為正常細(xì)胞對(duì)照，B圖為miR-486-5P類(lèi)似物轉(zhuǎn)染12小時(shí)流式圖，C圖為miR-486-5P類(lèi)似物轉(zhuǎn)染24小時(shí)流式細(xì)胞圖，中晚期凋亡的胃癌細(xì)胞明顯增加；
[0024]圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的miR-486_5p表達(dá)和胃癌總體生存期之間的關(guān)系不意圖；
[0025]圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的miR-486-5p的靶基因在胃癌組織的表達(dá)及其與生存期的關(guān)系不意圖；
[0026]圖中:圖a為FGF9在胃癌組織的高表達(dá)，圖b為FGF9在胃癌癌旁正常粘膜的組織的低表達(dá)，圖c為FGF9蛋白在胃癌高表達(dá)與胃癌患者總體生存期不良有關(guān)。
【具體實(shí)施方式】
[0027]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0028]下面結(jié)合附圖1-7及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0029]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的miR-486_5p作為生物標(biāo)記物在胃癌預(yù)后預(yù)測(cè)的方法包括以下步驟:
[0030]I)探針的標(biāo)記:根據(jù)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，miR-486_5p的基因序列uccuguacugagcugccccgag，購(gòu)買(mǎi)地高辛標(biāo)記的 miR-486_5p 探針(Exiqon Inc, ffobum, MA,USA)。
[0031]miR-486-5p 檢測(cè)方法:
[0032]2)組織芯片的制備:選用口徑1.5μπι的鉆頭，按照組織芯片制作方法制作。每個(gè)芯片均為7X8陣列，其中胃腺癌及癌旁正常組織各一個(gè)樣本。制作完成的組織芯片蠟塊4μ m厚連續(xù)切片，分別進(jìn)行HE染色和原位雜交分析。
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