專利名稱：腫瘤特異性dna序列的特異性擴增的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明包括用于癌癥檢測和診斷的方法。
背景技術(shù)：
用于癌癥篩選的現(xiàn)有方法是昂貴且很大程度上無效的，因此，大多數(shù)癌癥是在晚 期且難以治療的階段檢測到的。對于卵巢癌尤其如此。因此，對用于癌癥篩選的新方法的需 要已得到廣泛認同。大量近期的出版物已證明了癌癥患者的體液中循環(huán)核酸(circulating nucleic acid,CNA)的存在，并且已考慮了使用can進行癌癥檢測、跟蹤和預(yù)后的多種策略 (綜述于(Fleischhacker和Schmidt 2007))。最簡單的方法是比較癌癥患者和對照之間 的CNA總量。此類研究一般發(fā)現(xiàn)癌癥患者比無癌癥對照具有更多的CNA，但是還不能顯示腫 瘤大小、所處階段或類型與總CNA濃度之間的良好相關(guān)性。簡單的定量由于以下事實而進 一步復(fù)雜化許多其它病況例如慢性炎癥和慢性阻塞性肺病(COPD)伴有CNA水平的提高。使用CNA的更有前景的方法是檢測癌癥特異性序列的變化。已在胰腺癌、結(jié)腸直 腸癌、肺癌和卵巢癌患者的CNA中鑒定出K-RAS和/或P53的獲得性突變(Fleischhacker 和Schmidt 2007)。幾位作者已考慮到使用已知癌癥突變的檢測作為用于癌癥篩選的方法 的可能性。在一項此類研究中，作者發(fā)現(xiàn)篩選接受結(jié)腸鏡檢之患者的CNA中的K-RAS突變可 用于預(yù)測哪些人將具有結(jié)腸惡性腫瘤(Kopreski,Benko等人2000)。其它研究提供了相矛 盾的結(jié)果，這表明沒有單一的突變能提供有力的癌癥檢測(Yakubovskaya，SpiegeIman等 人 1995 ；Trombino, Neri 等人 2005)。已考慮的另一種途徑是分析微衛(wèi)星的不穩(wěn)定性，其提供了找到癌癥相關(guān)的序列變 化而無需靶向特異性的已知突變的途徑。幾項研究已顯示甚至在乳腺癌和肺癌的早期，循 環(huán) DNA 中就存在微衛(wèi)星變化(Chen, Bonnefoi 等人 1999 ；Sozzi, Musso 等人 1999 ；Sozzi, Conte 等人 2001)。DNA序列的表觀遺傳變化提供了從CNA樣本中特異性擴增癌癥DNA的第三種途徑。 迄今，超過40種出版物已報道了在各種癌癥患者的血液和體液的CNA中檢測癌癥相關(guān)之甲 基化改變的工作(Fleischhacker和Schmidt 2007)。在幾乎所有此類研究中，通過使用甲 基化特異性PCR，查詢到在癌癥中經(jīng)常被過度甲基化的一種或多種CpG島(Herman,Graff等 人1996)，并且大多數(shù)研究報道了一定程度的成功。取決于分析了哪種CpG，幾乎始終可以 在一定比例的患有給定類型癌癥的受試者中檢測到癌癥相關(guān)變化。一般而言，可從此項工 作得出結(jié)論，雖然特定基因座的甲基化改變經(jīng)常存在于癌癥患者的CNA中，但是沒有特定 的基因座確保成為有效檢驗的基礎(chǔ)。在一篇癌癥表觀遺傳學(xué)的綜述中，作者提出，大規(guī)模分 析CNA中的甲基化將能解決僅檢查一種或幾種基因座的問題，并推斷基于微陣列的甲基化 分析方法有極大希望用于癌癥檢測(Laird 2005)。為了實現(xiàn)大規(guī)模檢測CNA中癌癥相關(guān)的 甲基化變化，甲基化特異性DNA擴增的方法以及檢測甲基化差異的微陣列技術(shù)是必需的。由于腫瘤DNA可從患有各種不同類型癌癥(包括卵巢癌)的受試者的無細胞血漿 中常規(guī)回收，它提供了評估惡性腫瘤存在的有吸引力的方法。然而，使用循環(huán)DNA進行癌癥檢測受到兩個主要問題的制約。第一，循環(huán)DNA(或“CNA”)總是被大量的正常宿主DNA污 染。因此，特異性擴增腫瘤DNA的方法一般依賴于預(yù)先了解腫瘤和正常之間的基因組差異， 例如癌癥特異性突變或甲基化改變。這一制約嚴重限制了可擴增的基因座的數(shù)量。第二， 腫瘤是高度多樣化的，所以僅檢測一種或幾種腫瘤特異性基因組改變不太可能提供用于癌 癥檢測的有力方法。本發(fā)明通過允許在低甲基化腫瘤DNA與正常宿主DNA混合時對低甲基 化腫瘤DNA進行總體但高度選擇性的差異擴增并同時評估大量(> IO5)基因座的甲基化， 提供了對這兩個問題的解決方案。因此，本發(fā)明提供了通過高通量分析循環(huán)DNA的甲基化 進行癌癥篩選的新方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于癌癥(尤其是卵巢癌)的診斷評估和預(yù)后的方法。本發(fā)明提供選 擇性擴增來自受試者血清或血漿的低甲基化DNA的方法，該方法包括用甲基化敏感性酶 消化DNA ；將消化的DNA與接頭連接；對消化的DNA進行接頭介導(dǎo)的PCR擴增，以獲得PCR 產(chǎn)物；純化該PCR產(chǎn)物；并擴增經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物。在一個實施方案中，所述純化PCR產(chǎn)物 的擴增是通過以下實現(xiàn)的環(huán)化經(jīng)擴增的PCR產(chǎn)物；并對閉合的環(huán)狀分子進行等溫滾環(huán)擴 增以選擇性擴增低甲基化DNA，從而產(chǎn)生DNA樣品的甲基化敏感性展示。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供用于選擇性擴增來自受試者血清或血漿的低甲基 化DNA的方法，該方法包括用甲基化敏感性酶消化DNA ；將消化的DNA與接頭連接；對消 化的DNA進行接頭介導(dǎo)的PCR擴增，以獲得PCR產(chǎn)物；除去擴增產(chǎn)物中的接頭和引物DNA ； 環(huán)化經(jīng)擴增的PCR產(chǎn)物；用第二限制酶消化所述DNA，所述第二限制酶在添加所述接頭的位 點處消化所述DNA;除去消化的DNA中的接頭；使消化的DNA自身連接以形成閉合的環(huán)狀分 子；對所述環(huán)化分子進行外切核酸酶消化，以將任何未環(huán)化的DNA還原成單核苷酸；并對所 述閉合的環(huán)狀分子進行等溫滾環(huán)擴增以選擇性擴增低甲基化DNA，從而產(chǎn)生DNA樣品的甲 基化敏感性展示。