專利名稱：使用寡核苷酸和顯著缺乏5′-3′核酸外切酶活性的聚合酶抑制擴(kuò)增的制作方法
使用寡核苷酸和顯著缺乏5' -3'核酸外切酶活性的聚合酶
抑制擴(kuò)增
背景技術(shù)：
存在對快速而可靠的核酸分類/鑒定需求的眾多實(shí)例，尤其是在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。例 如，許多疾病，包括癌癥，是罕見突變的結(jié)果。檢測這些突變可以有助于診斷和預(yù)后的確定。
此外，快速而可靠基因分型方法有助于確定個(gè)體內(nèi)和個(gè)體間的等位基因組成。例
如，個(gè)體中特定等位基因的可靠分類可以幫助人的遺傳咨詢，并且甚至在檢測到特異性等 位基因的情況中，可以幫助計(jì)劃預(yù)防性的治療。特定等位基因的鑒定在進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇 中也是非常有用的，例如，作物或動(dòng)物育種項(xiàng)目，病原體和其他生物體的鑒定和基因分型。
發(fā)明簡述 本發(fā)明提供了檢測目標(biāo)序列的方法，其中所述目標(biāo)序列在生物樣品的多核苷酸 中，其中樣品可以另外或可替換地含有包含第二序列的第二多核苷酸，其中第二序列至少 有一個(gè)核苷酸不同于目標(biāo)序列。在一些實(shí)施方案中，該方法包括， i.在允許阻斷劑寡核苷酸(blocker oligonucleotide)與第二序列或目標(biāo)序列 (如果存在)雜交的條件下，將樣品與阻斷劑寡核苷酸接觸， ii.在使得產(chǎn)生引物的模板依賴性延伸的條件下，在雜交的阻斷劑寡核苷酸的存 在下，將樣品與至少一種引物和顯著缺乏5'-3'核酸外切酶活性的聚合酶接觸，其中引物與 阻斷劑寡核苷酸雜交序列的上游多核苷酸(如果存在)雜交； 其中阻斷劑寡核苷酸與第二序列的雜交足以削弱第二序列通過聚合酶的擴(kuò)增，其 中阻斷劑寡核苷酸不包含嵌入核苷酸，并且進(jìn)一步其中寡核苷酸與目標(biāo)序列的雜交沒有顯 著削弱目標(biāo)序列通過顯著缺乏5' -3'核酸酶活性的聚合酶的擴(kuò)增。 本發(fā)明還提供了反應(yīng)混合物。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物包括顯著缺乏 5' _3'核酸外切酶活性的聚合酶；含有目標(biāo)序列的多核苷酸；含有第二序列的多核苷酸，其 中第二核酸至少有一個(gè)核苷酸不同于目標(biāo)序列；與第二序列和目標(biāo)序列雜交的阻斷劑寡核 苷酸；其中阻斷劑寡核苷酸與第二序列的雜交足以削弱在適于在不存在阻斷劑寡核苷酸時(shí) 擴(kuò)增的條件下第二序列通過聚合酶的擴(kuò)增，但寡核苷酸與目標(biāo)序列的雜交沒有顯著削弱目 標(biāo)序列通過顯著缺乏5' -3'核酸酶活性的聚合酶的擴(kuò)增。 本發(fā)明還提供了試劑盒。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括顯著缺乏5' -3'核酸外 切酶活性的聚合酶；含有目標(biāo)序列的多核苷酸；含有第二序列的多核苷酸，其中第二核酸 至少有一個(gè)核苷酸不同于目標(biāo)序列；與第二序列和目標(biāo)序列雜交的阻斷劑寡核苷酸，其中 阻斷劑寡核苷酸與第二序列的雜交足以削弱在適于在不存在阻斷劑寡核苷酸時(shí)擴(kuò)增的條 件下第二序列通過聚合酶的擴(kuò)增，但寡核苷酸與目標(biāo)序列的雜交沒有顯著削弱目標(biāo)序列通 過顯著缺乏5' -3'核酸酶活性的聚合酶的擴(kuò)增。 根據(jù)該方法，本發(fā)明的試劑盒或優(yōu)選阻斷劑寡核苷酸不含有嵌入核苷酸。
進(jìn)一步優(yōu)選的是，在在此所述的方法、試劑盒或混合物中，阻斷劑寡核苷酸與第二 序列的雜交足以削弱第二序列通過顯著缺乏5' -3'核酸酶活性的聚合酶的擴(kuò)增，但該雜交 沒有顯著削弱具有5' -3'核酸酶活性的聚合酶的擴(kuò)增。
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在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，目標(biāo)序列為5-100個(gè)核苷酸長。 在在此所述方法、試劑盒或混合物進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品含有目標(biāo)序列 和第二序列。優(yōu)選，第二序列以目標(biāo)序列濃度至少十倍的濃度存在于樣品中。在此所述方
法、試劑盒或混合物的目標(biāo)序列和第二序列的濃度優(yōu)選為約i:i的比例。 根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸特別是基因組DNA。優(yōu)選，多核苷酸是RNA。
在此所述方法、試劑盒或混合物中所用的阻斷劑寡核苷酸通常是可檢測標(biāo)記的。 根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選可檢測標(biāo)記的阻斷劑寡核苷酸是實(shí)時(shí)檢測的，由此檢測目標(biāo)序列的擴(kuò)增。
在在此所述方法、試劑盒或混合物的優(yōu)選實(shí)施方案中，在第二序列和目標(biāo)序列之 間存在單個(gè)核苷酸差異，并且除了在該單個(gè)核苷酸的位置，阻斷劑寡核苷酸與目標(biāo)序列完 全互補(bǔ)。優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明，在第二序列和目標(biāo)序列之間存在2-6個(gè)核苷酸差異，并且除了在 該2-6個(gè)核苷酸的位置，阻斷劑寡核苷酸與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)。 在在此所述方法、試劑盒或混合物的優(yōu)選實(shí)施方案中，(1)阻斷劑寡核苷酸和第二 序列的解鏈溫度；和(2)阻斷劑寡核苷酸和目標(biāo)序列的解鏈溫度之間的差異為至少5t:，根 據(jù)在2. 5%甘油、50慮Tricin印H8. 3、45mM醋酸鉀中測量的。在在此所述方法、試劑盒或混 合物的優(yōu)選實(shí)施方案中，阻斷劑寡核苷酸對于第二序列的Tm高于阻斷劑寡核苷酸對于目 標(biāo)序列的Tm不超過2(TC，根據(jù)在2. 5%甘油、50慮Tricin印H8. 3、45mM醋酸鉀中測量的。
在在此所述方法、試劑盒或混合物的優(yōu)選實(shí)施方案中，阻斷劑寡核苷酸含有至少 一個(gè)非天然的非嵌入核苷酸，其中與對照寡核苷酸相比，非天然核苷酸提高了阻斷劑寡核 苷酸的解鏈溫度，除了天然核苷酸代替了非天然核苷酸，對照寡核苷酸在其他方面與阻斷 劑寡核苷酸相同。 根據(jù)本發(fā)明的阻斷劑寡核苷酸可以含有至少一個(gè)非核苷酸部分，其中與對照寡核 苷酸相比，非天然核苷酸部分提高了阻斷劑寡核苷酸的解鏈溫度，除了缺少非核苷酸部分， 對照寡核苷酸在其他方面與阻斷劑寡核苷酸相同。對于在此所述的方法、試劑盒或混合物， 非核苷酸部分結(jié)合DNA的小溝是優(yōu)選的。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，阻斷劑寡核苷酸與第二序列雜交，具有至少7(TC的解鏈溫 度，該解鏈溫度是在2. 5%甘油、50慮Tricine pH8. 3、45mM醋酸鉀中測量的。
定義 如本說明書和所附權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式"一 (a)"、"一 (an)"禾口"該 (the)"包括復(fù)數(shù)指代物，除非文中另外明確指出。因此，例如，關(guān)于"一種寡核苷酸(an oligonucleotide)"包括多種寡核苷酸；關(guān)于"一個(gè)探針(a probe)"包括這樣的探針的混 合物等。 如在此所用的，"生物樣品"指的是含有或推測含有核酸的任何物質(zhì)(例如，來自細(xì) 菌、病毒、組織活體檢查等)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式獲得。這樣的樣品 可以是一定含量的組織或流體，或其純化級(jí)分，分離自 一個(gè)或幾個(gè)個(gè)體，包括但不限于，例 如，皮膚、血漿、血清、全血、脊髓液、唾液、外周流體、淋巴流體、房水或玻璃體、滑液、尿液、 淚液、血細(xì)胞、血液制品、精子、精液、陰道分泌物、肺流出物、漿膜液、器官、支氣管肺泡灌洗 物、腫瘤、石蠟包埋組織等。樣品還可以包括體外細(xì)胞培養(yǎng)物的組分和成分，包括但不限于， 從細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞生長獲得的條件培養(yǎng)液，重組細(xì)胞，細(xì)胞成分等?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知 的程序從生物樣品獲得核酸。
