專利名稱：檢測程序性細胞凋亡抗原的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單克隆抗體，更具體的，涉及一種與暴露在經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞上的線粒體膜蛋白(7A6)上的新型表位結(jié)合的單克隆抗體。
調(diào)控程序性細胞凋亡的基因及其產(chǎn)物的確認近來刺激了對程序性細胞死亡的生物學(xué)和分子水平的認識的研究。程序性細胞凋亡代表一種在生理或病理性條件下發(fā)生的自主性細胞死亡的活性過程(Clarke等人，1990，分析胚胎學(xué)雜志(Anal.Embryol.)181:195-213；Boehmer,1992，今日免疫學(xué)(Immunology Today)13:454-458；Gougeon和Matagnier等人，1993，科學(xué)(Science)260:1269-1270；Thompson,1995，科學(xué)，267:1456-1462)。不同細胞中引發(fā)程序性細胞死亡的途徑可以各不相同，但是程序性細胞凋亡的調(diào)控一般是由從程序性細胞凋亡過程中的分子級聯(lián)啟動的誘導(dǎo)和抑制信號來調(diào)節(jié)。例如，某些腫瘤壞死因子/神經(jīng)生長因子受體基因家族的成員能夠通過干擾這些分子來引起程序性細胞凋亡(Trauth等人，1989，科學(xué)245:301-305；Itoh等人，1991，細胞(Cell)66:23-243；Oehm等人，1992，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem)267:10709-10715)，這表明它們可以用來引發(fā)一個誘導(dǎo)死亡的信號或用來封閉細胞生存所需的信號。相反，由Bc1-2基因編碼的蛋白質(zhì)能通過干擾導(dǎo)致程序性細胞凋亡的途徑來促進細胞生存，雖然Bc1-2看上去并不影響細胞循環(huán)進程(Vaux等人，1988，自然(Nature)335:440-442；Hockenbery等人，1990，自然248:334-346；Nunez等人，1990，免疫學(xué)雜志(J.Immunol.)144:3602-3610)。最近這些調(diào)控程序性細胞死亡的基因及其產(chǎn)物的識別大大地提高了我們對程序性細胞凋亡的分子機理的認識，并且也代表了確定參與程序性細胞凋亡的新型分子的新挑戰(zhàn)。
程序性細胞凋亡伴隨有特征性形態(tài)學(xué)改變以及核小體間(internuclosomal)DNA的降解。(Kerr等人，1972，不列顛腫瘤雜志(Br.J.Cancer)26:239-257；Wylite,1980，自然284:555-556)。最近的證據(jù)表明，在自發(fā)的或誘導(dǎo)的程序性細胞凋亡中形態(tài)改變和死亡本身發(fā)生之前，細胞在表型和功能性上均經(jīng)歷了實質(zhì)性的變化。這些包括內(nèi)切核酸酶的激活(Duke等人，1983，美國國家科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80:6361-6365；Barry和Eastman,1993,EMBO J.12:371-377；Zhang等人，1995，細胞免疫(CellImmunol.)165:161-167)，分子標(biāo)記的表達(Estus等人，1994，細胞生物學(xué)雜志(J.Cell.Biol.)127:1717-1727；Fernandez等人，1994，美國國家科學(xué)院院報91:8641-8645)和蛋白質(zhì)表達的減少或增加(Kishimoto等人，1995，實驗醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)181:649-655；Casciola-Rosen等人，1994，實驗醫(yī)學(xué)雜志179:1317-1330；Ajmani等人，1995，實驗醫(yī)學(xué)雜志181:2049-2058)。雖然已經(jīng)表明分子改變與程序性細胞凋亡緊密相關(guān)，但是對在程序性細胞凋亡的過程中它們的精確作用知道的很少。
不僅在細胞膜和核中而且在線粒體中也觀察到程序性細胞凋亡中的分子改變。在程序性凋亡的細胞中的線粒體DNA不一定片段化，但它的核DNA已被內(nèi)切核酸酶切割成片段(Murgia等人，1992，分子生物學(xué)雜志(J.Biol.Chem)267:10939-10941；Tepper和Studzinski,1992，癌癥研究(Cancer Res.)52:3384-3390)。然而，已經(jīng)在經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞中發(fā)現(xiàn)線粒體的異常超結(jié)構(gòu)和線粒體膜電位的降低(Vayssiere等人，1994，美國國家科學(xué)院院報91:11752-11756；Zamzami等人，1995，實驗醫(yī)學(xué)雜志，181:1661-11672；Steller,1995，科學(xué)267:1445-1449)。Bc1-2在線粒體膜上的位置暗示線粒體對程序性細胞凋亡有一些功能性的影響，雖然在核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上也發(fā)現(xiàn)有Bc1-2基因產(chǎn)物(Hockenbery等人，1990，自然248:334-346；Krajewski等人，1993，癌癥研究，53:4701-4714)。