通過以上方法制備的DNA然后可與定制的寡核苷酸微陣列雜交。在一個實施方案 中，所述陣列上的寡核苷酸對應(yīng)于理論上可在使用甲基化敏感性酶的第一消化步驟中產(chǎn)生 的DNA限制片段之一或其部分。每個陣列地址的信號強度取決于對應(yīng)于該地址的探針(經(jīng) 標記的DNA)的量。因此，信號強度高的陣列地址是相對更低甲基化的。通過比較正常對照 與癌癥患者的微陣列數(shù)據(jù)，獲得典型的癌癥甲基化圖譜。將從癌癥狀態(tài)未知的受試者獲得 的樣品的甲基化/微陣列結(jié)果與正常數(shù)據(jù)的機體進行比較。與正常的偏差指示有癌癥。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，提供了用于選擇性擴增得自受試者樣品之腫瘤 DNA的方法。本發(fā)明的方法包括(i)用甲基化特異性酶消化從受試者樣品中分離的DNA ； ( )將接頭連接于消化的DNA的末端；(iii)對所述消化的DNA進行接頭介導(dǎo)的PCR擴增； (iv)純化所述PCR產(chǎn)物，(ν)用限制酶消化經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物，所述限制酶識別部分或全 部包含于所述接頭內(nèi)的限制位點；(vi)環(huán)化所述純化的PCR產(chǎn)物；和(vii)對步驟(vi)的 產(chǎn)物進行等溫滾環(huán)擴增來選擇性擴增腫瘤DNA，以產(chǎn)生腫瘤DNA的甲基化敏感性展示。在 另一實施方案中，所述接頭介導(dǎo)的PCR中使用的PCR引物與在所述PCR產(chǎn)物后續(xù)純化中有 用的部分綴合。在一個實施方案中，所述PCR引物與生物素綴合。在另一實施方案中，所述 PCR產(chǎn)物通過使所述部分與支持物結(jié)合而純化。在一個實施方案中，所述接頭介導(dǎo)的PCR 引物是生物素化的，并且所得的PCR產(chǎn)物使用連接于支持物(例如，瓊脂糖、瓊脂糖凝膠(Sepharose)或磁珠)的生物素結(jié)合蛋白(例如，親和素或鏈霉親和素)進行純化。在一個 實施方案中，所述PCR產(chǎn)物通過用限制酶切割而從所述支持物釋放，所述限制酶識別由所 述接頭與用甲基化敏感性酶消化之DNA的連接形成的限制位點。在一個實施方案中，所述 接頭用MluI切割。在本發(fā)明的另一具體實施方案中，提供了用于選擇性擴增得自受試者樣品之腫瘤 DNA的方法。本發(fā)明的方法包括(i)用甲基化特異性酶消化從受試者樣品分離的DNA ； (ii) 將接頭連接于消化的DNA的末端；(iii)對所述消化的DNA進行接頭介導(dǎo)的PCR擴增以獲 得擴增的PCR產(chǎn)物；(iv)用限制酶消化所述擴增的PCR產(chǎn)物，所述限制酶在添加所述接頭 的位點處切割所述DNA ； (ν)將被切下的接頭從所述PCR產(chǎn)物中除去；(vi)環(huán)化所述PCR產(chǎn) 物；(vii)對環(huán)化的PCR產(chǎn)物進行核酸外切酶消化，以消化剩余的線性DNA分子；和(viii) 對步驟(vii)的產(chǎn)物進行等溫滾環(huán)擴增來選擇性擴增腫瘤DNA，以產(chǎn)生腫瘤DNA的甲基化敏 感性展示。本發(fā)明還提供用于鑒定腫瘤特異性低甲基化DNA區(qū)域的方法，該方法包括(i)使 用上文所述的方法分別從腫瘤DNA和正常DNA產(chǎn)生甲基化敏感性展示；(ii)標記所述腫瘤 DNA和對照DNA以產(chǎn)生經(jīng)標記的腫瘤DNA探針和經(jīng)標記的正常DNA探針；(iii)將所述經(jīng)標 記的DNA探針與寡核苷酸陣列雜交，其中所述寡核苷酸陣列對應(yīng)于給定甲基化敏感性酶的 預(yù)測限制片段或其部分；(iv)比較正常來源的探針和腫瘤來源的探針的相對強度，以鑒定 檢測差異量之腫瘤DNA探針的寡核苷酸；(ν)鑒定步驟(iv)中對應(yīng)于腫瘤特異性低甲基化 區(qū)域的雜交寡核苷酸。在一個實施方案中，兩種展示用不同的標記物(例如，不同的熒光染 料)標記并與同一陣列雜交。在另一實施方案中，所述經(jīng)標記的探針與單獨的微陣列雜交。本發(fā)明還提供了用于檢測受試者中的癌癥的方法。該方法包括使用上文所述的方 法產(chǎn)生得自患者之樣品的甲基化敏感性展示，然后標記所述DNA以產(chǎn)生經(jīng)標記的腫瘤DNA 探針。將所述經(jīng)標記的DNA探針與寡核苷酸陣列雜交，其中所述寡核苷酸陣列對應(yīng)于甲基 化特異性酶的預(yù)測限制片段或其部分。此類雜交將導(dǎo)致產(chǎn)生腫瘤DNA的甲基化圖譜，其中 所述圖譜包含多種基因座的甲基化狀態(tài)。然后將受試者樣品的甲基化圖譜與通過相同技術(shù) 產(chǎn)生的正常對照的甲基化圖譜進行比較，以確定受試者樣品的甲基化圖譜是否指示存在腫 瘤。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述腫瘤DNA探針和正常DNA探針用兩種不同的標記物 標記，并且經(jīng)標記的探針與一個陣列進行雜交。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明方法中待使用的受試者DNA樣品得自血漿 或血清。在本發(fā)明的又一實施方案中，所述甲基化特異性酶是HpyCh4-IV、ClaI, AclI或 BstBI。在一個實施方案中，所述甲基化特異性酶是HpyCh4-IV。在本發(fā)明的另一實施方案 中，所述接頭介導(dǎo)的PCR擴增執(zhí)行約5至約15個循環(huán)。在本發(fā)明的另一實施方案中，所述 接頭介導(dǎo)的PCR擴增執(zhí)行約10個循環(huán)。在本發(fā)明的一個實施方案中，Bal-31外切核酸酶 消化在所述環(huán)化步驟之后進行。本發(fā)明的一個實施方案提供試劑盒，該試劑盒包含施行本發(fā)明方法所必需的試劑 以及說明書。在一個實施方案中，所述試劑盒包含用于檢測和鑒定腫瘤DNA中低甲基化區(qū) 域的試劑和說明書。在另一實施方案中，所述試劑盒提供用于通過本發(fā)明的方法篩選存在 腫瘤之患者的試劑和說明書。在一個實施方案中，所述試劑盒包含甲基化敏感性酶、接頭 DNA、用于接頭介導(dǎo)之PCR的PCR引物、用于將接頭從PCR產(chǎn)物中除去的限制酶、用于檢測腫瘤相關(guān)的低甲基化區(qū)域的微陣列和施行該方法的說明書。