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如在此所用的"阻斷劑寡核苷酸"指的是如下的寡核苷酸 (1)在足夠低的解鏈溫度下與目標(biāo)序列形成雙鏈體，以允許顯著缺乏5' -3'核酸 外切酶活性的聚合酶來取代阻斷劑寡核苷酸并復(fù)制目標(biāo)序列；禾口 (2)在足夠高的解鏈溫度下與第二序列形成雙鏈體(第二序列是目標(biāo)序列的變 體)，以削弱顯著缺乏5' -3'核酸外切酶活性的聚合酶復(fù)制目標(biāo)序列。 阻斷劑寡核苷酸可以是，但不必需，包括在3'端的修飾，以阻止阻斷劑寡核苷酸通 過聚合酶的3'延伸。"目標(biāo)序列"指的是生物樣品中待檢測的多核苷酸序列并且是與阻斷劑寡核苷酸
的雜交區(qū)完全或部分互補(bǔ)的核酸片段(子序列或序列)。"目標(biāo)序列"可以是至少5個(gè)核苷
酸長的任何長度。目標(biāo)序列可以是較大基因序列的一部分或待檢測的其他序列。 短語"削弱擴(kuò)增"指的是消除、抑制或可測量地降低序列的擴(kuò)增。如在此所述的，
通過選擇對于目標(biāo)變體比對于目標(biāo)具有更高解鏈溫度的阻斷劑寡核苷酸，可以削弱目標(biāo)變
體的擴(kuò)增，由此允許提高的目標(biāo)序列的擴(kuò)增和檢測。 術(shù)語"核酸"和"多核苷酸"可以互換使用，并且指的是核糖核酸(RNA)或脫氧核 糖核酸(DNA)聚合物的單體的聚合物或其類似物。這包括核苷酸如RNA和DNA的聚合物， 及其修飾形式，肽核酸(PNA)，鎖核酸(LNA)等。在特定的應(yīng)用中，核酸可以是包括多個(gè)單體 類型的聚合物，例如，RNA和DNA兩者的亞基。核酸可以是或包括，例如，染色體或染色體片 段，載體(例如，表達(dá)載體)，表達(dá)盒，裸NDA或RNA聚合物，擴(kuò)增子，寡核苷酸，引物，探針等。 核酸可以是，例如，單鏈或雙鏈的，或DNA :RNA雜交體，DNA和RNA嵌合結(jié)構(gòu)。術(shù)語"核酸"、 "多核苷酸"和"寡核苷酸"之間的長度沒有預(yù)定的區(qū)別，并且在此可以將術(shù)語互換使用，除 非文中另外明確指出。這樣的術(shù)語只是指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。"引物的延伸"指的是結(jié)合生物催化劑如聚合酶的核苷酸以模板特異性方式將核 苷酸添加至引物3'端的能力。延伸不僅指的是將第一個(gè)核苷酸添加至引物的3'端，而且 還包括通過延伸的聚合物形成的多核苷酸的任何進(jìn)一步的延伸。 核酸通常是單鏈或雙鏈的，并且通常含有磷酸二酯鍵，盡管在一些情況中，如在 此所列出的，包括具有可替換主鏈的核酸類似物，包括，例如但不限于，磷酰胺(Beaucage 等，(1993) Tetrahedron 49(10) :1925，以及其中的參考文獻(xiàn)；Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35 :3800 ;Sprinzl等，(1977)Eur. J. Biochem. 81 :579 ;Letsinger等，(1986)Nucl. Acids Res. 14 :3487 ;Sawai等，(1984) Chem. Lett. 805 ;Letsinger等，(1988) J. Am. Chem. Soc. 110 :4470和Pauwels等，(1986) ChemicaScripta 26 :1419)，硫代磷酸酯(Mag等， (1991) Nucleic Acids Res. 19 :1437和U. S. Pat. No. 5， 644， 048) ， 二硫代磷酸酯(Briu等， (1989)J. Am. Chem. Soc. Ill :2321)， 0-甲基亞磷酰胺連接(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues :A Practical Approach (寡核昔酸禾口類似物實(shí)踐方法)，Oxford University Press (1992))，和肽核酸主鏈和連接(Egholm(1992) J. Am. Chem. Soc. 114 : 1895 ;Meier等，(1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31 :1008 ;Nielsen (1993) Nature 365:566 和Carlsson等，(1996)Nature 380:207)。其他類似核酸包括具有正電荷主鏈(Denpcy 等，(1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097);非離子主鏈(U. S. Pat. Nos. 5， 386， 023， 5， 637， 684， 5， 602， 240， 5， 216， 141和4， 469， 863 ;Angew (1991) Chem. Intl. Ed. English 30 : 423 ;Letsinger等，(1988) J. Am. Chem. Soc. 110 :4470 ;Letsinger等，(1994) Nucleoside
6緒ucleotide 13 :1597 ;ASC Symposium Series 580， ，， CarbohydrateModifixations in Antisense Research"(反義研究中的碳水化合物修飾)，第2和第3章，編輯Y. S. Sanghvi 禾口 P. Dan Cook ;Mesmaeker等，(1994)Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4 :395 Jeffs 等，(1994) J. Biomolecular NMR 34 :17 ;Tetrahedron Lett. 37 :743 (1996))和非核糖主 鏈的那些，包括U. S.專利No. 5， 235， 033和5， 034， 506，以及ASCSymposium Series 580， Carbohydrate Modifications in Antisense Research (反義研究中的碳水化合物修飾)， 第6和第7章，編輯Y. S. Sanghvi和P. Dan Cook中描述的那些。含有一個(gè)或更多個(gè)碳環(huán)糖 的核酸也包括在核酸的定義內(nèi)(Jenkins等，(1995) Chem. Soc. Rev.卯169-176)。還描述了 幾種核酸類似物，例如，見Rawls，C & E News, 1997年6月2日，p35。可以進(jìn)行核糖-磷酸 酯主鏈的這些修飾，以促進(jìn)其他部分如標(biāo)記部分的添加或改變這些分子在生理環(huán)境中的穩(wěn) 定性和半衰期。 除了通常在核酸中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)生的雜環(huán)堿基(例如，腺嘌呤，鳥嘌呤，胸腺嘧 啶，胞嘧啶和尿嘧啶)，核酸類似物還包括具有非天然產(chǎn)生的雜環(huán)或其他修飾堿基的那些， 其中許多在此得到了描述，或另外進(jìn)行了參考。特別地，許多非天然產(chǎn)生的堿基進(jìn)一步描述 于，例如，Seela等，(1991)Helv. Chim. Acta 74 :1790， Grein等，(1994)Bioorg. Med. Chem. Lett. 4 :971-976和Seela等，(1999)Helv. Chim. Acta 82:1640。為了進(jìn)一步說明，任選包 括作為解鏈溫度(Tm)修飾劑的核苷酸中所用的特定堿基。例如，這些中的一些包括7-雜 氮嘌呤(例如，7-雜氮鳥嘌呤、7-雜氮腺嘌呤等)，吡唑[3，4-D]嘧啶，丙炔基-dN(例如， 丙炔基-dU，丙炔基-dC等)等。參見，例如，U.S.專利No. 5，990，303，發(fā)明名稱為"7-去 氮-2'-脫氧鳥苷核苷酸"，其于1999年ll月23日授權(quán)于Seela。其他代表性的雜環(huán)堿基 包括，例如，次黃嘌呤，肌苷，黃嘌呤；2-氨基嘌呤、2， 6- 二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次 黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤的8-氮雜衍生物；腺嘌呤、鳥嘌呤、2-氨基嘌呤、2， 6- 二氨基嘌呤、 2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和黃嘌呤的7-去氮-8-氮雜衍生物；6-氮胞嘧啶；5-氟