利用缺乏線粒體DNA的人成纖維細胞系，Jacobson等人(1993，自然，361:365-369)報道了通過生長因子的減少對程序性細胞凋亡的誘導(dǎo)及Bc1-2的抗程序性細胞凋亡的效果都不象是依賴于線粒體呼吸鏈的活性。然而，Bc1-2的過度表達可以增加線粒體膜電位且將細胞從程序性細胞凋亡中拯救出來(Hennet等人，1993，癌癥研究53:1456-1460)。與這些發(fā)現(xiàn)相一致，Zamzami等人(1995,實驗醫(yī)學(xué)雜志181:1661-1672)最近顯示線粒體膜電位的降低是體內(nèi)淋巴細胞程序性細胞凋亡的一個早期的不可逆的事件，并且表明一些能封閉程序性細胞凋亡早期信號途徑的藥劑有效地穩(wěn)定了線粒體膜電位的值。這些資料提示在程序性細胞凋亡中線粒體組成成分的參與。
為確認程序性凋亡細胞的分子標(biāo)記，用瀕死的Jurkat細胞免疫小鼠制得單克隆抗體。發(fā)現(xiàn)了一種命名為抗7A6的抗體特異地與經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞反應(yīng)，而不與普通細胞反應(yīng)。該抗體限定的分子是一個位于線粒體膜上的38KD的蛋白質(zhì)。
該單抗可用于區(qū)分普通細胞和程序性細胞凋亡的細胞，研究程序性細胞凋亡的分子機理以及來源于程序性細胞凋亡相關(guān)疾病的樣本的診斷，監(jiān)測治療方案的效果和確定誘導(dǎo)或抑制程序性細胞凋亡的新型藥劑。參見Thompson的文章(1995，科學(xué)267:1456-1462)，其中詳細描述了在致病機理和疾病治療中程序性細胞凋亡的作用。
本發(fā)明描述了一些單克隆抗體或其免疫活性片段的特征，其能從人細胞群中區(qū)分普通細胞和程序性凋亡的細胞。該單克隆抗體特異性地結(jié)合到程序性凋亡的細胞中線粒體膜上的抗原上。該抗原是一種38KD的蛋白質(zhì)，在經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞中可以檢測出而在普通細胞中不能檢測出。
本發(fā)明的單克隆抗體優(yōu)選是鼠源的，也可以是源于其他哺乳類包括但不局限于人和大鼠或其組合。在一優(yōu)選的實施方案中，抗體是由用程序性細胞凋亡的Jurkat細胞免疫的Balb/c小鼠培育的雜合細胞系產(chǎn)生的。該雜合細胞系已在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏，指定保藏號為A.T.C.C No.HB12065。
本發(fā)明的單克隆抗體識別一種新型抗原(7A6)，且能特異性地結(jié)合到程序性細胞凋亡的細胞中的線粒體膜上的該抗原的一個表位上。這些抗體或其片段可用于從生物樣本中區(qū)分普通細胞和程序性細胞凋亡的細胞的方法，例如，在人造血細胞群中，包括外周血淋巴細胞，T細胞系，B細胞系，組織細胞細胞系和前髓細胞系。此外，由于抗體的這種選擇性，也提供了檢測和測量經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞的方法。
當(dāng)將優(yōu)選的實施方案的詳細描述與說明性而非限制性的附圖一起考慮時，本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)點是顯而易見的。


圖1A和1B展示由Ara-C(1-β-D-阿拉伯糖呋喃胞嘧啶)誘導(dǎo)的程序性凋亡的Jurkat細胞的電鏡照片。Jurkat細胞在含有(圖1A)或不含有10μM Ara-C(圖1B)的添加10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。兩種細胞用透射電鏡在同樣倍數(shù)下(×18,000)觀察。箭頭指示程序性細胞凋亡體的結(jié)構(gòu)。圖中短線代表1μ。
圖2A和2B是抗7A6在正常的和程序性凋亡的Jurkat細胞的流式細胞分析的圖示。Jurkat細胞分別用γ-輻照、Ara-C或抗CD95(Fas/Apo-1)處理誘導(dǎo)程序性細胞凋亡。程序性凋亡的或正常的Jurkat細胞在被用于流式細胞術(shù)的免疫標(biāo)記之前分別不用(圖2A)或用(圖2B)毛地黃皂苷透化。每圖中均顯示了陽性細胞的百分數(shù)。
圖3是從正常的或程序性凋亡的Jurkat細胞制得的細胞裂解液的ELISA試驗的圖示。從正常的或經(jīng)過γ-輻照或Ara-C誘導(dǎo)的程序性凋亡的Jurkat細胞制備的細胞裂解液預(yù)包被在ELISA板上。ELISA板與抗7A6或一種同型匹配的對照抗體一起培養(yǎng)，隨后與山羊抗鼠IgG-過氧化物酶偶聯(lián)物培養(yǎng)。酶反應(yīng)用鄰苯二胺底物顯色，492nm下用ELISA讀數(shù)儀讀數(shù)。
圖4A和4B顯示在純化的7A6+和7A6-細胞中DNA片段化的檢定。正常的和Ara-C處理過的Jurkat細胞混合后用抗7A6免疫熒光標(biāo)記。7A6-陽性(pc)和陰性(nc)細胞用細胞分選儀分選(圖4A)。從兩種細胞群中分離DNA且用如前述的1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分析(Zhang等人，1995，細胞免疫165:161-167)。泳道1,100bpDNA梯度的分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2，分離自7A6-細胞的DNA；和泳道3，分離自7A6+細胞的DNA(圖4B)。顯示了DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(bp)的相對遷移。