一個實施方案提供用于檢測低甲基化區(qū)域的微陣列，其中所述微陣列包含通過以下方式選擇的寡核苷酸(a)將基因組分解為區(qū)段，所述區(qū)段的邊界為相關(guān)甲基化敏感性 限制酶的兩個位點(對于HpyCh4-IV來說是ACGT)并且長度低于500堿基對；(b)利用算法 分析這些片段的序列，目標是找到用于在微陣列上展示的合適序列。例如，適當?shù)墓押塑账?將具有一種或多種下列特性(i)大于約40個核苷酸的獨特序列，或大于約60個核苷酸的 獨特序列；(ii)約40%至約60%的GC，并且(iii)不應(yīng)含有顯著的重復(fù)或簡單序列，例如 連串的大于約15個單一堿基。在一個實施方案中，所述微陣列包含在檢測腫瘤相關(guān)的低甲 基化DNA中有用的這些寡核苷酸的子集。在一個實施方案中，寡核苷酸的該子集是通過以 下方法鑒定的(i)使用上文所述的方法分別產(chǎn)生腫瘤DNA和正常DNA的甲基化敏感性展 示；(ii)標記所述腫瘤DNA和對照DNA以產(chǎn)生經(jīng)標記的腫瘤DNA探針和經(jīng)標記的正常DNA 探針；(iii)將所述經(jīng)標記的DNA探針與寡核苷酸陣列雜交，其中所述寡核苷酸陣列對應(yīng)于 給定甲基化敏感性酶的預(yù)測限制片段或其部分；(iv)比較正常來源之探針和腫瘤來源之 探針的相對強度，以鑒定檢測差異量之腫瘤DNA探針的寡核苷酸；(ν)鑒定步驟(iv)的對 應(yīng)于腫瘤特異性低甲基化區(qū)域的雜交寡核苷酸；和(vi)比較來自多個患者的腫瘤特異性 低甲基化區(qū)域以確定可用于檢測患者中腫瘤的寡核苷酸的子集。


圖1.來自患有卵巢癌的受試者和正常對照的血漿DNA的甲基化微陣列比較。顯 示了含有112個區(qū)段的染色體21的 120kb區(qū)域。正強度比值指示來自癌癥樣品的相關(guān) 信號更多，而負比值指示來自正常樣品的相關(guān)信號增多。邊界非常尖銳的高對比度信號簇 是顯著的，并且?guī)缀鹾翢o疑問地反映了兩種樣品的內(nèi)在差異。
具體實施例方式本發(fā)明提供了選擇性擴增得自受試者的低甲基化腫瘤DNA序列用以檢測癌癥的 方法。該方法利用差異甲基化，以允許從含有高比例正常宿主DNA的DNA混合物中選擇性 擴增腫瘤特異性序列。本發(fā)明還提供了使用擴增的腫瘤DNA序列評估甲基化的方法。腫瘤DNA和非腫瘤DNA的甲基化差異 如上文所討論地，本發(fā)明依賴于腫瘤DNA和對照DNA之間的甲基化差異。對照DNA 理解為是來自正常(無癌癥)個體。DNA甲基化是通過改變基因表達來影響細胞功能的表 觀遺傳學(xué)事件，其是指由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化的向CpG 二 核苷酸中胞嘧啶的5-碳共價添加甲基基團。本發(fā)明的方法提供利用腫瘤DNA和非腫瘤DNA之間的甲基化差異，從得自受試者 的DNA樣品選擇性擴增低甲基化腫瘤DNA。如先前指出地，一般而言，所述方法包括以下步 驟從受試者中分離DNA ；對所述分離的DNA進行接頭介導(dǎo)的PCR ；環(huán)化所述擴增的PCR產(chǎn) 物；外切核酸酶消化；以及最后的等溫滾環(huán)擴增。該方法產(chǎn)生腫瘤DNA的甲基化敏感性展 示，即基于腫瘤DNA和非腫瘤患者DNA之間甲基化差異而擴增復(fù)制腫瘤DNA。本文所述的方法可應(yīng)用于得自受試者之細胞或細胞材料的DNA樣品。可使用本領(lǐng) 域已知的采集或分離所需細胞或材料的任何方法。在一個實施方案中，循環(huán)核酸(CNA)得自受試者的血清或血漿。接頭介導(dǎo)的PCR一般地，接頭介導(dǎo)的PCR開始于用限制酶消化DNA并將雙鏈接頭連接于經(jīng)消化 的末端。然后用對應(yīng)于所述接頭的引物進行PCR，并擴增出長達約1.5kb的片段。(參 見Saunders，Glover等人1989 ;Lisitsyn，Leach等人1994)。使用該技術(shù)，已可以從 單個細胞擴增DNA并隨后通過使用擴增產(chǎn)物進行比較雜交來檢測非整倍性。(Klein， Schmidt-Kittler等人1999)。在另一項研究中，通過將擴增展示用作針對BAC微陣列的 雜交探針，它們被用于檢測單一基因組拷貝數(shù)變化。(Guillaud-Bataille，Valent等人 )。在該方法中，限制酶的消化頻率決定了所得到的擴增產(chǎn)物的復(fù)雜度。通過選擇 稀有切割的酶，可將擴增展示的復(fù)雜度降低至起始基因組DNA的一小部分，使后續(xù)的雜交 步驟更加容易進行。該技術(shù)在希望進行兩個復(fù)雜基因組來源之間的比較雜交時特別有 用。一個顯著的實例就是稱為 “ROMA”(Itepresentational Oligonucleotide Microarray Analysis，展示性寡核苷酸微陣列分析)的技術(shù)，其有助于揭示人類中的基因組拷貝數(shù)高
胃。(Lucito， Healy 等)κ 2003 ；Sebat, Lakshmi 等)κ 2004 Jobanputra, Sebat 等)κ
2005)Lucito,R.等)κ, Genome Res. 13 2291-305 (2003) ；Sebat, J.等)κ, Science 305 525-8(2004) Jobanputra, V.等人，Genet Med 7:111-8(2005)。因此，在本發(fā)明的接頭介導(dǎo)的PCR步驟中，獲得DNA樣品并將其用CpG甲基化敏感 性酶消化，以形成具有經(jīng)消化末端的經(jīng)消化DNA。在一個實施方案中，所述DNA樣品是混合 的，包含宿主DNA和腫瘤DNA。通過在接頭連接之前使用CpG甲基化敏感性限制酶切割DNA，促進了邊界為非甲 基化位點之片段的擴增。在存在來自兩種不同來源之DNA的混合物(其中一種比另一種甲 基化程度低)時，用甲基化敏感性酶消化然后進行接頭連接和擴增允許選擇性擴增由差異 甲基化位點限定的片段。該想法已與“展示差異分析”聯(lián)合使用以檢測正常組織和癌組織 之間的甲基化差異。(參見Ushijima,Morimura等人1997 ；Kaneda, Takai等人2003)。甲 基化敏感性酶是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于HpyCh4-IV、ClaI、AclI和BstBI。