胞嘧啶；5_氯胞嘧啶；5_碘胞嘧啶；5_溴胞嘧啶；5_甲基胞嘧啶；5_丙炔基胞嘧啶；5_溴 乙烯尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶，4-乙酰胞嘧啶， 5-(羧基羥甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷，5-羧甲基氨甲基尿嘧啶，二氫尿嘧 啶，P-D-galactosylqueosine，肌苷，N6-異戊烯基腺嘌呤，1_甲基鳥嘌呤，l-甲基肌苷， 2，2-二甲基鳥嘌呤，7-去氮腺嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲 基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，7-去氮鳥嘌呤，5-甲基氨甲基尿嘧啶，5-甲氧 基氨甲基-2-硫尿嘧啶，P-D-mannosylqueosine，5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5_甲氧基尿 嘧啶，2_甲基硫-N-6-異戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧醋酸(v)， wybutoxosine，假尿嘧啶， 9116081116，2-硫胞嘧啶，5-甲基_2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶， 尿嘧啶_5-氧醋酸甲酯，3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶，(acp3) w， 2， 6- 二氨基嘌呤和 5-丙炔基嘧啶等。 修飾的堿基和核苷酸的其他實(shí)例還描述于，例如，U. S.專利No. 5， 484， 908，發(fā)明 名稱為"含有5-丙炔基嘧啶的寡核苷酸"，1996年1月16日授權(quán)于Froehler等，U. S.專 利No. 5， 645， 985，發(fā)明名稱為"使用含有修飾的嘧啶酮的寡聚物提高三鏈螺旋和雙螺旋 形成"，1997年7月8日授權(quán)于Froehler等，U.S.專利No. 5， 830， 653，發(fā)明名稱為"含 有修飾的嘧啶酮的寡聚物的使用方法"，1998年11月3日授權(quán)于Froehler等，U.S.專利No.6，639，059，發(fā)明名稱為"[2. 2.1]雙環(huán)核苷酸的合成"，2003年10月28日授權(quán) 于Kochkine等，U. S.專利No. 6， 303， 315，發(fā)明名稱為"復(fù)雜生物樣品中核酸的一步樣 品制備和檢測"，2001年10月16日授權(quán)于Skouv，和Kochkine等的U.S.專利申請公開 No. 2003/0092905，發(fā)明名稱為"[2. 2.1]雙環(huán)核苷酸的合成"，2003年5月15日公開。
沒有打算將本發(fā)明限于核酸、多核苷酸或寡核苷酸的來源。這樣的核酸可以來自 人或非人動(dòng)物，或任何其他生物體(例如，植物，兩棲動(dòng)物，細(xì)菌，病毒，支原體等)，組織或 細(xì)胞，或源自任何重組來源，在體外合成或通過化學(xué)合成。再者，核酸可以是DNA、RNA、cDNA、 DNA-RNA、鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、雜交體或上述的任何混合物。核酸可以以雙鏈、單鏈 或部分雙鏈的形式存在。本發(fā)明的核酸包括核酸及其片段，以純化或未純化形式，包括基 因、染色體、質(zhì)粒、生物材料的基因組，生物材料如微生物，例如，細(xì)菌、酵母、病毒、類病毒、 霉菌、真菌、植物、動(dòng)物、人、支原體等。"聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)延伸條件"指的是如下的條件在該條件下，與模板核酸雜交的 引物在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)退火步驟過程中通過聚合酶得到延伸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了 解這樣的條件可以改變，并且通常受離子強(qiáng)度和溫度的影響。各種PCR退火條件描述于，例 如，PCR Strategies (M.A. Innis，D. H. Gelfand禾口 J. J. Sninsky編輯，1995，Academic Press, 圣地亞哥，CA)，第14章；PCR Protocols :A Guide to Methods andApplications (PCR實(shí) 驗(yàn)方案方法和應(yīng)用指南)，(M. A. Innis， D. H. Gelfand， J. J. Sninsky和T. J. White編輯， Academic Press, NY，1990)。 至少一個(gè)核酸片段(即，至少兩個(gè)連續(xù)堿基)可以與另一個(gè)核酸的至少一個(gè)亞序 列反向平行地結(jié)合或雜交以形成雙鏈體時(shí)，核酸對于另一個(gè)核酸是"互補(bǔ)的"。反向平行結(jié) 合可以是分子內(nèi)的，例如，核酸內(nèi)的發(fā)夾環(huán)形式，或分子間的，如兩個(gè)或更多個(gè)單鏈核酸彼 此雜交時(shí)。在本發(fā)明的內(nèi)容中，對于與特定的序列"完全互補(bǔ)"的寡核苷酸，寡核苷酸的每 個(gè)堿基以反向平行方式與特定序列中的對應(yīng)堿基互補(bǔ)。通常未在天然核酸中發(fā)現(xiàn)的特定堿 基可以包括在本發(fā)明的核酸中，并且包括，例如，肌苷，7-去氮鳥嘌呤和上述的那些。在一些 實(shí)施方案中，互補(bǔ)性不是完全的(即，核酸可以是"部分互補(bǔ)"，而非"完全互補(bǔ)")。例如，穩(wěn) 定的雙鏈體可以含有錯(cuò)配的堿基對或未配對的堿基。"引物核酸"或"引物"是可以與目標(biāo)或模板核酸雜交并允許使用例如核苷酸結(jié)合 催化劑如聚合酶在合適的反應(yīng)條件下的鏈延伸或延長的核酸。這樣的條件通常包括在合適 的緩沖液中和在合適的溫度下存在一種或更多種脫氧核糖核苷三磷酸酯和核苷酸結(jié)合催 化劑("緩沖液"包括是輔因子，或影響PH、離子強(qiáng)度等的物質(zhì))。引物核酸通常是天然或合 成的寡核苷酸(例如，單鏈寡脫氧核苷酸等)。盡管任選利用其他引物核酸長度，它們通常 含有約6至約100個(gè)核苷酸長的雜交區(qū)。短的引物核酸通常需要較低的溫度，以與模板核酸 形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。與模板核酸的亞序列至少部分互補(bǔ)的引物核酸通常足以與模 板雜交，用以發(fā)生延伸。例如，為了給定目標(biāo)序列擴(kuò)增的合適引物的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域公知的， 并描述于在此所引用的文獻(xiàn)中。如果需要，可以通過引入標(biāo)記將引物核酸進(jìn)行標(biāo)記，該標(biāo)記 通過例如分光鏡、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、化學(xué)或其他技術(shù)是可檢測的。為了說明，有 用的標(biāo)記包括放射性同位素，熒光染料，電子密試劑，酶(如ELISA中常用的)，生物素或肝 素，以及可獲得抗血清或單克隆抗體的蛋白。這些和其他標(biāo)記中的許多在此得到了進(jìn)一步 描述和/或另外是本領(lǐng)域已知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，在特定的實(shí)施方案中，引物核
8酸也可以用作探針核酸。 如在此所用的，術(shù)語"探針"指的是由于探針中的至少一個(gè)序列與目標(biāo)核酸序列部 分或完全互補(bǔ)性，可以在合適的條件下與目標(biāo)核酸的片段(或源自這樣的目標(biāo)核酸的擴(kuò)增 子)形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(或其他核酸序列)。如在此所討論的，探針可以是標(biāo)記或 未標(biāo)記的。探針的3'端任選可以設(shè)計(jì)成阻止探針結(jié)合引物延伸產(chǎn)物中。這可以通過使用 非互補(bǔ)性堿基或通過將化學(xué)部分如生物素或磷酸酯基團(tuán)添加至最后一個(gè)核苷酸的3' _羥 基來實(shí)現(xiàn)，根據(jù)選定的部分，其可以提供雙重用途，其還可以作為標(biāo)記，用于連接標(biāo)記的核 酸隨后的檢測或捕獲。還可以通過除去3' -0H或通過使用缺乏3' -0H的核苷酸如二脫氧 核苷酸，或通過添加通過位阻阻斷延伸的體積大的基團(tuán)來實(shí)現(xiàn)阻止延伸。如在此進(jìn)一步所 述的，本發(fā)明的阻斷劑寡核苷酸可以，但不必需，作為探針。 術(shù)語"雜交片段"指的是與多核苷酸完全或基本上互補(bǔ)并因此與其雜交的核酸片 段，并且是至少5個(gè)連續(xù)的核苷酸長。盡管雜交片段通常指的是與完整的阻斷劑寡核苷酸 雜交的核酸片段，在一些情況中，阻斷劑寡核苷酸還包括其他的核苷酸序列，該其他的核苷 酸序列沒有雜交，但代替了功能，例如，作為連接物、標(biāo)記、片狀物等。在一些實(shí)施方案中，阻 斷劑寡核苷酸的雜交片段與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)。然而，如在此所述的，完整的互補(bǔ)性不是必 需的(例如，通常存在至少一個(gè)錯(cuò)配，導(dǎo)致阻斷劑寡核苷酸和目標(biāo)序列之間只有部分互補(bǔ) 性)。 