圖5是細胞裂解液用抗7A6進行的免疫雜交。從正常的、輻照過的或Ara-C處理過的Jurkat細胞中制備細胞裂解液并在還原性條件下進行含10％丙烯酰胺凝膠的SDS-PAGE電泳。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到先后與抗7A6和蛋白G-過氧化物酶孵育過的硝酸纖維素膜上。利用增強的化學(xué)發(fā)光技術(shù)觀察雜交。泳道1，來源于輻照過的Jurkat細胞的細胞裂解液；泳道2，來源于Ara-C處理過的Jurkat細胞的細胞裂解液；和泳道3，來源于正常Jurkat細胞的細胞裂解液。顯示了蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的相對遷移。
圖6A-F是顯示線粒體膜上7A6抗原的位置的電鏡照片。從Ara-C處理過的(圖6A)或正常Jurkat細胞(圖6B)制得的細胞切片先后用抗7A6和免疫金偶聯(lián)物標(biāo)記，并用電鏡觀察。在正常Jurkat細胞中觀察不到標(biāo)記而在Ara-C處理過的Jurkat細胞(箭頭)中發(fā)現(xiàn)免疫金粒的簇。在利用Percoll-metrizamine梯度離心法從正常的和Ara-C處理過的Jurkat細胞中分離的線粒體上檢測抗7A6的活性(圖6C-F)。在為電鏡觀察進行免疫金標(biāo)記前用毛地黃皂苷透化線粒體。圖6C顯示用抗7A6染色的程序性凋亡的細胞中的線粒體(×35,000原始放大倍數(shù))。圖6D顯示在較高放大倍數(shù)(×72,000)下觀察的圖6C的樣品。觀察到金粒位于線粒體(m)內(nèi)膜的表面。圖6E顯示用抗7A6染色的源自正常細胞的線粒體；和圖6F顯示用同型匹配的對照抗體染色的源自程序性凋亡的細胞的線粒體。圖中橫線代表0.5μ。
圖7A-D是源自HIV-感染的供體的外周血淋巴細胞的流式細胞分析的圖示。圖7A描述了利用由CD3激活的HIV-感染細胞的對照抗體的細胞計量分析。圖7B描述了利用由PMA激活的HIV-感染細胞的對照抗體的細胞計量分析。圖7C描述了利用由CD3激活的HIV-感染細胞的抗7A6的細胞計量分析。圖7D描述了利用由PMA激活的HIV感染細胞的抗7A6的細胞計量分析。
本發(fā)明提供一種限定了暴露在程序性凋亡細胞上的獨特表位的單克隆抗體，命名為抗7A6。通過流式細胞儀分析，抗7A6不能使正常的細胞、毛地黃皂苷透化的人外周血淋巴細胞和一系列受試的人細胞系染色。相反，對經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞無論該細胞是否用毛地黃皂苷透化均可用該抗體標(biāo)記。利用Triton X-100裂解緩沖液制備的細胞裂解液的ELISA和免疫雜交表明抗7A6能和程序性凋亡的Jurkat細胞反應(yīng)而不能和正常細胞反應(yīng)。抗7A6限定的抗原是一個38KD的位于線粒膜上的蛋白質(zhì)。這些發(fā)現(xiàn)表明7A6是暴露在經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞上的一種新型表位。
已發(fā)現(xiàn)由不斷增加的一系列分子事件調(diào)控由程序性細胞凋亡引起的細胞死亡。認為由程序性細胞凋亡的誘導(dǎo)激活了負責(zé)將DNA降解成核小體大小的片段的內(nèi)切核酸酶(Duke等人，1983，美國國家科學(xué)院院報80:6361-6365；Barry和Eastman,1993，生物化學(xué)和生物物理學(xué)文獻(Arch.Biochem.Biophys.)300:440-450；Peitsch等人，1993,EMBO J.12:371-377)。最近發(fā)現(xiàn)了核酸酶蛋白質(zhì)三聯(lián)體(NP42-50)，它在經(jīng)歷程序性細胞凋亡的Jurkat細胞中被激活，通過其分子特征和酶學(xué)要求可以與DnaseⅠ和DNaseⅡ區(qū)別開(Zhang等人，1995,細胞免疫，165:161-167)。雖然線粒體DNA的片段化非經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞所必需，在程序性細胞凋亡中除去核被破壞外，在程序性細胞凋亡的早期階段也發(fā)現(xiàn)線粒體是被破壞的細胞靶點(Murgia等人，1992，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)267:10939-10941；Tepper和Studzinski,1992，癌癥研究，52:3384-3390；Yoneda等人，1995，生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)209:723-729)。實際上，一些程序性細胞凋亡誘導(dǎo)劑已被證明能引起導(dǎo)致細胞死亡的線粒體完整性及其功能的喪失(Vukmanovic等人，1991，歐洲免疫雜志(Eur.J.Immunol.)21:419-424；Hennet等人，1993，生物化學(xué)雜志(Biochem.J.)289:587-592)。相反，一種通過封閉程序性細胞凋亡途徑增強細胞存活的蛋白質(zhì)Bc1-2的過度作用，可以增加轉(zhuǎn)染子細胞線粒體膜電位值，且對抗程序性細胞凋亡造成的線粒體膜電位的喪失(Hennet等人，1993，癌癥研究53:1456-1460；Smets等人，1994，血液(Blood)5:1613-1619)。7A6抗原在線粒體膜上的特異性定位和在程序性凋亡的細胞上的限制表達表明7A6抗原參與了程序性細胞凋亡的分子級聯(lián)。