在如上文所討論地用甲基化特異性酶消化從混合樣品獲得的DNA之后，將所述 DNA與接頭連接。在一個實施方案中，所述接頭具有內(nèi)置的限制位點或限制位點的部分，其 將稍后用于提供擴增經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物所必需的相容性粘性末端，例如可用于滾環(huán)擴增的 環(huán)化步驟的粘性末端。優(yōu)選在消化后產(chǎn)生粘性末端的限制酶位點。例如，MluI提供粘性末 端。連接所述接頭之后，所得的DNA使用與所述接頭內(nèi)的位點結(jié)合的引物進行擴增。 然后進行PCR擴增。循環(huán)數(shù)可有所變化。在一個實施方案中，循環(huán)數(shù)將產(chǎn)生經(jīng)消化片段的 大小選擇性展示。在本發(fā)明的一個實施方案中，進行約5至約15個擴增循環(huán)。在一個實施 方案中，進行約8至約14個擴增循環(huán)。在一個實施方案中，進行約10個擴增循環(huán)。在一個 實施方案中，所述PCR引物中的一種或多種與可用于后續(xù)純化步驟中的部分相綴合。在一 個實施方案中，所述部分是生物素。接頭介導(dǎo)的PCR產(chǎn)物的純化接頭介導(dǎo)的PCR所使用的弓I物可包含對純化PCR產(chǎn)物有用的部分。在一個實施方案中，所述PCR引物是生物素化的，并使用連接于支持物的生物素結(jié)合蛋白分離PCR產(chǎn)物。生物素結(jié)合蛋白包括例如親和素、鏈霉親和素和中性鏈親和素(NeutrAvidin)。在一個實施 方案中，所述生物素結(jié)合蛋白是鏈霉親和素。在一個實施方案中，所述支持物是瓊脂糖、瓊 脂糖凝膠或磁珠。在一個實施方案中，用于接頭介導(dǎo)的PCR的PCR引物是生物素化的，并且 所得PCR產(chǎn)物使用與磁珠連接的鏈霉親和素進行純化。然后可洗去不與支持物結(jié)合的其它 組分。然后使用限制內(nèi)切核酸酶從所述支持物上釋放擴增的PCR產(chǎn)物，所述限制內(nèi)切核酸 酶識別部分或全部包含于所述接頭內(nèi)的限制位點。在一個實施方案中，所述限制酶是MluI。MluI的識別序列(ACGCGT)與甲基化敏感性限制酶HpyCh4_IV的識別序列(ACGT) 重疊，從而當用HpyCh4-IV切割DNA并隨后將其連接于5’端包含序列CGCGT的接頭時，形 成了 MluI的限制位點。接頭介導(dǎo)的PCR和經(jīng)由例如生物素的部分將PCR產(chǎn)物與支持物連 接后，當使用MluI從接頭和支持物釋放PCR產(chǎn)物時，非特異性擴增產(chǎn)物將很大程度上保持 與接頭和支持物結(jié)合，這是因為它們不包含完整的MluI識別序列。因此，可從非特異性擴 增產(chǎn)物中純化接頭介導(dǎo)之PCR的特異性產(chǎn)物，所述非特異性擴增產(chǎn)物保持與支持物結(jié)合。在本發(fā)明的另一實施方案中，在進行擴增循環(huán)之后，然后用將所述接頭切下的酶 消化經(jīng)擴增的產(chǎn)物。例如，如果接頭引入了 MluI位點，則對所述產(chǎn)物進行MluI酶消化。在 消化切除接頭之后，低分子量DNA(接頭和引物DNA)被除去?？墒褂贸サ头肿恿緿NA的 任何合適方法，例如瓊脂糖凝膠純化或柱純化。同樣，HpyCh4-IV和MluI的組合與如上文 所述的合適接頭序列的使用確保了非特異性擴增產(chǎn)物不從接頭上釋放，并因此不可用于后 續(xù)的擴增步驟。經(jīng)純化PCR產(chǎn)物的擴增接頭介導(dǎo)的PCR產(chǎn)物一經(jīng)從接頭切割和純化后，稀釋經(jīng)純化的DNA。然后用T4DNA 連接酶過夜處理該DNA，以允許通過連接由先前酶消化形成的粘性末端來進行環(huán)化。通過 在非常稀的溶液(例如，于IX連接緩沖液中的0.5ml)中進行消化和連接，強烈地促進了 具有相容性粘性末端之分子的分子內(nèi)自身連接(環(huán)化)。已解鏈并部分地再退火多次(在 PCR擴增過程中)的原始起始DNA被消化和環(huán)化的效率則非常低。此外，缺乏適當末端的非 特異性擴增產(chǎn)物也極其不可能形成共價閉合環(huán)。然后將所述連接物用作等溫滾環(huán)擴增的模板。等溫滾環(huán)擴增是本領(lǐng)域已知的，并 且一般是使用外切核酸酶抗性隨機引物和具有極大加工能力的DNA聚合酶進行的環(huán)狀DNA 單循環(huán)擴增。可使用任何等溫滾環(huán)擴增程序。一種常見的試劑盒可從Amersham獲得并根 據(jù)生產(chǎn)商的建議使用。滾環(huán)擴增導(dǎo)致形成由環(huán)狀模板的多個拷貝組成的串聯(lián)結(jié)構(gòu)。在一個實施方案中，從接頭釋放經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物之后，進一步使用另外的連接 物介導(dǎo)之PCR步驟來擴增所述產(chǎn)物。外切核酸酶消化沉淀環(huán)狀DNA(使用本領(lǐng)域常見的方法)并將其重懸于合適的緩沖液(例如水)之 后，可通過用外切核酸酶進行充分的消化來處理連接混合物以除去非特異性PCR產(chǎn)物，所 述外切核酸酶攻擊單鏈DNA和雙鏈DNA的末端(例如核酸酶Bal-31)。連接生成的環(huán)狀分 子對消化具有抗性，但充分的消化將把任何線性分子還原成單核苷酸。因此使用此消化來 消除起始基因組DNA以及非特異性擴增的產(chǎn)物?；蛘?，可使用外切核酸酶的混合物來替代 單一種外切核酸酶(例如Bal-31)。例如，一種酶攻擊單鏈DNA (綠豆外切核酸酶)，而另一種酶攻擊雙鏈DNAU外切核酸酶)，并且其中任一種酶都不具有內(nèi)切核酸酶活性，而且也 不在切口處切割雙鏈DNA。術(shù)語“充分消化”意指使用足量的酶以使其不成為限制，并且消 化所允許的時間足夠長而不成為限制。例如，在一個實施方案中，使用2單位的Bal-31核 酸酶消化混合物，并使之進行45分鐘。所述“單位”在功能上定義為在40ng/ μ 1溶液中在 10分鐘內(nèi)消化400個堿基的線性DNA所需的酶量。陣列設(shè)計本發(fā)明還提供了寡核苷酸微陣列用于鑒定基因組的腫瘤特異性低甲基化區(qū)域的 用途。