如在此所限定的，"5'至3'核酸酶活性"指的是包括5'至3'-核酸外切酶活性 的模板特異性核酸聚合酶的活性(傳統(tǒng)上與一些DNA聚合酶相關(guān)，由此以按序的方式從寡 核苷酸的5'端除去核苷酸，例如，大腸桿菌DNA聚合酶I具有這種活性，而Klenow片段沒 有(以下段落中討論的其他聚合酶)。"顯著缺乏5' -3'核酸外切酶活性"的聚合酶指的是與T叫DNA聚合酶相比具 有50%或更低(例如，< 25%，< 20%，< 15%， < 10% )核酸外切酶活性的聚合酶。測 量5'-3'核酸外切酶活性的方法和測量條件是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，U.S.專利 No. 5， 466， 591。顯著缺乏5'至3'核酸酶活性的實(shí)例DNA聚合酶包括，例如，在該聚合酶典 型的引物延伸條件下，具有不可檢測的5'至3'核酸酶活性的任何DNA聚合酶。例如，缺乏 或具有突變的5' -3'核酸外切酶結(jié)構(gòu)域的聚合酶；大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段； 缺乏N-端235個(gè)氨基酸的水生棲熱菌DNA聚合酶(Taq)(例如，如U. S.專利No. 5， 616， 494 中所述的，或本領(lǐng)域中通常稱為"Stoffel片段")。其他實(shí)例包括具有足夠刪除(例如， N-端刪除)、突變或修飾使得消除或滅活負(fù)責(zé)5'至3'核酸酶活性的結(jié)構(gòu)域的耐熱DNA 聚合酶。參見，例如，U. S.專利No. 5， 795， 762。示例性DNA聚合酶包括來自嗜熱棲熱菌 (Thermus thermophilus) 、 Thermus caldophilus、 Thermus sp. Z05、水生棲熱菌(Thermus 叫imticus)、黃棲熱菌(Thermusflavus)、絲狀棲熱菌(Thermus filiformis) 、 Thermus sp. spsl7、耐放射異常球菌(Deinococcus radioduran)、溫泉家族B/克隆7、嗜熱脂肪芽孢 桿菌(Bacillus stearothermophilus)、熱堅(jiān)芽孢桿菌(Bacilluscaldotenax)、大腸桿菌 (Escherchia coli)、海棲熱孢菌(Thermotogamaritima)、那不勒其jf棲熱袍菌(Thermotoga ne即olitana)、非洲棲熱腔菌(Thermosipho africa皿s)的那些。對于各種耐熱DNA聚合 酶的完全核酸和氨基酸序列是可獲得的。水生棲熱菌(Taq)、嗜熱棲熱菌(Tth)、棲熱菌種 Z05、棲熱菌種spsl7、海棲熱袍菌(Tma)和非洲棲熱腔菌(Taf)聚合酶在PCT國際專利公開
9No. W092/06200中已經(jīng)公開。來自黃棲熱菌的DNA聚合酶的序列已經(jīng)公開于Akhmetzhanov 禾口 Vakhitov(NucleicAcids Research 20:5839,1992)。來自Thermus caldophilus的耐 熱DNA聚合酶的序列可以在EMBL/GenBank登錄號(hào)No.U62584中找到。來自絲狀棲熱菌 的耐熱DNA聚合酶的序列可以使用例如U. S.專利No. 4， 889， 818中提供的方法以及其中 提供的序列信息從ATCC保藏No. 42380回收。那不勒斯棲熱袍菌DNA聚合酶的序列來自 GeneSeq專利數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)No. R98144和PCT W097/09451。來自熱堅(jiān)芽孢桿菌的耐熱DNA 聚合酶的序列描述于例如Uemori等(J Biochem(Tokyo) 113 (3) :401-410， 1993 ;還可以參 見，Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫登錄號(hào)No. Q04957和GenBank登錄號(hào)D12982和BAA02361)。來自 嗜熱脂肪芽孢桿菌的DNA聚合酶的序列已經(jīng)公開于U. S.專利No. 6， 066， 483中?？梢孕?飾來除去或突變5' -3'核酸外切酶結(jié)構(gòu)域的DNA聚合酶的未修飾形式的實(shí)例包括，例如， U. S.專利No. 6， 228， 628 ;6， 346， 379 ;7， 030， 220 ;6， 881， 559 ;6， 794， 177 ;6， 468， 775和 U. S.專利申i青No. 20040005599 ;20020012970 ;20060078928和20040115639。如U. S.專 利No. 5， 795， 762中所解釋的，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)T叫DNA聚合酶氨基酸序列中殘基46的Gly的密 碼子的第二位置中G至A的定點(diǎn)突變(即，DNA序列中的G(137)突變成A)導(dǎo)致了5'至3' 核酸外切酶活性大約1000倍的降低，但聚合酶活性、加工性或延伸率沒有顯著變化。該Taq DNA聚合酶核苷酸序列的定點(diǎn)突變導(dǎo)致Gly(46)至Asp的氨基酸變化。T叫DNA聚合酶的甘 氨酸46在棲熱菌種spsl7 DNA聚合酶中是保守的，但位于殘基43，并且相同的Gly至Asp 的突變對Tsps17 DNA聚合酶的5'至3'核酸外切酶活性具有相似的作用。Tth(Gly46)、 TZ05(Gly46) 、 Tma(Gly37)和Taf (Gly37) DNA聚合酶的保守的Gly至Asp的突變對這些聚 合酶的5'至3'核酸外切酶活性具有相似的減弱作用。 如在此所用的，術(shù)語"Tm"指的是"解鏈溫度"。解鏈溫度是如下的溫度在該溫度 下同質(zhì)雙鏈或異質(zhì)雙鏈(即，完全或部分互補(bǔ)的雙鏈體)中的一半雙鏈多核苷酸或核堿基 寡聚物(例如，雜交復(fù)合物)分離成單鏈(在限定的離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下)。雙鏈多 核苷酸的Tm的預(yù)測考慮堿基序列以及其他因素，包括結(jié)構(gòu)序列特征和寡聚物連接的性質(zhì)。 預(yù)測和通過實(shí)驗(yàn)測定Tm的方法是本領(lǐng)域已知的。 例如，傳統(tǒng)上通過解鏈曲線來測定Tm，其中在受控溫度程序下加熱雙鏈體核酸分 子，并且監(jiān)控雙鏈體中兩條單鏈的結(jié)合/解離狀態(tài)和作出曲線，直至達(dá)到兩條鏈完全解離
的溫度。從該解離曲線測定Tm。或者，可以通過退火曲線來測定Tm，其中將雙鏈體核酸分子
加熱至兩條鏈完全解離的溫度。然后在受控的溫度方案中降低溫度，并且監(jiān)控雙鏈體中兩 條單鏈的結(jié)合/解離狀態(tài)和作出曲線，直至達(dá)到兩條鏈完全退火的溫度。然后從該退火曲
線測定Tm。 附圖簡述

圖1說明了相關(guān)序列的擴(kuò)增抑制同時(shí)允許目標(biāo)序列擴(kuò)增的實(shí)例。所示樣品含有一 個(gè)拷貝的目標(biāo)序列(底部)和兩個(gè)拷貝的相關(guān)序列(兩個(gè)頂端的水平線)。圖的左半部分 說明了阻斷劑寡核苷酸與序列的雜交。在該實(shí)施例中，在阻斷劑和目標(biāo)序列的片段中存在
錯(cuò)配，而頂端相關(guān)序列中不存在錯(cuò)配，因此導(dǎo)致與目標(biāo)序列的Tm相比，相關(guān)序列的Tm較高。
圖的右半部分說明了較高的相關(guān)序列的Tm怎樣導(dǎo)致相關(guān)序列通過聚合酶的削弱擴(kuò)增(在 該情況中，為阻斷)，而目標(biāo)序列的擴(kuò)增沒有受到削弱。盡管圖展示了兩個(gè)拷貝的目標(biāo)變體 和一個(gè)拷貝的目標(biāo)，將理解本發(fā)明在不同比例的目標(biāo)和變體的情況中也是有用的，這些比
10例包括，例如，i : 10、i : ioo、i : iooo、i : ioooo等。 圖2說明了在與野生型序列完全互補(bǔ)但與突變序列具有一個(gè)錯(cuò)配的不穩(wěn)定檢測 探針的存在下，來自因子5野生型和突變DNA的Z05 DNA聚合酶擴(kuò)增的解鏈數(shù)據(jù)，實(shí)施例中 詳細(xì)說明了。 圖3說明了在與野生型序列完全互補(bǔ)但與突變序列具有一個(gè)錯(cuò)配的穩(wěn)定檢測探 針(阻斷劑)的存在下，來自因子5野生型和突變DNA的Z05 DNA聚合酶擴(kuò)增的解鏈數(shù)據(jù)， 實(shí)施例中詳細(xì)說明了。 圖4說明了在與野生型序列完全互補(bǔ)但與突變序列具有一個(gè)錯(cuò)配的不穩(wěn)定檢測 探針的存在下，來自因子5野生型和突變DNA的A Z05 DNA聚合酶(缺乏5' -3'核酸外切 酶活性的聚合酶_參見，例如，U. S.專利No. 5， 466， 591)擴(kuò)增的解鏈數(shù)據(jù)，實(shí)施例中詳細(xì)說 明了。 圖5說明了在與野生型序列完全互補(bǔ)但與突變序列具有一個(gè)錯(cuò)配的穩(wěn)定檢測探 針(阻斷劑)的存在下，來自因子5野生型和突變DNA的A Z05 DNA聚合酶(缺乏5' -3' 核酸外切酶活性)擴(kuò)增的解鏈數(shù)據(jù)，實(shí)施例中詳細(xì)說明了 。 圖6說明了在與野生型序列完全互補(bǔ)但與突變序列具有一個(gè)錯(cuò)配的穩(wěn)定檢測探 針(阻斷劑)的存在或不存在下，來自因子5野生型和突變DNA的A Z05 DNA聚合酶(缺 乏5'-3'核酸外切酶活性)擴(kuò)增的解鏈數(shù)據(jù)，實(shí)施例中詳細(xì)說明了。在該圖中，阻斷劑存在 于開始時(shí)的PCR管中，或在PCR后加入。在PCR過程中不存在探針時(shí)，野生型(藍(lán)色)和突 變(紅色)目標(biāo)都產(chǎn)生了正常的擴(kuò)增-虛線。在PCR過程中存在探針時(shí)，突變目標(biāo)仍然得 到了擴(kuò)增并且充分解鏈，但野生型沒有。