在程序性凋亡細胞上優(yōu)先檢測到7A6抗原的表達，而在正常細胞表面或在毛地黃皂苷透化的細胞上檢測不到。此外，由絲裂原對Jurkat細胞的激活對于7A6抗原的表達無影響。流式細胞計量圖顯示在程序性細胞凋亡早期的階段可檢測出7A6抗原，進一步表明7A6抗原的表達代表了程序性細胞凋亡的早期事件而不是死亡細胞的終產(chǎn)物。利用單克隆抗體技術(shù)，Rotello等人(1994，發(fā)育(Development)120:1421-1431)報道了在雞胚發(fā)育過程中由于程序性細胞凋亡而瀕死的細胞表達稱作apogens的特異性抗原，雖然已發(fā)現(xiàn)這些抗原也在壞死細胞上表達(Fernandez等人，1994，美國國家科學(xué)院院報91:8641-8645)。有趣的是，在程序性細胞凋亡過程中一些正常細胞胞內(nèi)的分子也暴露在細胞表面(Casciola-Rosen等人，1994，實驗醫(yī)學(xué)，179:1317-1330；Koopman等人，1994，血液(Blood)184:1415-1420)。相反，由于用流式細胞儀在毛地黃皂苷透化的正常細胞或?qū)@些細胞裂解液用免疫雜交方法均不能檢測到7A6，說明7A6不是表達到程序性凋亡的細胞表面上的常規(guī)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。
用于生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體和限定的抗原的方法及材料如下面所述。概括地講，通過用程序性凋亡的Jurkat細胞免疫小鼠產(chǎn)生了一系列針對瀕死細胞的單克隆抗體。發(fā)現(xiàn)這些抗體之一抗7A6可與程序性凋亡的細胞反應(yīng)。如流式細胞術(shù)和ELISA所測得，在正常的或毛地黃皂苷透化的人外周血淋巴細胞中以及所有受試的淋巴細胞系中均未觀察到抗7A6的反應(yīng)。然而，當(dāng)通過輻照或用程序性細胞凋亡誘導(dǎo)劑處理誘導(dǎo)這些細胞經(jīng)歷程序性細胞凋亡后，該抗體可與這些細胞強烈反應(yīng)。細胞分選和DNA片段化實驗表明7A6+細胞而非7A6-細胞具有明顯的經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞的DNA片段特征。在還原條件下利用免疫雜交技術(shù)從程序性細胞凋亡的細胞制備的細胞裂解液中用抗7A6檢測出一條38KD的蛋白帶。免疫電子顯微鏡顯示7A6抗原位于程序性細胞凋亡的Jurkat細胞的線粒體膜上。這些結(jié)果表明抗7A6限定了暴露在經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞中的線粒體膜蛋白上的一種新型表位，表明7A6分子可能參與了程序性細胞凋亡細胞死亡的分子級聯(lián)。
可以用此處所述方法或用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法產(chǎn)生如下面列出的實施例中所述的帶有抗7A6的抗體特征的其他的單克隆抗體。此處也描述了檢定帶有期望特征的抗體的篩選方法。此外，在本發(fā)明范圍之內(nèi)的抗體及其有免疫活性的片段的檢定可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)競爭性結(jié)合鑒定方法利用ATCC保藏號為HB12065的雜合細胞系提供的抗7A6抗體來完成。
本發(fā)明范圍之中也包括至少含有抗7A6抗體分子的抗原結(jié)合區(qū)域的功能部分的抗體片段或衍生物。
含有該分子結(jié)合區(qū)域的抗體片段可用已知技術(shù)來產(chǎn)生。例如，這樣的片段包括但不局限于抗體分子經(jīng)胃蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab＇)2片段；通過F(ab＇)2片段二硫橋的還原產(chǎn)生的Fab＇片段；用木瓜蛋白酶(papaim)和一種還原劑處理抗體分子產(chǎn)生的Fab片段。見例如國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)，免疫學(xué)現(xiàn)代方法，Coligan等人編，2.8,2.10(Wiley Interscience,1991)。抗體片段也包括Fv片段，即沒有恒定區(qū)域氨基酸殘基的抗體產(chǎn)物。這樣的片段可以用例如美國專利4,642,334中所述的方法生產(chǎn)。單克隆抗體顯影抗體和其它試劑從鼠骨髓瘤P3-X63-Ag.8.653(Kearney等人，1979，免疫學(xué)雜志123:1548-1550)與源自用完全程序性凋亡細胞Jurkat細胞免疫的鼠的脾細胞融合產(chǎn)生的雜交瘤中篩選并克隆單克隆抗體抗7A6。用已由1-β-D-阿拉伯糖呋喃胞嘧啶(Ara-C)(一種抗代謝劑)誘導(dǎo)經(jīng)歷程序性細胞凋亡的Jurkat細胞皮下或腹膜內(nèi)免疫雌性Balb/c小鼠，間隔3-4周。細胞融合前三天，用細胞抗原(程序性細胞凋亡的Jurkat細胞)腹膜內(nèi)注射對鼠加強免疫。按已知方法(Kohler和Milstein,1975，自然256:495-497)利用聚乙二醇將源自免疫過的鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合。用經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞篩選抗7A6。用商業(yè)性抗體同型試劑(Amersham Life Science,Arlington Heights,IL)顯示抗7A6為IgG1亞族。在小鼠中產(chǎn)生抗7A6的腹水且用蛋白A親和層析柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)從腹水液中純化抗體。