在一個具體實施方案中，所述方法包括(i)使用上文所述的方法分別從受試者和正 常對照的無細胞血漿DNA產(chǎn)生甲基化敏感性展示；(ii)標記腫瘤DNA和對照DNA以產(chǎn)生經(jīng) 標記的腫瘤DNA探針和經(jīng)標記的正常DNA探針；(iii)將所述經(jīng)標記的DNA探針與寡核苷酸 陣列雜交，其中所述寡核苷酸陣列對應(yīng)于給定甲基化敏感性酶的預(yù)測限制片段或其部分； (iv)比較正常來源之探針和腫瘤來源之探針的相對強度，以鑒定檢測差異量之腫瘤DNA探 針的寡核苷酸；(ν)鑒定步驟(iv)的對應(yīng)于腫瘤特異性低甲基化區(qū)域的雜交寡核苷酸。本發(fā)明還提供了通過使用微陣列檢測受試者中的癌癥的方法。該方法包括使用上 文所述方法選擇性擴增得自受試者樣品和正常對照的DNA，然后標記所述擴增的DNA以產(chǎn) 生經(jīng)標記的DNA探針，其中所述受試者來源的探針和正常對照來源的探針具有不同的標記 (例如，不同的熒光染料)。將經(jīng)標記的DNA探針與寡核苷酸陣列雜交，其中所述寡核苷酸 陣列對應(yīng)于甲基化特異性酶的預(yù)測限制片段。分析該陣列數(shù)據(jù)以確定雜交探針的相對信號 強度并確定從癌癥受試者與正常對照中優(yōu)先擴增了哪些區(qū)段。這樣的分析將導(dǎo)致產(chǎn)生腫瘤 DNA的甲基化圖譜，其中所述圖譜包含多個基因座的甲基化狀態(tài)。然后將受試者樣品的甲基 化圖譜與通過相同技術(shù)產(chǎn)生的正常對照的甲基化圖譜進行比較，以確定受試者樣品的甲基 化圖譜是否指示腫瘤的存在。在一個實施方案中，所述受試者探針和對照探針與兩個單獨 的陣列雜交。用于本發(fā)明實踐的陣列可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法產(chǎn)生。在本發(fā)明的一個 實施方案中，所述陣列將包含通過用選擇性擴增步驟中使用的甲基化敏感性酶酶促消化基 因組DNA產(chǎn)生的核酸片段。在另一實施方案中，所述陣列上的寡核苷酸對應(yīng)于可通過甲基 化敏感性限制酶產(chǎn)生的核酸片段或其部分(即，如果DNA完全未甲基化時所可能產(chǎn)生的片 段)的全部或子集。在一個實施方案中，微陣列上的寡核苷酸可以本領(lǐng)域已知的任何方式 (例如原位合成(在微陣列載玻片上)或點樣在微陣列載玻片上)來制備。早期研究已顯示甲基化差異在基因組中富含基因的部分顯著地更常見。因此，為 了使發(fā)現(xiàn)甲基化差異的可能性最大化，可在本發(fā)明實踐中使用靶向基因組中具有高基因含 量的區(qū)域的陣列設(shè)計。例如，在本發(fā)明的一個非限制性實施方案中，每條染色體可分為106bp的箱(bin)， 其從一個端粒開始并延伸至另一端粒。然后將使用來自UCSC瀏覽器的信息確定這些 3000個序列箱每一個中已知或預(yù)測基因的外顯子占總序列的百分比，并根據(jù)該統(tǒng)計對所有 箱進行排位。然后將選擇具有最高外顯子含量的那些箱用于在陣列中展示。富含基因的 106bp區(qū)段各含有符合包含于陣列中之大小標準的約2000個HpyCh4-IV片段，并且由于在 標準的385K陣列中可展示約120，000個此類片段，因此所述陣列將展示約60個這樣的序 列箱，或者說約60X IO6個堿基，其對應(yīng)于基因組DNA的約2%。
為了提供有力的雜交數(shù)據(jù)，每種基因組HpyCh4_IV片段可通過與這些片段雜交的 不同寡核苷酸展示在陣列上。如果可能，每種基因組片段在陣列上包括3種不同的寡核苷 酸通常是有益的?？墒褂蒙虡I(yè)服務(wù)機構(gòu)來篩選完整人類基因組序列中所有可能的“長聚 體”(longmer)寡核苷酸，其符合包含于基因組微陣列中的一系列標準。合適的區(qū)段是獨特 的，沒有連串的簡單序列，并具有適當?shù)念A(yù)測解鏈溫度。可向商業(yè)服務(wù)機構(gòu)提供如上文所定 義的200，000種片段套系，他們將確定哪些片段包含他們先前建立的合適寡核苷酸的至少 3種。由于目前的陣列具有用于385K寡核苷酸的空間(例如，NimbleGen陣列)，并由于每 種HypCh4-IV片段將由3種寡核苷酸展示，因此一個陣列足以展示約125K片段。為了確定 背景雜交，每個陣列中包括了一系列4000種隨機序列寡核苷酸。
陣列雜交陣列雜交可由商業(yè)服務(wù)機構(gòu)根據(jù)他們的標準方案來進行。在本發(fā)明的一個實施方 案中，使用兩種顏色“比較”來進行雜交，其中“測試"DNA用一種熒光染料標記，而“對照"DNA 用第二熒光染料標記。該方法最大限度地減少了假象和一致性問題，這是因為完全相同的 實驗條件應(yīng)用于“測試”樣品和“對照”樣品。如上文所討論地，每次雜交的對照將是不同 的正常受試者。應(yīng)當理解，因為數(shù)據(jù)是通過比較雜交產(chǎn)生的，所以數(shù)據(jù)分析不受實驗設(shè)計該 方面的限制。與每個陣列地址相關(guān)的歸一化強度可在所有雜交間進行比較，使得例如建立 一組陣列地址成為可能，所述陣列地址不可能在任何正常個體中造成高于閾值的信號。微陣列檢測可通過本領(lǐng)域已知的任何方法進行。DNA樣品(S卩，甲基化敏感性展 示)可用標記物標記，所述標記物可用于在微陣列上進行檢測，包括但不限于熒光標記物、 發(fā)光標記物、金粒標記物和電化學(xué)標記物。數(shù)據(jù)分析與微陣列的比較雜交已廣泛用于產(chǎn)生基因表達圖譜以及鑒定基因組拷貝數(shù)變化， 有大量用于此類微陣列數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)分析方法。在本發(fā)明中，數(shù)據(jù)可用于評估癌癥特異性差 異甲基化的基因組分布以及評估微陣列數(shù)據(jù)集之間相對信號強度的整體差異。例如，用于評估基因組拷貝數(shù)改變的已有生物信息學(xué)方法可用于數(shù)據(jù)分析，包括 “設(shè)定閾值” (Vissers，de Vries等人2003)、隱馬爾科夫模型(Sebat，Lakshmi等人2004)、 使用基因組位置的等級聚類(Wang，Kim等人2005)以及最近的一項稱為“最大后驗概率 (maximum-a-posteriori) ”或“MAP” 的技術(shù)(Daruwala，Rudra 等人 2004)。