詳述
I.引言 本發(fā)明是部分基于以下令人驚訝的發(fā)現(xiàn)在足夠高的解鏈溫度下與多核苷酸形成 雙鏈體的寡核苷酸可以削弱通過顯著缺乏5'-3'活性的聚合酶的復(fù)制和模板擴(kuò)增。已經(jīng)發(fā) 現(xiàn)了該現(xiàn)象可以應(yīng)用于檢測目標(biāo)變體序列(在此有時(shí)候也稱為"第二序列")的存在下的目 標(biāo)序列，通過設(shè)計(jì)寡核苷酸(稱為"阻斷劑寡核苷酸")，使得阻斷劑寡核苷酸在足夠高的解 鏈溫度下與變體形成雙鏈體以削弱變體的擴(kuò)增，而阻斷劑寡核苷酸和目標(biāo)形成雙鏈體的解 鏈溫度較低，因此阻斷劑寡核苷酸沒有顯著削弱目標(biāo)的擴(kuò)增。因此，在一些實(shí)施方案中，本 發(fā)明的方法可用于檢測高度相關(guān)序列混合物中的特定目標(biāo)序列。 在不是限制本發(fā)明范圍的簡單實(shí)施例中，設(shè)計(jì)了寡核苷酸，使得寡核苷酸與目標(biāo) 變體序列完全互補(bǔ)，并且因此形成雙鏈體，使用了削弱缺乏5'-3'核酸外切酶活性的聚合酶 顯著擴(kuò)增目標(biāo)變體的Tm。在該實(shí)施例中，目標(biāo)與變體具有單個(gè)核苷酸差異，因此寡核苷酸與 目標(biāo)也形成了雙鏈體，但具有至少一個(gè)錯(cuò)配的堿基對。該錯(cuò)配的堿基對導(dǎo)致和與變體序列 形成雙鏈體的相比，阻斷劑寡核苷酸與目標(biāo)形成雙鏈體的Tm降低，并且該Tm的降低足以使 聚合酶擴(kuò)增目標(biāo)序列而沒有顯著削弱聚合酶擴(kuò)增模板，阻斷劑寡核苷酸與該模板雜交。
因此，本發(fā)明提供了檢測目標(biāo)序列的方法，即使是在其他不同的但高度相關(guān)序列 的存在下，并且即使如果相關(guān)序列含量顯著高于目標(biāo)序列。因此，本發(fā)明的方法可以用于各 種應(yīng)用，包括，例如，表示癌癥或其他疾病突變的檢測。
II.本發(fā)明方法的綜述
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本發(fā)明利用了阻斷劑寡核苷酸對目標(biāo)序列和目標(biāo)變體序列的雜交親和性的差異， 其中與對目標(biāo)序列的Tm相比，阻斷劑寡核苷酸對一個(gè)或更多個(gè)目標(biāo)變體序列形成雙鏈體具 有較高的Tm( S卩，較高的親和性)。在一些實(shí)施方案中，例如，阻斷劑寡核苷酸和目標(biāo)序列之 間較低的Tm是雜交片段中至少一個(gè)錯(cuò)配的結(jié)果。例如，可以設(shè)計(jì)阻斷劑寡核苷酸來與目標(biāo) 變體序列完全互補(bǔ)，但與目標(biāo)序列只有部分互補(bǔ)。例如，錯(cuò)配可以是插入、刪除或核苷酸取 代的結(jié)果，由此導(dǎo)致目標(biāo)和目標(biāo)變體序列之間的差異。 在在此所述的方法、試劑盒或混合物的優(yōu)選實(shí)施方案中，在允許阻斷劑寡核苷酸 與目標(biāo)序列(如果存在)和目標(biāo)變體序列(如果存在)雜交的條件下，將含有具有目標(biāo)序列 的核酸和/或具有目標(biāo)變體的核酸的樣品接觸阻斷劑寡核苷酸。然后進(jìn)行引物延伸反應(yīng)， 其中引物與核酸片段的片段上游的核酸雜交，阻斷劑寡核苷酸在該位置雜交。如在此所用 的，"引物延伸反應(yīng)"指的是導(dǎo)致一個(gè)或更多個(gè)引物延伸的任何反應(yīng)，并且因此術(shù)語包括，例 如，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。測定核酸上引物雜交的位置，使得如果阻斷劑寡核苷酸與具有足夠親 和性的核酸雜交(即，阻斷劑寡核苷酸具有足夠高的Tm)，引物的延伸通過阻斷劑寡核苷酸 得到阻斷。使用顯著缺乏5'-3'核酸外切酶活性的聚合酶進(jìn)行引物核酸反應(yīng)。如在此所討 論的，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了如果阻斷劑寡核苷酸以足夠高的親和性雜交，顯著缺乏5'-3'核酸外 切酶活性的聚合酶不能置換阻斷劑寡核苷酸。因此，使用顯著缺乏5' -3'核酸酶活性的聚 合酶時(shí)，引物延伸反應(yīng)通常只在核酸含有目標(biāo)序列(即，阻斷劑寡核苷酸對其不具有足夠 親和性的序列)的情況中才能完成(即，獲得引物的全部延伸)。 圖1說明了上述的方法。圖1的左側(cè)表示管中的樣品，其中存在兩個(gè)拷貝的含有 目標(biāo)變體的核酸和一個(gè)拷貝的含有目標(biāo)序列的核酸。將阻斷劑寡核苷酸接觸核酸并與目標(biāo) 或目標(biāo)變體序列雜交。因?yàn)槟繕?biāo)序列含有至少一個(gè)不同于目標(biāo)變體的核苷酸，阻斷劑寡核 苷酸沒有與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)(圖1中用"X"表示)。因此，盡管阻斷劑寡核苷酸與目標(biāo)序 列雜交，但其以阻斷劑寡核苷酸和目標(biāo)變體的Tm低的Tm來進(jìn)行這。 圖1的右側(cè)說明所得到的引物延伸反應(yīng)。通過小箭頭來表示引物，引物朝每個(gè)核 酸的左邊雜交。通過顯著缺乏5' -3'核酸外切酶活性的聚合酶在含有目標(biāo)變體的核酸上 延伸引物時(shí)，阻斷劑寡核苷酸的雜交削弱了 (即，抑制至少一些，并且通常是大部分，或幾 乎全部)跨過目標(biāo)變體序列的延伸，并且因此導(dǎo)致不完全的延伸。相反，因?yàn)樽钄鄤┕押塑?酸以較低的親和性(即，較低的Tm)與目標(biāo)序列雜交，聚合酶能夠延伸跨過目標(biāo)序列的引物 (通過置換阻斷劑寡核苷酸來推測)。 目標(biāo)和目標(biāo)變體序列在雜交片段(即，阻斷劑寡核苷酸與序列雜交的片段)中有 至少一個(gè)核苷酸不同(例如，插入、刪除或改變的核苷酸)。通常，目標(biāo)和目標(biāo)變體足夠相 似，使得阻斷劑寡核苷酸可以在相同的條件下與目標(biāo)和目標(biāo)變體雜交，例如，引物延伸反應(yīng) 的條件，包括但不限于，擴(kuò)增反應(yīng)如PCR或其他擴(kuò)增反應(yīng)。因此，在一些實(shí)施方案中，目標(biāo) 和目標(biāo)變體在雜交片段有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多個(gè)核苷酸不同，例如，1-5、1-4、1-3、 l-2、2-3、2-4、2-5、l-20、2-20個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)序列與目標(biāo)變體序列的 同一性低于100%，但高于，例如，80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一性。在各種 實(shí)施方案中，目標(biāo)和目標(biāo)變體序列之間的差異發(fā)生于序列的內(nèi)部，而不是末端5'或3'核苷 酸。
目標(biāo)序列可以是任何長度的。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)核苷酸是至少5個(gè)核苷酸
12長，例如，至少10、 15或更多個(gè)核苷酸，例如，5-200、5-100、 10-200、 10-100、 10-50、20-80個(gè)