抗7C11(IgM)是一種與CD95(Fas/Apo-1)抗原反應(yīng)的鼠單克隆抗體(Robertson等人，1995,Leuk.Lymphoma 17:51-58)且由Robertson博士提供。用于流式細胞術(shù)的親和純化的山羊抗鼠IgG-FITC偶聯(lián)物和用于電鏡的山羊抗鼠IgG-金偶聯(lián)物分別獲自Jackson免疫研究實驗室(West Grove,PA)和Amersham Life Science(Arlington Heights,IL)。單克隆鼠抗α微管蛋白(IgG1)、Ara-C和所有其他化學(xué)試劑除非指明均獲自Sigma免疫化學(xué)(St.Louis MO)。細胞培養(yǎng)和程序性細胞凋亡的誘導(dǎo)人T細胞系(Jurkat,CEM,Molt-4和HT-102),B細胞系(Raji,Daudi和Ramos)，組織細胞細胞系(U-937)和前髓細胞系(HL-60)用于此研究。所有細胞系均在補加10％胎牛血清，0.45mM丙酮酸和2mM L-谷氨酸的RPMI 1640基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用Ficoll-Hypaque(Pharmacia,Piscataway,NJ)的密度梯度離心從健康供體或HIV感染的供體中分離人外周血淋巴細胞。
為了在細胞培養(yǎng)中誘導(dǎo)程序性細胞凋亡，用如前所述的Ara-C或抗CD95(Fas/Apo-1)處理Jurkat細胞(Zhang等人，1995，細胞免疫165:161-167)?？梢杂忙?輻照后37℃培養(yǎng)過夜的方式在人外周血淋巴細胞，Jurkat細胞和所有其它細胞系中誘導(dǎo)程序性細胞凋亡。用Gamma Cell-1000以137Cs源在細胞中按1000-3000 Rads的劑量輻射(加拿大原子能有限公司，ON，加拿大)。通過DNA片段化和細胞形態(tài)的分析確認由輻照或程序性細胞凋亡誘導(dǎo)劑引起的程序性細胞凋亡的細胞死亡。用毛地黃皂苷透化細胞以及用于流式細胞術(shù)的免疫熒光染色用略加修改的已述方法(Fiskum等人，1980，美國國家科學(xué)院院報77:3430-3434；Anderson等，1989，免疫學(xué)雜志，143:1899-1904)透化人外周血淋巴細胞或細胞系。簡要地，在1％福爾馬林的PBS中于冰上固定細胞20分鐘，用PBS洗滌兩次。然后用毛地黃皂苷在冰上孵育5分鐘透化細胞(Aldrich,Milwaukee,WI)。通過溶于二甲亞砜制成10mg/ml毛地黃皂苷貯存液且用PBS從貯存液稀釋到終濃度為10μg/ml用于細胞透化。用錐蟲藍的吸收證實毛地黃皂苷對細胞的透化。透化后，洗滌細胞并重懸于PBS中用于免疫熒光染色。
通過一種間接免疫熒光檢定方法以流式細胞術(shù)所用抗體標(biāo)記用或未用毛地黃皂苷透化的細胞。與100μl單克隆抗體上清液或稀釋的腹水在冰上培養(yǎng)40分鐘后，用含有0.1％牛血清白蛋白和0.01％NaN3的PBS洗滌細胞(約1×106細胞/樣品)3次。在與親和純化的山羊抗鼠IgG-FITC偶聯(lián)物(1∶500)進一步培養(yǎng)40分鐘之后，用上述緩沖液洗滌3次，且在1％福爾馬林PBS中固定用于流式細胞術(shù)分析。
為進行用于細胞分選的免疫熒光標(biāo)記，2×107個正常Jurkat細胞和4×107個Ara-C處理過的Jurkat細胞的混合物先后用抗7A6和山羊抗鼠IgG-FITC偶聯(lián)物染色。培養(yǎng)和洗滌后，在PBS中沉淀細胞并且重懸，而不是在1％福爾馬林中固定。用EpicsⅤ細胞分選儀，將樣品分成7A6陽性和7A6陰性細胞群。如流式細胞儀測得的分離的7A6陽性和陰性細胞的純度大于98％且通過錐蟲藍的外排測定分選后細胞亞群的活性。洗滌并沉淀7A6陽性或陰性細胞且用于DNA片段化的鑒定。細胞裂解液的制備從細胞培養(yǎng)液中收集正常的細胞或是用γ-珈照或Ara-C處理Jurkat細胞誘導(dǎo)的程序性細胞凋亡的細胞，通過離心用PBS洗滌2次。細胞沉淀溶于含有0.5％Triton X-100,50mM Tris-HCl,pH7.6,140mM NaCl,5mM EDTA,1mM苯甲基磺酰氟和2μg/ml抑蛋白酶肽的裂解緩沖液中。冰上培養(yǎng)40分鐘后，4℃下以14,000轉(zhuǎn)/分離心樣品15分鐘，收集上清液用于如下所述的ELISA和免疫雜交鑒定。用于抗體檢測的ELISA用改進的已述方法(Cobbold和Waldman,1981，免疫學(xué)方法(J.Immunol.Meth.)44:125-133)以細胞裂解液作為靶抗原進行ELISA試驗。利用聚-L-賴氨酸和戊二醛通過將細胞蛋白質(zhì)附著在平底的聚苯乙烯Falcon微孔板上(Becton Dickinson Labware，林肯公園，NJ)準(zhǔn)備ELISA板。用聚-L-賴氨酸處理一小時后，立即用相當(dāng)于2.5×105個細胞/孔的50μl稀釋的細胞裂解液包被板。室溫培養(yǎng)1小時后，用50μl 0.2％新配的戊二醛注滿板，培養(yǎng)15分鐘。倒空板并用PBS洗滌一次。加入含有100mM甘氨酸和0.1％牛血清白蛋白的封閉緩沖液培養(yǎng)30分鐘。用0.2％明膠注滿板4℃下培養(yǎng)過夜。本試驗中所有溶液均用pH7.4的PBS制備。測試抗體和山羊抗鼠IgG-過氧化物酶的稀釋液(JacksonImmunoResearch Laboratories,West Grove,PA)在10％普通山羊血清的PBS中制得。
