專利名稱：固相雜交酶顯色反應對基因擴增產(chǎn)物特異性定量測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種固相雜交酶顯色反應對基因擴增產(chǎn)物特異性定量測定方法，涉及一種對核酸分子進行特異性定量測定的簡單方法，屬醫(yī)學科技領(lǐng)域。
對樣品中微量核酸分子進行特異性定量測定在生物醫(yī)學實踐中有著非常重要的意義。如，最近證實在艾滋病病毒(HIV)感染中，患者血液中的病毒含量是最重要臨床指標，比CD4+細胞數(shù)能更準確地預測病情發(fā)展。而對丙型肝炎毒病感染來說，血液中HCV的含量是影響干擾素治療效果的兩個主要因素之一。這類病毒有兩個共同特點，一是在被感染者血中含量低，一般的分子雜交定量方法難于檢測到；二是病毒含量在不同個體中差異很大，跨度從10考貝/毫升血液到106-7考貝/毫升血液不等，這給對這類病毒進行定量測定造成了很大困難。至今人們已發(fā)展了幾種微量核酸定量測定方法，從技術(shù)路線上分為依賴于基因擴增技術(shù)的間接定量法和分子雜交直接定量法。目前基于基因擴增的定量方法，又分內(nèi)標法和雜交——酶聯(lián)顯色法(或熒光標記)。內(nèi)標法需要定量參比品，使用不方便并且靠主觀判讀，至今沒有被實際應用。而雜交——酶聯(lián)法，由于作為雜交探針的寡核苷酸是通過蛋白質(zhì)介導吸附在微孔反應板上，并對顯色系統(tǒng)的選用造成不良影響，使得最終顯色光密度值與基因擴增產(chǎn)物的定量對應關(guān)系不理想。另一方面，分枝DNA雜交技術(shù)，雖然可較好地直接反映被測樣品中靶基因序列的濃度，但其檢測敏感性較差，最低檢測限量為500考貝/毫升。
本發(fā)明的目的在于發(fā)明一種簡便、特異、快速的定量測定方法，應用耐熱DNA聚合酶和寡核苷酸引物，進行聚合酶鏈反應，可將待測樣品中含量微少或所占比例少的核酸分子進行特異性擴增，大大易化了對各種來源核酸分子的分析。
本發(fā)明通過高效地將寡核苷酸探針共價固化在微孔反應板上，以快速雜交，與生物素標記的寡核苷酸引物的擴增產(chǎn)物雜交等幾項技術(shù)組合，建立了一種可特異地對微少含量核酸進行定量檢測的簡單方法。并且通過確定微孔反應板固化探針的序列，可用來進行基因突變及基因型的分析。
共價固化就是將特定的化學物質(zhì)，與固相物體表面上的活性基團通過共價鍵相結(jié)合。固相分子雜交就是特異性的基因片段，與固相化的核苷酸探針進行的雜交。
本發(fā)明的技術(shù)特點及所涉及原理1、按靶基因片段所含序列或所需突變序列合成適當長度寡核苷酸探針，通過化學反應，定向共價結(jié)合于塑料微孔反應板(Covalink Nunc)；2、用生物素標記的寡核苷酸引物進行DNA聚合酶鏈反應；3、擴增產(chǎn)物與固相化寡核苷酸探針雜交；4、用辣根過氧化物酶標記的抗——生物素行結(jié)合顯色反應，以光密度值反映相應的靶基因考貝數(shù)。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1、敏感性高定量反應基因擴增產(chǎn)物，經(jīng)推算，可測出5—50考貝/反應；2、特異性高擴增產(chǎn)物固相雜交，排除了非特異性擴增產(chǎn)物的干擾，檢測反應非特異本底低；3、酶反應產(chǎn)物密度值與靶基因分子模板考貝數(shù)有良好的對應關(guān)系。
以對血清中丙型肝炎病毒含量定量檢測為例一、合成HCV5′非編碼區(qū)特異性寡核苷酸30mer5′末端磷酸化，500—5ng/孔，在50—12.5mM碳二亞胺的作用下，應用10mM 1-Melm，pH7.0的緩沖液，50℃孵育5小時，然后用洗液(2×SSC-0.1％SDS)洗板7次共7分鐘，去離子水洗3次，真空抽干密封，4℃存放。
二、取血清50ul，常規(guī)抽提RNA，42℃逆轉(zhuǎn)錄，應用特異性的5′末端生物素標記的引物，進行聚合酶鏈反應(94℃30sec，55℃30sec，72℃lmin，35cyc1es，72℃8min延伸)。
三、取擴增產(chǎn)物10ul，95℃變性10分鐘，后置冰浴冷卻2分鐘，加至包被好的微孔反應板中，加雜交液(50％Formamide，5×SSC，1×FPG，25mMKH2PO4，0.2％SDS，5％dextran sulfate，200ug/ml Salmon sperm carrier DNA)至100ul，混勻，37℃雜交60分鐘。然后應用上述洗液洗板4次共4分鐘。
四、3％小牛血清白蛋白封閉37℃10—20分鐘，加辣根過氧化物酶標記的SPavidin，2ug/ml 100ul，37℃孵育30分鐘，應用洗液(100mM Tris pH7.4，200mM NaCl，0.3％Tween 20)洗板，4次共4分鐘。OPD系統(tǒng)顯色，室溫避光約15分鐘，100ul 2N H2SO4終止反應，測OD492nm光密度值。
權(quán)利要求
1.一種固相雜交酶顯色反應對基因擴增產(chǎn)物特異性定量測定方法，其特征在于它是用生物素標記寡核苷酸引物的基因擴增產(chǎn)物與共價固化在微孔反應板上的特異基因片段雜交，經(jīng)酶標記的抗生物素行顯色反應進行基因定量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之測定方法，其特征在于按靶基因片段所含序列或所需突變序列合成適當長度寡核苷酸探針，通過化學反應，定向共價結(jié)合于塑料微孔反應板。
3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述之測定方法，其特征在于它適用于各種微量核酸分子進行特異性定量測定。
全文摘要
本發(fā)明為固相雜交酶顯色反應對基因擴增產(chǎn)物特異性定量測定方法，該方法使用生物素標記的寡核苷酸引物對靶基因序列進行擴增，然后將擴增產(chǎn)物與經(jīng)共價鍵固定在微孔反應板上的寡核苷酸進行分子雜交，通過抗—生物素—過氧化物酶系統(tǒng)反應顯色，對靶基因進行定量。
文檔編號C12Q1/68GK1147093SQ9610903
公開日1997年4月9日 申請日期1996年7月31日 優(yōu)先權(quán)日1996年7月31日
發(fā)明者王宇, 王鳳水 申請人:北京醫(yī)科大學人民醫(yī)院