核苷酸等。 盡管本公開內(nèi)容按照如果存在一個(gè)目標(biāo)和一個(gè)目標(biāo)變體概括地討論了本發(fā)明，將 可以理解在一些實(shí)施方案中，在樣品內(nèi)存在多個(gè)不同目標(biāo)序列和/或目標(biāo)變體。在一些實(shí) 施方案中，在含有目標(biāo)序列的樣品中存在或可能存在超過一個(gè)的不同目標(biāo)變體序列。因此， 例如，樣品可以含有目標(biāo)序列，含有一個(gè)核苷酸不同于目標(biāo)序列的一個(gè)目標(biāo)變體和含有不 同于目標(biāo)序列的核苷酸的第二目標(biāo)變體。 在在此所述的方法、試劑盒或混合物的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以進(jìn)行"多元"反應(yīng)，其 中檢測了至少兩個(gè)不同的目標(biāo)序列。這些實(shí)施方案通常，但不是總是，包括使用兩個(gè)或更多 個(gè)(例如，2、3、4、5等，取決于待檢測的目標(biāo)數(shù)量)不同的阻斷劑寡核苷酸，其中每個(gè)阻斷劑 寡核苷酸削弱了不同目標(biāo)序列變體的延伸， 其中引物雜交和阻斷劑寡核苷酸雜交的核酸片段之間的距離可以不同，只要距離 不是遠(yuǎn)得在到達(dá)阻斷劑寡核苷酸雜交的片段之前完成了延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，其 中引物3'大部分片段雜交和阻斷劑核苷酸5'大部分片段的核苷酸之間的距離約5-1000 個(gè)核苷酸，例如，10-100個(gè)核苷酸，但可以小如零(鄰接)。 在與含有目標(biāo)變體的核酸雜交的那些和含有目標(biāo)序列的那些之間，用于引物延伸 的引物可以相同，但引物也可以是不同的。例如，在期望檢測生物體中罕見體細(xì)胞突變的情 況中，生物體的基因組通常是相同的，除了突變位點(diǎn)的變化。因此，目標(biāo)序列將包括突變位 點(diǎn)，并且可以使用相同的引物，因?yàn)橥蛔兾稽c(diǎn)的上游片段(不管突變位點(diǎn)是否突變了)將具 有相同的序列。然而，盡管可能更罕見，存在如下的情況可以預(yù)想其中用于目標(biāo)和目標(biāo)變 體核酸的延伸反應(yīng)的引物是不同的，并因此沒有從本發(fā)明中排除這些實(shí)施方案。
可以通過各種方法檢測延伸產(chǎn)物，并且可以將失敗的目標(biāo)變體延伸產(chǎn)物與目標(biāo)延 伸產(chǎn)物區(qū)分開來。在一些實(shí)施方案中，使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和其他類型的核酸擴(kuò)增。 對于PCR反應(yīng)，通常使用兩個(gè)引物。如本發(fā)明的方法中所用的，一個(gè)PCR引物是參考以上"引 物延伸"反應(yīng)所討論的引物，而將第二引物(例如，反向引物)設(shè)計(jì)來與阻斷劑寡核苷酸下 游的核酸序列的補(bǔ)體雜交。如本發(fā)明方法中所用的，PCR是有用的，因?yàn)橹粚τ谄渲芯酆厦?能夠置換阻斷劑寡核苷酸(即，涉及目標(biāo)序列的那些)的那些反應(yīng)才產(chǎn)生指數(shù)擴(kuò)增。各種 顯著缺乏5'-3'核酸外切酶活性的耐熱聚合酶是已知的和在此所述的。本發(fā)明的方法發(fā)現(xiàn) 了在不對稱PCR反應(yīng)中的特別用途，不對稱PCR反應(yīng)即其中一個(gè)引物與反應(yīng)中的另一個(gè)引 物相比是處于限制濃度的。通常，產(chǎn)生阻斷劑寡核苷酸與其雜交的鏈的引物(以上實(shí)施例 中的反向引物)是限制濃度的引物。 與進(jìn)行的引物延伸反應(yīng)的類型無關(guān)，可以使用各種不同類型的方法來檢測延伸產(chǎn) 物。在一些實(shí)施方案中，將探針(例如，可檢測標(biāo)記的探針)設(shè)計(jì)來與延伸產(chǎn)物雜交，該延伸 產(chǎn)物對應(yīng)于目標(biāo)序列和核酸上目標(biāo)序列下游的序列，和這些序列的補(bǔ)體。這樣的探針將只 可以，或主要，檢測延伸產(chǎn)物，該延伸產(chǎn)物涉及含有目標(biāo)序列的核酸，因?yàn)閬碜院心繕?biāo)變 體的核酸的延伸產(chǎn)物將受到削弱，并因此通常不包括目標(biāo)序列、目標(biāo)變體序列或下游序列。
例如，在一些實(shí)施方案中，使用可檢測標(biāo)記的"實(shí)時(shí)"探針并作為阻斷劑寡核苷酸。
這樣的探針可以包括，但不限于，Taqman⑧探針和分子信標(biāo)。在一些實(shí)施方案中，可檢測 "實(shí)時(shí)"標(biāo)記(也用作阻斷劑寡核苷酸)和實(shí)時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)如實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)中所用的一樣。循
13環(huán)極限(Ct)值常常用來監(jiān)控實(shí)時(shí)擴(kuò)增中的目標(biāo)含量。在一些實(shí)施方案中，在目標(biāo)和目標(biāo)變 體之間存在至少5、10、15或更多Ct的差異，這是在等量目標(biāo)和目標(biāo)變體序列的存在下在實(shí) 時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)中檢測的。 在一些實(shí)施方案中，基于質(zhì)量的檢測方法可以用來檢測延伸產(chǎn)物。因?yàn)閬碜院?目標(biāo)序列的核酸的延伸產(chǎn)物通常將顯著長于從含有目標(biāo)變體序列的核酸產(chǎn)生的那些，可以 使用檢測核酸長度或質(zhì)量差異的任何方法。例如，可以使用各種質(zhì)譜方法來檢測、區(qū)分和定 量延伸產(chǎn)物。 優(yōu)選，使用解鏈溫度分析來檢測延伸產(chǎn)物。例如，在一些實(shí)施方案中，將阻斷劑寡 核苷酸標(biāo)記并進(jìn)行解鏈曲線分析來定量標(biāo)記的寡核苷酸與其雜交的模板的含量。
III.阻斷具有削弱的5' -3'核酸外切酶活性的聚合酶延伸的寡核苷酸
將本發(fā)明的阻斷劑寡核苷酸設(shè)計(jì)來以高于阻斷劑與目標(biāo)序列自身雜交的解鏈溫 度(TJ與目標(biāo)序列變體雜交。阻斷劑寡核苷酸不需要與目標(biāo)變體完全互補(bǔ)，只要阻斷劑寡 核苷酸以足夠高的Tm與目標(biāo)變體雜交，以在指定的條件下削弱聚合酶復(fù)制阻斷劑寡核苷 酸與其雜交的模板的片段。在一些實(shí)施方案中，阻斷劑寡核苷酸與目標(biāo)變體完全互補(bǔ)，但與 目標(biāo)序列雜交時(shí)，形成至少一個(gè)錯(cuò)配(例如，l、2、3、4、5、6、7、l-3、l-4、2-6個(gè)錯(cuò)配等)，由此 導(dǎo)致目標(biāo)的Tm低于目標(biāo)變體。在一些實(shí)施方案中，阻斷劑寡核苷酸沒有與目標(biāo)或目標(biāo)變體 序列完全互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，阻斷劑寡核苷酸與目標(biāo)變體形成至少一個(gè)或更多個(gè)錯(cuò) 配，然而，以足夠高的Tm雜交以削弱在阻斷劑寡核苷酸存在下聚合酶復(fù)制變體序列，而沒 有顯著削弱目標(biāo)序列的復(fù)制。在一些實(shí)施方案中，阻斷劑寡核苷酸與目標(biāo)序列比與目標(biāo)變 體具有更大量的錯(cuò)配或與目標(biāo)變體相比與目標(biāo)序列具有不同的錯(cuò)配，使得在阻斷劑寡核苷 酸的存在下，目標(biāo)變體序列的復(fù)制受到削弱，而在阻斷劑寡核苷酸的存在下，目標(biāo)序列的復(fù) 制沒有受到顯著削弱。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)和變體序列之間的錯(cuò)配沒有發(fā)生在序列的 5'或3'端。在一些實(shí)施方案中，將阻斷劑寡核苷酸進(jìn)行設(shè)計(jì)，使得在通過阻斷劑寡核苷酸 和目標(biāo)變體的雙鏈體形成的雜交片段中間(不在末端)形成一個(gè)或更多個(gè)錯(cuò)配。在一些實(shí) 施方案中，將阻斷劑寡核苷酸進(jìn)行設(shè)計(jì)，使得在通過阻斷劑寡核苷酸和目標(biāo)變體的雙鏈體 形成的雜交片段的一端或兩端形成一個(gè)或更多個(gè)錯(cuò)配。 如在此所討論的，阻斷劑寡核苷酸與特定目標(biāo)變體的Tm顯著高于阻斷劑寡核苷 酸對于目標(biāo)序列的Tm，使得目標(biāo)變體的復(fù)制受到削弱，而相同條件下的目標(biāo)復(fù)制沒有受到 顯著削弱，由此允許可以在目標(biāo)變體的存在下檢測目標(biāo)序列。優(yōu)選，阻斷寡核苷酸對于目標(biāo) 變體的Tm與對于目標(biāo)序列的相比的差異為至少約5°C 、 l(TC 、 15°C 、2(TC或更多。將認(rèn)識(shí)到 可以以不同的方式來測量Tm?？梢允褂闷渌旌衔锏娜魏螖U(kuò)增緩沖液來測定Tm，該緩沖液 就是或模仿了測試使用聚合酶復(fù)制的條件。這樣條件的一個(gè)實(shí)例是，例如，2. 5%甘油、50慮 pH8. 3 Tricine、45mM醋酸鉀，和合適的核苷酸，用于引物延伸。 本發(fā)明的阻斷劑寡核苷酸可以是任何長度。優(yōu)選，阻斷劑寡核苷酸為5-200個(gè)核 苷酸，例如，5-100、 10-100、5-40、5-25、 10-50、 15-50個(gè)核苷酸長。 本發(fā)明的阻斷劑寡核苷酸可以包括，并且有時(shí)候只包括，天然單聲道核苷酸(即， A、C、T、G和U)?；蛘?，在一些實(shí)施方案中，阻斷劑寡核苷酸包括至少一個(gè)(例如，1、2、3、4、5、 6等)人工(即，不是在天然產(chǎn)生RNA或DNA中產(chǎn)生的那些)核苷酸。引起提高的Tm的示例性 人工堿基在本領(lǐng)域中有描述，包括但不限于，Lebedev等，GeneteicAnalysis-Biomolecular