為了ELISA試驗，不同稀釋度的單克隆抗體(25μl/孔)加入到預(yù)包被的板上，每個抗體稀釋液測定三份。用鼠抗-α-微管蛋白和一同型匹配的非活性抗體分別作為陽性和陰性對照。室溫培養(yǎng)1小時后，用0.1％明膠溶液洗板3次，用10％普通山羊血清培養(yǎng)10分鐘以封閉非特異性的結(jié)合。再用山羊抗鼠IgG-過氧化物酶與板培養(yǎng)30分鐘。用0.05％Tween-20的PBS洗滌板后，將板與底物溶液(30mg鄰苯二胺溶于10ml 100mM檸檬酸緩沖液，pH4.5,4μl 30％的過氧化氫)室溫下培養(yǎng)45分鐘使酶反應(yīng)顯色，每孔中加入50μl 2.5M硫酸終止反應(yīng)。板用自動ELISA讀數(shù)儀(Dynatech Laboratories,Inc.,Alexandria,VA)492nm讀數(shù)。免疫雜交試驗從正常的或程序性凋亡的細胞制得的細胞裂解液在SDS-PAGE上分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上(Schleicher ＆ Schuell,Keene,NH)。在3％牛血清白蛋白的PBS中培養(yǎng)封閉非特異性結(jié)合位點后，先后用抗7A6和蛋白G-過氧化物酶偶聯(lián)物(Bio-Rad,Richmond,CA)與膜培養(yǎng)。用含有0.05％Tween-20和0.1％明膠的pH7.6的Tris-HCl緩沖液在每次培養(yǎng)后洗滌膜4次。按照制造商指示用強化化學(xué)發(fā)光法(Amershan,Arlinton Heights,IL)檢測免疫雜交。線粒體的分離正常的或用Ara-C誘導(dǎo)的程序性凋亡的Jurkat細胞在含有10mMHEPES,pH7.5,1.5mM MgCl2,5mM KCl和250mM蔗糖的冰冷的緩沖液中洗滌并重懸，再用B型研桿的Dounce勻漿破壞(Weaton,Millville,NJ)。含有胞質(zhì)細胞器的核后(post-nuclear)上清液通過1300g離心5分鐘收集。沉淀重懸在250mM蔗糖溶液且再次離心收集上清液。合并兩次離心所得上清液用于線粒體的分離。
按Storrie和Madden所述(1990，醇學(xué)方法(Methods inEnzymology)卷182:203-2245)利用Percoll-metrizamide梯度從核后上清液中分離線粒體。簡言之，在離心管底部加入35％metrizamide,17％metrizamide為第二層，再加入6％的Percoll形成不連續(xù)梯度。全部梯度溶液在250mM蔗糖中制備。含有胞質(zhì)細胞器的核后上清液加到Percoll層頂部。4℃下以20,000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘后，線粒體富集在17％和35％metrizamide層之間的交界處。所得線粒體通過離心洗滌和沉淀。用于電鏡的免疫金染色如已述方法(Griffths和Hoppeler,1986，組織化學(xué)和細胞化學(xué)雜志(J.Histochem.Cytochem.)34:1389-1398)，固定并制備正常的或Ara-C處理過的Jurkat細胞以進行冰凍切片。切片用抗7A6或一種同型匹配的對照抗體標(biāo)記后再用偶聯(lián)在10nM金粒上的山羊抗鼠IgG標(biāo)記。經(jīng)過洗滌和處理，用電鏡觀察樣品。
利用預(yù)包埋標(biāo)記方法用電鏡觀察來源于正常的和Ara-C處理過的Jurkat細胞的細胞或分離的線粒體中的免疫金顆粒。在如前述固定和毛地黃皂苷透化后，用抗7A6或?qū)φ湛贵w作為一級試劑，用山羊抗鼠IgG-金偶聯(lián)物作為二級試劑染色細胞或分離的線粒體。培養(yǎng)和洗滌后，離心沉淀樣品且包埋在明膠介質(zhì)中。用超薄切片機切割樣品并用電鏡觀察?？?A6與輻照誘導(dǎo)的、用Ara-C或抗CD95(Fas/Apo-1)處理的程序性凋亡的細胞以及正常細胞的反應(yīng)性。
已發(fā)現(xiàn)抗7A6可以與用輻照誘導(dǎo)的及用Ara-C或抗CD95(Fas/Ap0-1)處理的程序性凋亡的細胞反應(yīng)，但不能與正常細胞反應(yīng)。
抗7A6是一種鼠IgG1同型的抗體，是從由用AraC處理一種腫瘤細胞系Jurkat細胞免疫的鼠的脾細胞衍生而來的雜交瘤中篩選和克隆到的。Ara-C是一種抗代謝劑，可在微摩爾濃度下有效地誘導(dǎo)Jurkat細胞經(jīng)歷程序性細胞凋亡。有Ara-C存在時進行培養(yǎng)，Jurkat細胞表現(xiàn)出DNA切割成核小體樣片段的程序性細胞凋亡的特征。形態(tài)學(xué)上，這些細胞顯示出表面微絨毛損失、胞質(zhì)縮聚、核的破壞以及程序性細胞凋亡體(圖1A)。與正常細胞相比，由Ara-C誘導(dǎo)程序性細胞凋亡的瀕死細胞顯著萎縮，體積減少了20-30％，如同樣放大倍數(shù)的電鏡所示(圖1)。