盡管這些方法 已開發(fā)用于檢測拷貝數(shù)變化而不是甲基化差異，但是總的問題是相似的，并且所述方法容 易適應(yīng)于我們的陣列產(chǎn)生的數(shù)據(jù)類型。一經(jīng)分析各數(shù)據(jù)集中差異信號的可靠聚類存在后，就可進行旨在區(qū)分癌癥與正 常的數(shù)據(jù)集之間的比較。幾項已發(fā)表的研究已具體地解決了在微陣列/甲基化數(shù)據(jù)情況 下此類比較的問題。例如，在一項涉及由8000個CpG島基因座固定的載玻片組成的小規(guī) 模微陣列測定研究中，等級聚類能夠鑒定兩個不同組的卵巢腫瘤，并且這與臨床參數(shù)相關(guān) (Wei, Chen等人2002)。在后續(xù)的出版物中(Wei，Balch等人2006)，同一研究組報道了通 過使用以下技術(shù)對該分析進行了擴展微陣列的顯著性分析(Significance Analysisof Microarrays, SAM) (Tusher, Tibshirani 等人 2001)和微陣列的預(yù)測分析(Prediction Analysis of Microarray,PAM) (Tibshirani，Hastie 等人 2OO2)以及用于解讀關(guān)于腫瘤甲 基化微陣列數(shù)據(jù)的其它生物信息學(xué)技術(shù)?？傮w而言，存在許多用于評估不同微陣列數(shù)據(jù)集之間相似性的方法，這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。本文引用的所有參考文獻均以其整體并入本文。
實施例實施例1.腫瘤相關(guān)低甲基化區(qū)域的鑒定為了測試患有卵巢腫瘤的受試者的CNA甲基化圖譜是否與正常對照的不同，冷凍的血清樣品從由于懷疑患有卵巢癌而在探查性手術(shù)之前抽取血液的女性獲得。從未患癌癥 的女性獲得類似的樣品。通過標準方法從Iml無細胞血清中制備DNA，對全部得到的樣品進 行如上文所述的甲基化敏感性擴增。將這樣一對樣品提交給NimbleGen以與陣列雜交，所 述陣列先前已用于分析滋養(yǎng)層甲基化。數(shù)據(jù)表明兩種擴增(癌癥和正常)都導(dǎo)致來自 5%的陣列地址的可測量信號 (定義為高于背景> 3sd)。另外，在這些情形的 70%中，信號的1呢2-比值小于11. 5 I， 表明即使從癌癥以及正常二者中都擴增出了區(qū)段，但是幾乎沒有或沒有差異擴增。該數(shù)據(jù) 表明在擴增血清DNA和使用擴增展示獲得微陣列信號兩方面均取得了成功。應(yīng)當注意，預(yù) 計非特異性擴增會造成分散的或隨機分布的雜交信號，但并未觀察到。此外，差異擴增區(qū)域 明顯成簇出現(xiàn)。圖1顯示來自染色體21上的小區(qū)域的數(shù)據(jù)，其包含癌癥樣本的高對比度信 號的簇。注意到，至少40個相鄰區(qū)段是差異擴增的，并且1呢2-比值高達5，這表示32倍的 差異擴增。這極不可能是由于實驗假象造成的，因此最有可能代表檢測原始樣品之間的真 實甲基化差異。這是信號強度的log2比值大于2的約50個簇(> 3個相鄰區(qū)段)中的一 個。下列實施例中描述的實驗旨在代表本發(fā)明可能的實施方案。應(yīng)當理解，所述材料 和量不限制本發(fā)明的范圍。實施例2.比較圖譜(Comparison Panel)的開發(fā)為了促進使用本發(fā)明方法的檢測和診斷，可比較正常群體和特定癌癥患者群體以 開發(fā)與特定類型癌癥相關(guān)的甲基化圖譜。本發(fā)明的方法可用于生成這樣的甲基化圖譜。使用標準方法從已知的癌癥患者和正常對照的血清或血漿中分離DNA(Johnson， K. L.等人，Clin. Chem. 50 516-21 (2004))。簡言之，將IOml患者血液離心兩次以除去細胞。 使所得血漿經(jīng)過DNA結(jié)合膜。將DNA從所述膜移下，并用HpyCh4-IV消化所得的DNA。將DNA接頭退火并與消化的DNA連接。將所述接頭設(shè)計為當與用HpyCh4_IV消 化的DNA連接時形成MluI限制位點。接頭介導(dǎo)的PCR根據(jù)Guillaud-Bataille，M.等人 Nucleic Acids Res. 32ell2(2004)所述來進行，其中進行10個PCR循環(huán)，并利用生物素化 的引物。PCR之后，利用鏈霉親和素包被的磁珠來純化產(chǎn)物。在PCR產(chǎn)物與所述珠結(jié)合并洗 滌之后，將它們用MluI消化以從擴增的DNA中除去接頭序列(和珠)。通過稀釋所述DNA 以促進分子內(nèi)連接并用T4 DNA連接酶處理來環(huán)化經(jīng)擴增的DNA。然后，使用商業(yè)試劑盒(例如，Amersham)并遵守生產(chǎn)商的說明將連接產(chǎn)物用作等 溫滾環(huán)擴增的模板。然后，可對通過以上方法制備的DNA進行標記并與定制的寡核苷酸微陣列雜交。 陣列上的每種寡核苷酸對應(yīng)于理論上可在使用甲基化敏感性酶的第一消化步驟中產(chǎn)生的DNA限制片段之一。使用兩種顏色“比較”來進行雜交，其中“測試"DNA用一種熒光染料(例 如，Cy3)標記，而“對照”DNA用第二熒光染料(例如，Cy5)標記。每次雜交的對照將是不 同的正常受試者。每個陣列地址的信號強度取決于對應(yīng)于該地址的探針的量。因此，信號強度高的 陣列地址是相對低甲基化的。通過比較正常對照的微陣列數(shù)據(jù)與腫瘤患者的微陣列數(shù)據(jù)， 可根據(jù)經(jīng)驗得出該腫瘤類型的典型甲基化圖譜。通過比較已知癌癥受試者與非癌癥受試者 所鑒定的甲基化差異將用于形成標準，該標準經(jīng)預(yù)測性地應(yīng)用而得以驗證。該方法可用于 形成多種腫瘤的甲基化圖譜，所述腫瘤包括但不限于卵巢腫瘤、肺腫瘤、前列腺腫瘤和乳腺 腫瘤。t施徹丨3.制各用干檢測丨低,甲某化腫瘤相關(guān)DNA的微陣歹1丨。將基因組分解為區(qū)段，所述區(qū)段的邊界是相關(guān)甲基化敏感性限制酶的兩個位點 (對于HpyCh4-IV來說是ACGT)，并且其長度小于500個堿基對。這提供了可從血清或血漿 DNA樣品擴增的一系列DNA區(qū)段。使用算法來分析這些片段的序列，目標是找到用于在微 陣列上展示的合適序列。