14Engineering(遺傳分析-生物分子工程化)，13 :15-21(1996) ;Xodo等，Nucleic Acids Res. 19 :5625-5631 (1991) ;Froehler等，Tetrahedron Lett. 33 :5307-5310 (1992); Kutyavin等，Biochemistry 35 :11170-11176(1996) ;Nguyen等，Nucleic Acids Res. 25 : 30599-65 (1997)。例如，2-氨基A將Tm提高超過A約3°C ， 5-甲基_C將Tm升高超過C約 1. 3°C ， C-5丙炔基-C將Tm提高超過C約2. 8t:和C_5丙炔基_U將Tm提高超過T約1. 7°C 。 優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明，阻斷劑核苷酸不含有任何嵌入核苷酸。此外，本發(fā)明的阻斷劑寡核苷酸 不含有內(nèi)部嵌入擬核苷酸，如W02006/026828中所述的那些。 在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的阻斷劑寡核苷酸含有至少一個(gè)提高阻斷劑 寡核苷酸解鏈溫度的非核苷酸部分(任選，不同于嵌入核苷酸)。這樣的非核苷酸部分的實(shí) 例包括，例如，較小基團(tuán)粘合劑，參見，例如，US專利No. 6， 486， 308。 根據(jù)本發(fā)明，將阻斷劑寡核苷酸可檢測地標(biāo)記并因此進(jìn)一步用于檢測混合物的目 標(biāo)序列。例如，將可檢測標(biāo)記的阻斷劑寡核苷酸用于檢測和定量擴(kuò)增反應(yīng)中的目標(biāo)序列，擴(kuò) 增反應(yīng)包括但不限于實(shí)時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)。各種可檢測標(biāo)記是已知的。示例性標(biāo)記包括熒光標(biāo) 記(包括，例如淬滅劑或吸附劑)、非熒光標(biāo)記、比色標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、放 射性標(biāo)記、改變質(zhì)量的基團(tuán)、抗體、抗原、生物素、半抗原、酶(包括，例如，過氧化物酶、磷酸
酶)等。標(biāo)記可以提供通過熒光、放射性、比色、重量測定、x-射線衍射或吸收、磁力、酶活
性等可檢測的信號(hào)。標(biāo)記可以用于提供可檢測(并且任選可定量)的信號(hào)，并且將其連接 核酸或蛋白質(zhì)。 在本發(fā)明特定的優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)記是熒光染料或熒光團(tuán)。通常，特定的熒光團(tuán) 在吸收較短波長的光后可以發(fā)出特定波長的光。由特定的熒光團(tuán)發(fā)出的光的波長是該熒 光團(tuán)特征性的。因此，可以通過用較短波長的光激發(fā)熒光團(tuán)后檢測合適波長的光來檢測特 定的熒光團(tuán)。熒光標(biāo)記可以包括負(fù)電荷的染料，如熒光素家族的染料，或中性電荷的染料， 如羧基若丹明家族的染料，或正電荷的染料，如花菁家族或若丹明家族的染料?？梢杂糜?本發(fā)明中的染料的其他家族包括，例如，多鹵代熒光素家族染料、六氯熒光素家族染料、香 豆素家族染料、噁嗪家族染料、噻嗪家族染料、方酸菁家族染料、螯合的鑭系元素家族染料、 ALEXAFLUOR⑧染料和BODIPY⑧家族染料。熒光素家族的染料包括，例如，F(xiàn)AM、 HEX、 TET、 J0E、NAN和Z0E。羧基若丹明家族的染料包括Texas紅、R0X、R110、R6G和TAMRA。 FAM、 HEX、 TET、 J0E、 NAN、 Z0E、 R0X、 RllO、 R6G和TAMRA由Perkin-Elmer (Foster City， Calif.) 銷售，而Texas紅由Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oreg.)銷售?；ㄝ技易宓娜玖习?Cy2、 Cy3、 Cy3. 5、 Cy5、 Cy5. 5和Cy7由AmershamGE Healthcare (Piscataway， N. J.)銷售。
IV.具有削弱的5' -3'核酸外切酶活性的聚合酶 各種顯著缺乏5' -3'核酸外切酶活性的聚合酶是本領(lǐng)域已知的。聚合酶的N-端 片段通常給予5' -3'核酸外切酶活性。因此，聚合酶N-端的所有或部分突變或刪除可以 用來產(chǎn)生顯著缺乏5' -3'核酸外切酶活性的聚合酶。顯著缺乏5' -3'核酸外切酶活性的 示例性聚合酶包括大腸桿菌聚合酶I的Klenow片段；缺乏N_端235個(gè)氨基酸的水生棲熱 菌Taq(例如，如U. S.專利No. 5， 616， 494中所述的)；和/或具有足夠刪除(例如，N-端刪 除)、突變或修飾以消除或滅活負(fù)責(zé)5'至3'核酸外切酶活性的結(jié)構(gòu)域的耐熱DNA聚合酶。 參見，例如，U.S.專利No. 5， 795， 762。這樣的聚合酶通常是分離的或純化的聚合酶，并可以 是重組蛋白。
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在擴(kuò)增反應(yīng)，包括在熱循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)中起作用的聚合酶在本發(fā)明中特別有用。用
于本發(fā)明方法的聚合酶缺乏顯著的5' -3'核酸外切酶活性，使得聚合酶不能夠以模板依賴
性方式通過阻斷劑寡核苷酸雜交的目標(biāo)變體模板片段來延伸引物，但能夠通過阻斷劑寡核
苷酸雜交的目標(biāo)模板片段來延伸引物，其中阻斷劑寡核苷酸對目標(biāo)變體模板的Tm高于對
目標(biāo)模板的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到聚合酶中5' -3'核酸外切酶活性的精確水平
(如果有的話)可以根據(jù)阻斷劑寡核苷酸對于目標(biāo)和目標(biāo)變體的Tm而不同。 根據(jù)本發(fā)明的方法，通過阻斷劑寡核苷酸足以削弱顯著缺乏5' -3'核酸外切酶
活性的聚合酶對目標(biāo)變體序列的復(fù)制，這有利于目標(biāo)的相應(yīng)擴(kuò)增。不是用來限制本發(fā)明的
范圍，認(rèn)為在目標(biāo)序列和密切相關(guān)的目標(biāo)變體之間可以存在競爭反應(yīng)。在與目標(biāo)相比存在
顯著更多拷貝目標(biāo)變體的情況中，在阻斷劑不存在下的擴(kuò)增導(dǎo)致使目標(biāo)序列具有降低的可
檢測性或不可檢測的擴(kuò)增。期望在目標(biāo)變體存在下檢測目標(biāo)時(shí)，通過阻斷劑寡核苷酸的雜
交來削弱變體的擴(kuò)增，而目標(biāo)的擴(kuò)增沒有削弱或削弱程度較低，以允許可以在目標(biāo)變體的
存在下檢測目標(biāo)。與缺乏阻斷劑寡核苷酸的對照反應(yīng)相比，阻斷劑的存在將變體擴(kuò)增子的
含量降低至少20%時(shí)，認(rèn)為目標(biāo)變體的擴(kuò)增顯著受損，更常見降低至少50%、75%、90%、
95%或更多。 根據(jù)本發(fā)明，還使用具有顯著5' -3'核酸外切酶活性的聚合酶替代顯著缺乏 5'-3'核酸外切酶活性的聚合酶進(jìn)行了對照反應(yīng)。這樣的對照反應(yīng)可以用于測定目標(biāo)變體 的存在或不存在，因?yàn)樵谶@樣的對照反應(yīng)中，目標(biāo)變體得到了擴(kuò)增。這樣的對照反應(yīng)還可以 用于證實(shí)擴(kuò)增試劑是功能性的。將認(rèn)識(shí)到也可以使用其他不同的對照。
V.該方法的用途 本發(fā)明可用于檢測目標(biāo)序列和含有目標(biāo)序列的核酸。本發(fā)明特別可用于檢測目標(biāo) 變體存在下的目標(biāo)序列，尤其是其中與待檢測的目標(biāo)序列相比，目標(biāo)變體為過量濃度的情 況。沒有用來限制本發(fā)明的范圍，這樣的情況的一些實(shí)例是體細(xì)胞突變或癌癥相關(guān)突變的 檢測。例如，本發(fā)明可用于檢測生物活體檢查中的癌癥或其他體細(xì)胞突變，其中大部分細(xì)胞 很可能具有"正常"形式的基因序列(即，目標(biāo)變體)，但至少一些細(xì)胞具有突變(即，目標(biāo) 序列)。 本發(fā)明可以用于分析和檢測任何樣品中的核酸，包括如在此所述的生物樣品。本 發(fā)明方法中所用的樣品可以含有目標(biāo)和目標(biāo)變體序列兩者，只有目標(biāo)或目標(biāo)變體序列或兩 者都無。在一些實(shí)施方案中，目標(biāo)或目標(biāo)變體的存在是已知的，而在其他實(shí)施方案中，不知 道是否存在目標(biāo)或目標(biāo)變體。