抗7A6與Jwkat細胞的反應(yīng)性最初是利用間接熒光染色通過流式細胞術(shù)測定。圖2代表在未用和用毛地黃皂苷透化的正常的和程序性凋亡的Jurkat細胞上7A6抗原的流式細胞術(shù)圖。如圖2A所示，在正常的Jurkat細胞中未檢測到抗7A6的反應(yīng)性。相反，甚至在未用毛地黃皂苷透化時已發(fā)現(xiàn)抗7A6可以使由γ-輻照、用Ara-C或抗CD95(Fas/Apo-1)處理的經(jīng)歷程序性細胞凋亡的Jurkat細胞染色。然而，該抗體不能標(biāo)記由包括伴刀豆球蛋白A和PMA的促細胞分裂劑激活的Jurkat細胞。為進一步證實抗7A6的反應(yīng)性，正常的或程序性凋亡的Jurkat細胞用毛地黃皂苷透化后，由抗體染色，再進行免疫熒光流式細胞術(shù)(圖2B)。與對正常的或程序性凋亡的Jurkat細胞均無反應(yīng)性的同型匹配對照抗體相比，抗7A6以一種時間依賴性方式與Ara-C處理過的Jurkat細胞反應(yīng)，對未處理過的Jurkat細胞既使已用毛地黃皂苷透化也不反應(yīng)。如預(yù)期的，在毛地黃皂苷透化后，單克隆抗微管蛋白可以使正常的或程序性凋亡的Jurkat細胞染色。見圖2。
也檢測了抗7A6檢測和定量HIV感染的外周血淋巴細胞中程序性凋亡細胞的能力。來自感染的供給者的外周血淋巴細胞(PBL)用誘導(dǎo)T細胞活化的CD3或PMA處理。利用對照抗體或抗7A6在激活的細胞上進行細胞計數(shù)分析。與對照相比，抗7A6能檢測和定量經(jīng)歷程序性細胞凋亡的HIV感染的外周血淋巴細胞(PBL)。見圖7A-7D。
抗7A6與人外周血淋巴細胞和細胞系的反應(yīng)性歸納于下面的表1中。如流式細胞術(shù)所測，無論是否用毛地黃皂苷透化，抗7A6均不能染色正常的人外周血淋巴細胞和所有受測試的細胞系。當(dāng)用γ-輻照或Ara-C處理使細胞經(jīng)歷程序性細胞凋亡時，盡管在不同的細胞系中7A6陽性細胞的百分數(shù)不同，抗7A6可以廣泛地與這些細胞反應(yīng)。
DNA片段化是程序性細胞凋亡的共同特征，且作為檢測由程序性細胞凋亡而瀕死的細胞的分子標(biāo)記。為檢測是否7A6+細胞偏好經(jīng)歷DNA片段化，利用抗7A6和細胞分選儀進行特異性細胞純化，以從正常的和Ara-C處理過的Jurkat細胞的混合物中分選7A6陽性和7A6陰性細胞(圖4A)。當(dāng)分選后用錐蟲藍染色后，7A6+細胞而不是7A6-細胞失去了外排該染料的能力。從兩種細胞群中制得DNA并且用瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖4B所示，發(fā)現(xiàn)7A6陽性細胞在瓊脂糖凝膠上具有DNA片段的梯度模式。相反，在7A6-細胞群中未檢測到DNA片段化。抗原的分子特征從程序性凋亡的Jurkat細胞中制備的細胞裂解液中用抗7A6檢測出一個38KD蛋白質(zhì)。利用Jurkat細胞裂解液進行免疫雜交檢測以確定7A6抗原的分子特征。通過在Triton X-100裂解緩沖液中溶解制得正常的細胞、γ輻照或Ara-C處理的Jurkat細胞的細胞裂解液。細胞裂解液在還原條件下用SDS聚丙烯酰胺凝膠分離并轉(zhuǎn)移到用抗7A6雜交的硝酸纖維素膜上。如圖5所示，抗7A6在由輻照或Ara-C處理誘導(dǎo)的程序性凋亡的Jurkat細胞制備的細胞裂解液中檢測到一個分子量約為38KD的特異性蛋白質(zhì)帶(泳道1和2)。相反，在同樣實驗條件下源自正常Jurkat細胞的裂解液中未檢測到38KD的蛋白質(zhì)帶。此外，從含有SDS的裂解緩沖液制備的細胞裂解液中抗7A6也沒有檢測到38KD蛋白質(zhì)帶。由抗7A6限定的分子似乎位于線粒體膜上利用免疫金標(biāo)記的毛地黃皂苷透化的帶有抗7A6的細胞的電鏡觀察顯示在已由Ara-C處理過的Jurkat細胞的線粒體細胞器上的抗原呈小片狀分布。冰凍切片的免疫反應(yīng)性顯示抗7A6標(biāo)記線粒體而不標(biāo)記其他細胞器相關(guān)的蛋白質(zhì)(圖6A和B)。然而，觀察到抗7A6最顯著的標(biāo)記是在分離的線粒體上(圖6C和D)。利用Percoll-metrizamide梯度離心從正常的或Ara-C誘導(dǎo)的程序性凋亡的Jurkat細胞中分離線粒體，在免疫金標(biāo)記之前用毛地黃皂苷透化。發(fā)現(xiàn)抗7A6標(biāo)記從程序性凋亡的Jurkat細胞分離的線粒體膜上的抗原(圖6C)。在較高的電鏡放大倍數(shù)下，觀察到7A6的免疫標(biāo)記似乎是直接覆蓋在線粒體內(nèi)膜上，而不在線粒體的基質(zhì)內(nèi)(圖6D)。相反，抗7A6和從正常Jurkat細胞分離出的線粒體無反應(yīng)性(圖6E)。當(dāng)在同樣條件下使用一種同型匹配的對照抗體時，從程序性凋亡的Jurkat細胞分離的線粒體上未觀察到免疫金標(biāo)記(圖6F)。
抗7A6識別一種僅限于經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞中表達的線粒體膜蛋白質(zhì)上暴露的一個表位。本發(fā)明的單克隆抗體和免疫反應(yīng)性片段可用于區(qū)分正常細胞和程序性凋亡的細胞，研究程序性細胞凋亡的分子機理，診斷來自程序性細胞凋亡相關(guān)疾病的樣品和檢定程序性細胞凋亡的新型激動劑或拮抗劑(antogonists)。
參見Thompson的文章(1995，科學(xué)，267:1456-1462)，其中詳細描述了在病原學(xué)和疾病治療當(dāng)中程序性細胞凋亡的作用。如Thompso所說，通過細胞增殖和細胞死亡的平衡維持體內(nèi)平衡。生理性細胞死亡的發(fā)生主要通過“細胞自殺”或程序性細胞凋亡。細胞生存的更迭對于一系列人類疾病包括癌癥、病毒感染、自身免疫疾病、神位變性疾病和AIDS(獲得性免疫缺損綜合癥)的發(fā)病機制有作用，因此，為特異性改變程序性凋亡閾設(shè)計的治療可以有改變這些相關(guān)疾病的自然過程的潛力。