例如，適當?shù)墓押塑账釋⒕哂幸环N或多種下列特性(i)大于約40 個核苷酸的獨特序列，或大于約60個核苷酸的獨特序列；(ii)約40%至約60%的GC，并且 (iii)不應(yīng)含有顯著的重復(fù)或簡單序列，例如連串的大于約15個單一堿基。陣列包含以這 種方式選擇的寡核苷酸，其中陣列上的每個寡核苷酸代表可通過本發(fā)明方法擴增的一種基 因組區(qū)段。此類陣列可用于使用本發(fā)明的方法檢測腫瘤相關(guān)的低甲基化區(qū)域、形成腫瘤的 甲基化圖譜和篩選腫瘤?！┦褂蒙鲜龅奈㈥嚵衼龛b定低甲基化的腫瘤相關(guān)DNA區(qū)域(在一般性腫瘤中或 者在一種或多種特定腫瘤類型中)，即可產(chǎn)生包含設(shè)計用來檢測那些DNA區(qū)域(通常與一般 性腫瘤或與一種或多種類型的腫瘤相關(guān))之寡核苷酸的微陣列，其用于使用實施例4的方 法檢測所述基因座處的腫瘤相關(guān)甲基化差異。實施例4.使用本發(fā)明診斷癌癥的方法使用標準方法從患者血清或血漿分離DNA(Johnson，K. L.等人，Clin. Chem. 50 516-21(2004))。簡言之，將IOml患者血液離心兩次以除去細胞。使所得血漿經(jīng)過DNA結(jié) 合膜。將DNA從所述膜上移下，并用HpyCh4-IV消化所得到的DNA。將DNA接頭退火并與消化的DNA連接。將所述接頭設(shè)計為當與用HpyCh4_IV消 化的DNA連接時形成MluI限制位點。接頭介導(dǎo)的PCR根據(jù)Guillaud-Bataille，M.等人 Nucleic Acids Res. 32ell2 (2004)所述來進行，其中進行10個PCR循環(huán)，并且引物被生物 素化。PCR之后，利用鏈霉親和素包被的磁珠來純化產(chǎn)物。在PCR產(chǎn)物與所述珠結(jié)合并洗 滌之后，將它們用MluI消化以從擴增的DNA中除去接頭序列(和珠)。通過稀釋所述DNA 以促進分子內(nèi)連接并用T4DNA連接酶處理來環(huán)化經(jīng)擴增的DNA。連接后，使用商業(yè)試劑盒(例如，Amersham)并遵守生產(chǎn)商的說明，將它們用作等 溫滾環(huán)擴增的模板。對通過以上方法制備的DNA進行標記，并與定制的寡核苷酸微陣列雜交。使用兩 種顏色“比較”來進行雜交，其中患者DNA用一種熒光染料標記，而對照DNA用第二熒光染 料標記。陣列上的每種寡核苷酸對應(yīng)于理論上可在使用甲基化敏感性酶的第一消化步驟中產(chǎn)生的DNA限制片段。每個陣列地址的信號強度取決于對應(yīng)于該地址的探針的量。因此， 信號強度高的陣列地址是相對低甲基化的。將從癌癥狀態(tài)未知的受試者獲得的樣品的甲基 化/微陣列結(jié)果與實施例2中得到的正常和癌癥數(shù)據(jù)的主體進行比較。與正常的偏差指示 有癌癥。比較微陣列數(shù)據(jù)的方法是本領(lǐng)域已知的。得到陽性結(jié)果后，可通過適當?shù)暮Y選例如MRI對患者進行篩選，以證實所述癌癥 診斷。這些方法適用于檢測多種腫瘤類型，包括但不限于卵巢腫瘤、肺腫瘤、前列腺腫瘤 和乳腺腫瘤。另外，該方法可用作一般性篩選測試。
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用于產(chǎn)生來自患者樣品的低甲基化腫瘤DNA甲基化敏感性展示的方法，該方法包括a)從患者樣品中分離DNA；b)用甲基化特異性酶消化所述DNA；c)將消化的DNA與接頭連接；d)對連接的DNA進行接頭介導(dǎo)的PCR擴增以獲得PCR產(chǎn)物；e)環(huán)化所述PCR產(chǎn)物；f)擴增經(jīng)環(huán)化的PCR產(chǎn)物以產(chǎn)生所述患者DNA的甲基化敏感性展示。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述患者樣品是血漿或血清。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲基化特異性酶是HpyCh4-IV、ClaI、AClI或BstBI。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲基化特異性酶是HpyCh4-IV。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述接頭介導(dǎo)的PCR擴增進行約5至約15個循環(huán)。
6.權(quán)利要求1述的方法，其中所述接頭介導(dǎo)的PCR擴增進行約10個循環(huán)。
7.權(quán)利要求1的方法，其中(d)的PCR產(chǎn)物通過沉淀來純化。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述PCR擴增使用生物素化的PCR引物來進行，所述PCR產(chǎn) 物利用連接于支持物的生物素結(jié)合蛋白進行純化。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述生物素結(jié)合蛋白是鏈霉親和素。
10.權(quán)利要求8的方法，其中所述支持物選自瓊脂糖、瓊脂糖凝膠和磁珠。
11.權(quán)利要求8的方法，其中使用識別位點部分或全部包含于所述接頭序列內(nèi)的限制 酶從所述支持物切下所述PCR產(chǎn)物。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述環(huán)化的PCR產(chǎn)物是通過滾環(huán)擴增進行擴增的。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤選自卵巢腫瘤、肺腫瘤、前列腺腫瘤或乳腺腫瘤。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述腫瘤是卵巢腫瘤。
15.用于產(chǎn)生來自患者樣品的低甲基化腫瘤DNA甲基化敏感性展示的方法，該方法包括a)從患者樣品中分離DNA；b)用HpyCh4-IV消化所述DNA；c)將消化的DNA與接頭連接，從而通過所述接頭與經(jīng)消化DNA的連接產(chǎn)生MluI識別位占.d)對消化的DNA進行接頭介導(dǎo)之PCR擴增以獲得PCR產(chǎn)物，其中使用生物素化的引物；e)使用連接于支持物的生物素結(jié)合蛋白純化經(jīng)擴增的PCR產(chǎn)物；f)用MluI消化所述PCR產(chǎn)物；g)環(huán)化經(jīng)消化的DNA；以及h)進行滾環(huán)擴增以產(chǎn)生所述患者DNA的甲基化敏感性展示。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述腫瘤選自卵巢腫瘤、肺腫瘤、前列腺腫瘤或乳腺腫瘤。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述腫瘤是卵巢腫瘤。