具體的，已知癌癥與程序性細胞凋亡的抑制相關(guān)而AIDS則與程序性細胞凋亡的增加有關(guān)。在用于癌癥和AIDS的治療的診斷應(yīng)用中檢測、區(qū)別、監(jiān)測或定量程序性凋亡細胞的方法中使用該抗體(抗7A6)落在本發(fā)明的范圍之中。
此外，本發(fā)明的抗體可用于篩選抑制或誘導(dǎo)程序性細胞凋亡的新型試劑的鑒定中。例如，比較利用本發(fā)明的抗7A6抗體處理過的或不處理的腫瘤樣品中的程序性凋亡細胞的水平進行體外鑒定，可以識別在腫瘤發(fā)生細胞中誘導(dǎo)程序性細胞凋亡的試劑。類似地，本發(fā)明的抗體也可以用于識別抑制如激活的HIV-感染的外周血淋巴細胞(PBL)的程序性細胞凋亡的試劑。
保藏產(chǎn)生抗7A6單克隆抗體的雜交瘤細胞培養(yǎng)物已于1996年3月14日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(A.T.C.C.),12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852，美國，保藏號為A.T.C.C.No.HB-12065。
權(quán)利要求
1．一種專一性結(jié)合到程序性凋亡的細胞中線粒體膜上一種抗原的單克隆抗體，該抗原在經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞中可檢測到且在正常細胞中檢測不到；且限定了一個含有38KD蛋白質(zhì)的細胞結(jié)構(gòu)。
2．權(quán)利要求1的單克隆抗體，其中所述單克隆抗體結(jié)合到7A6抗原的一個表位上。
3．權(quán)利要求1的單克隆抗體，其有與保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)No.HB12065的樣品有相同特征的細胞系生產(chǎn)的鼠同型IgG1。
4．一種專一性結(jié)合到程序性凋亡的細胞的線粒體膜上的一個表位且可區(qū)分人細胞群中正常細胞和程序性凋亡的細胞的單克隆抗體。
5．權(quán)利要求4的單克隆抗體，其中所述的程序性凋亡細胞是人外周血淋巴細胞、T細胞系、B細胞系、組織細胞細胞系和前髓細胞系。
6．一種由雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的雜合細胞系，其產(chǎn)生可專一性結(jié)合到經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞的線粒體膜上一種抗原的單克隆抗體。
7．權(quán)利要求6所述的雜合細胞系，其中所述細胞系由用程序性凋亡的Jurkat細胞免疫的鼠的脾細胞產(chǎn)生。
8．一種由雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的具有與保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),Rockville,Maryland,A.T.C.C.保藏號為HB12065的細胞系有相同特征的雜合細胞系。
9．一種根據(jù)權(quán)利要求1的抗體的免疫活性片段。
10．一種根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其與ATCC保藏號為HB12065的雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體的相同表位形成免疫復(fù)合物。
11．一種檢測和測量經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞的方法，包含(a)與選自熒光化合物、放射活性元素以及酶的檢測物偶聯(lián)的7A6單克隆抗體同生物學(xué)樣品接觸；(b)利用與所選擇的檢測物適宜的檢測和測量方法檢測和測量形成的免疫復(fù)合物；且(c)通過步驟(b)中檢測和測量復(fù)合物的結(jié)果確定在該生物學(xué)樣品中經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞的數(shù)量。
12．權(quán)利要求11的方法，其包括用流式細胞技術(shù)分選與所述偶聯(lián)的單克隆抗體結(jié)合的經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞的步驟。
13．一種區(qū)分人造血細胞群樣品中正常細胞和程序性凋亡的細胞的方法，其中包括確認為7A6單克隆抗體的單克隆抗體與該樣品在足以使所述抗體和程序性凋亡細胞之間形成免疫復(fù)合物的條件下接觸一段時間后，檢測該樣品中細胞和所述單克隆抗體之間的接觸形成的免疫復(fù)合物。
全文摘要
一種專一性結(jié)合程序性凋亡細胞的線粒體膜上的一種抗原的單克隆抗體。該抗原是在經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞中可檢測到而在正常細胞中檢測不到的38KD蛋白質(zhì)。此單克隆抗體的選擇性提供了一種從人造血細胞群樣品中區(qū)分正常細胞和程序性凋亡細胞的方法。也提供了一種檢測和測量經(jīng)歷程序性細胞凋亡的細胞的方法。
文檔編號C12P21/08GK1215406SQ97193514
公開日1999年4月28日 申請日期1997年3月28日 優(yōu)先權(quán)日1996年3月29日
發(fā)明者S·F·施洛斯曼, C·張 申請人:達娜-法勃腫瘤研究所