18.用于鑒定腫瘤特異性低甲基化DNA區(qū)域的方法，該方法包括a)使用權(quán)利要求1-17中任一項所述的方法分別產(chǎn)生腫瘤DNA和正常DNA的甲基化敏 感性展示；b)標記所述腫瘤DNA和所述對照DNA以產(chǎn)生經(jīng)標記的腫瘤DNA探針和經(jīng)標記的對照 DNA探針；c)將所述經(jīng)標記的DNA探針與寡核苷酸陣列雜交，其中所述寡核苷酸陣列對應(yīng)于給定 甲基化敏感性酶的預(yù)測限制片段或其部分；d)比較來自正常來源之探針和腫瘤來源之探針的信號的相對強度，以鑒定檢測差異量 之腫瘤DNA探針的寡核苷酸；e)鑒定步驟d的對應(yīng)于腫瘤特異性低甲基化區(qū)域的雜交寡核苷酸。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述腫瘤DNA探針和所述正常DNA探針用兩種不同的標 記物標記，并且其中經(jīng)標記探針與同一陣列進行雜交。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述DNA樣品來自血漿或血清。
21.用于檢測受試者中腫瘤存在的方法，該方法包括a)使用權(quán)利要求1-17中任一項所述的方法產(chǎn)生患者DNA的甲基化敏感性展示；b)比較在步驟a)的甲基化敏感性展示中擴增DNA的量與通過相同方法產(chǎn)生的正常 DNA甲基化敏感性展示中DNA的量；以及c)將步驟a)的甲基化敏感性展示中擴增DNA的量相對于正常DNA甲基化敏感性展示 的增加鑒定為腫瘤存在的指示。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述患者DNA展示和所述正常DNA展示被標記并與一個 或多個寡核苷酸微陣列雜交。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述腫瘤選自卵巢腫瘤、肺腫瘤、前列腺腫瘤或乳腺腫瘤。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述腫瘤是卵巢腫瘤。
25.制備用于檢測腫瘤DNA和正常DNA混合樣品中的低甲基化腫瘤DNA之微陣列的方 法，該方法包括a)根據(jù)權(quán)利要求18鑒定腫瘤特異性低甲基化DNA區(qū)域；b)選擇腫瘤特異性低甲基化DNA區(qū)域以及與所述腫瘤特異性低甲基化DNA區(qū)域雜交的 至少一種寡核苷酸；以及c)制備包含所選擇寡核苷酸的微陣列。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述腫瘤特異性低甲基化DNA區(qū)域被選擇為在多種腫瘤 樣品中是低甲基化的。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述多種腫瘤樣品是來自患有同一類型腫瘤之受試者的樣品。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述多種腫瘤樣品是來自患有不同類型腫瘤之受試者的樣品。
29.權(quán)利要求25的方法，其中在步驟(b)中選擇與所述腫瘤特異性低甲基化DNA區(qū)域 雜交的兩種或更多種不同的寡核苷酸。
30.權(quán)利要求25的方法，其中在步驟(b)中選擇多種腫瘤特異性低甲基化DNA區(qū)域。
31.權(quán)利要求25的方法，其中所述微陣列還包含與腫瘤DNA中的非低甲基化DNA區(qū)域 雜交的一種或多種寡核苷酸對照。
32.權(quán)利要求25的制備微陣列的方法，其中所述寡核苷酸被選擇用以檢測腫瘤中低甲基化的基因座，所述腫瘤選自卵巢腫瘤、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、肺腫瘤或這些腫瘤類型的 任何組合。
33.權(quán)利要求25的制備微陣列的方法，其中所述寡核苷酸被選擇用以檢測卵巢腫瘤中 低甲基化的基因座。
34.微陣列，其通過權(quán)利要求25至33中任一項的方法制備。
35.制備用于檢測腫瘤DNA和正常DNA之間甲基化差異的微陣列的方法，該方法包括a)從患者樣品中分離DNA，其中所述患者已被診斷為患有腫瘤；b)用甲基化特異性酶消化所述DNA；c)將消化的DNA與接頭連接；d)對所述消化的DNA進行接頭介導(dǎo)的PCR擴增，以獲得擴增的PCR產(chǎn)物；e)從所述擴增產(chǎn)物中除去接頭和引物DNA;f)環(huán)化所述擴增的PCR產(chǎn)物；g)對步驟f的產(chǎn)物進行等溫滾環(huán)擴增以選擇性擴增腫瘤DNA，從而產(chǎn)生腫瘤DNA的甲 基化敏感性展示；h)標記所述腫瘤DNA以產(chǎn)生經(jīng)標記的腫瘤DNA探針；i)將所述經(jīng)標記的DNA探針與寡核苷酸陣列雜交，其中所述寡核苷酸陣列對應(yīng)于所述 甲基化特異性酶的預(yù)測限制片段；j)產(chǎn)生所述腫瘤DNA的甲基化圖譜，其中所述圖譜包含多個基因座的甲基化狀態(tài)； k)比較多種正常樣品和患者樣品的甲基化圖譜，以鑒定腫瘤DNA中低甲基化的基因 座；以及1)產(chǎn)生包含設(shè)計用以檢測腫瘤DNA中低甲基化基因座之寡核苷酸的微陣列。
全文摘要
本發(fā)明提供用于癌癥檢測和診斷的方法。本發(fā)明提供選擇性擴增得自受試者的低甲基化腫瘤DNA序列以檢測癌癥的方法。此方法利用差異甲基化，以允許從含有高比例正常宿主DNA的DNA混合物中選擇性擴增腫瘤特異性序列。本發(fā)明還提供使用所擴增的腫瘤DNA序列評估甲基化的方法。
文檔編號C12Q1/68GK101815792SQ200880102505
公開日2010年8月25日 申請日期2008年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月22日
發(fā)明者斯蒂芬·A·布朗 申請人:紐約市哥倫比亞大學(xué)托管會