VI.反應(yīng)混合物 本發(fā)明還提供了本發(fā)明方法中涉及的反應(yīng)混合物。可以產(chǎn)生如上所述的任何反 應(yīng)混合物。示例性反應(yīng)混合物包括，例如，顯著缺乏5' -3'核酸外切酶活性的聚合酶；含有 目標(biāo)序列的多核苷酸；含有第二序列的多核苷酸，其中第二序列與目標(biāo)序列至少有一個(gè)核 苷酸不同；和阻斷劑寡核苷酸，其中阻斷劑寡核苷酸與第二序列的雜交足以削弱第二序列 通過聚合酶的擴(kuò)增，但寡核苷酸與目標(biāo)序列的雜交沒有顯著削弱目標(biāo)序列的擴(kuò)增。反應(yīng)混 合物可以進(jìn)一步包含濃度為用于引物延伸和/或擴(kuò)增反應(yīng)的核苷酸(例如，dNTP，如dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP和/或dUTP，或其任意組合)。此外，反應(yīng)混合物含有一個(gè)或更多個(gè)與目 標(biāo)和/或第二序列雜交的引物，例如，至少一個(gè)與阻斷劑寡核苷酸雜交片段的上游雜交的
16引物和/或含有5'正義引物和相應(yīng)3'反義引物的引物對。在其他、互斥變化中，反應(yīng)混合物包括一個(gè)或更多個(gè)提供游離核苷酸(常規(guī)和/或非常規(guī))的核苷酸。例如，反應(yīng)混合物可以包括a _硫代磷酸酯dNTP、 dUTP、 dITP和/或標(biāo)記的dNTP，如，例如，熒光素-或花菁_染料家族dNTP。在此所述的特定阻斷劑寡核苷酸、聚合酶、引物和其他試劑也可以包括在以上部分中詳述的反應(yīng)混合物中。根據(jù)本發(fā)明的反應(yīng)混合物也可以包括在提供5'正義引物的容器中或與提供5'正義引物的容器一起使用，該引物在引物延伸條件下可與目標(biāo)和
/或第二序列雜交。
VII.試劑盒 本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明方法中的試劑盒。通常，為了易于使用，將試劑盒分隔，并含有至少一個(gè)提供顯著缺乏5' -3'核酸外切酶活性的聚合酶的容器。還可以包括一個(gè)或更多個(gè)提供其他試劑的其他容器。這樣其他的容器可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何試劑或其他元件，用于根據(jù)上述方法的引物延伸程序中，包括用于例如核酸擴(kuò)增程序(例如，PCR、 RT-PCR) 、 DNA測序程序或DNA標(biāo)記程序中的試劑。例如，試劑盒可以包括含有目標(biāo)序列的多核苷酸；含有第二序列的多核苷酸，其中第二序列與目標(biāo)序列至少有一個(gè)核苷酸不同；和阻斷劑寡核苷酸，如在此所述的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包括提供在引物延伸條件下可與目標(biāo)和/或第二序列雜交的5'正義引物和/或含有5'正義引物和相應(yīng)3'反義引物的引物對的容器。在其他、非互斥變化中，試劑盒包括一個(gè)或更多個(gè)提供游離核苷酸(常規(guī)和/或非常規(guī)的)的容器。在特定的實(shí)施方案中，試劑盒包括a-硫代磷酸酯dNTP、dUTP、dlTP和/或標(biāo)記的dNTP，如，例如，熒光素-或花菁-染料家族dNTP。在更多其他、非互斥變化實(shí)施方案中，試劑盒包括一個(gè)或更多個(gè)提供適用于引物延伸反應(yīng)的緩沖液的容器。
實(shí)施例 提供以下實(shí)施例來說明但非限制所要求的發(fā)明。
實(shí)施例1 : 該實(shí)施例說明了使用阻斷劑寡核苷酸來抑制因子5野生型等位基因的擴(kuò)增，使用解鏈曲線分析來檢測突變等位基因。 在該實(shí)施例中，不對稱PCR樣品主體混合物由以下組成2. 5%甘油、50慮TricinepH8. 3、45mM醋酸鉀；200uM dATP，200uM dGTP，200uM dCTP，400uM dUTP ;0. 7uM上游(過量)引物；0. liiM下游(有限)引物；0. 4iiM檢測探針；4U尿嘧啶-N-糖基化酶；40U AZ05 DNA聚合酶或Z05 DNA聚合酶；和4mM醋酸鎂。 將主體混合物用于擴(kuò)增因子5野生型和突變質(zhì)粒DNA目標(biāo)。過量引物以7x有限引物濃度存在，以確保單鏈擴(kuò)增子對于與其結(jié)合的檢測探針的過量。在Roche LightcyclerLC480上進(jìn)行擴(kuò)增和解鏈。 用于該實(shí)施例的熱循環(huán)特征為5(TC 5分鐘(UNG步驟)；94°C 15秒-59。C 40秒x2個(gè)循環(huán)；91°C 15秒-59°C 40秒x48循環(huán)，94t: 30秒，在59。C退火步驟過程中收集數(shù)據(jù)；在4(TC至95t:之間的解鏈步驟中收集恒定數(shù)據(jù)。 上游引物的序列是TGAACCCACAGAAAATGATGCCCBz (SEQ IDNO :1);下游引物的序列是GGAAATGCCCCATTATTTAGCCAGGBz (SEQ ID NO :2) ;Bz = t- 丁基dA。穩(wěn)定的檢測
17探針(阻斷劑)的序列為EFFLLFLGLLFGFLLAGGGQ (SEQ ID NO :3)，其中E = cx-FAM、Q二朋Q2、F二丙炔基dU和L二丙炔基dC。不穩(wěn)定檢測探針的序列(非阻斷劑)是ECTGTATTCCTCGCCTGTCCAGQP (SEQ ID NO :4)，其中E = cx-FAM、 Q = BHQ2、 F =丙炔基dU、 L二丙炔基dC和P = 3'磷酸酯。這些寡核苷酸優(yōu)選與野生型目標(biāo)配對，并且與突變目標(biāo)具有一個(gè)錯(cuò)配(CA錯(cuò)配)，用粗體和下劃線標(biāo)出了 。 來自該實(shí)施例的解鏈數(shù)據(jù)表明使用Z05 DNA聚合酶，兩個(gè)探針獲得和預(yù)期一樣的解鏈曲線，而野生型獲得最高的Tm，突變目標(biāo)獲得最低的Tm和雜合子獲得野生型合突變等位基因兩者的Tm(圖2&圖3)。因?yàn)閆05分裂了探針，觀察到?jīng)]有擴(kuò)增抑制。可以看到穩(wěn)定探針對2個(gè)等位基因的Tm高于不穩(wěn)定探針大約12°C。此外，還觀察到不確定的較高Tm峰，如主要解鏈峰右側(cè)的肩部。 使用AZ05，不穩(wěn)定的探針也獲得了相同的解鏈曲線，但是信號(hào)更多，因?yàn)樵赑CR過程中探針沒有降解(圖4)。 然而，將AZ05與穩(wěn)定探針一起使用時(shí)(圖5)，雜合子樣品中的野生型等位基因沒有形成野生型等位基因的解鏈曲線；得到了與突變目標(biāo)相同的解鏈曲線，表明野生型等位基因的擴(kuò)增受到抑制。使用Z05，純野生型目標(biāo)獲得比野生型目標(biāo)低得多和寬得多的解鏈曲線(圖3)。
實(shí)施例2: 使用穩(wěn)定探針和非分裂酶對擴(kuò)增的影響的更多證據(jù)顯示于圖6中。使用實(shí)施例1中所述的相同擴(kuò)增條件，使用A Z05，穩(wěn)定的探針存在于開始時(shí)的PCR管中，或在PCR-后加入。然后進(jìn)行解鏈，產(chǎn)生了野生型(藍(lán)色)和突變(紅色)目標(biāo)的正常擴(kuò)增-虛線。在PCR過程中存在探針時(shí)，突變目標(biāo)仍然充分?jǐn)U增和解鏈，但野生型沒有。
實(shí)施例3: 在實(shí)時(shí)PCR中也觀察到了抑制。使用實(shí)施例1中所述的相同PCR條件，來自相同實(shí)驗(yàn)的生長曲線數(shù)據(jù)顯示了與使用Z05的無延遲相比，使用AZ05野生型和突變目標(biāo)之間約12個(gè)循環(huán)的極限循環(huán)(Ct)延遲，以測試阻斷劑寡核苷酸作用是否是由于穩(wěn)定堿基的存在(丙炔基dU &丙炔基(10，制得并測試了長的不穩(wěn)定探針(52-mer)，其與短的穩(wěn)定探針具有相同的Tm。該探針的序列為
6)，其中E = cx-FAM、 Q = BHQ2禾P P = 3'磷酸酯。 與使用Z05的無延遲相比，觀察到使用AZ05，野生型和突變目標(biāo)之間的ll個(gè)循環(huán)延遲。該結(jié)果表明在確定探針是否可以作為阻斷劑中，Tm是最關(guān)鍵的因素。
實(shí)施例4: 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來模擬罕見突變檢測測試。使用實(shí)施例1中所述的反應(yīng)條件，將不同比例的野生型和突變質(zhì)粒DNA目標(biāo)混合在一起，以觀察在野生目標(biāo)的背景中可以檢測哪個(gè)水平的突變目標(biāo)。制備了IOO : 1(對應(yīng)于10，000野生型拷貝+100突變拷貝)，
500 : 1(50，000野生型拷貝+100突變拷貝)，iooo : i(ioo，ooo野生型拷貝+100突變拷貝)，5000 : 1(500，000野生型拷貝+ioo突變拷貝)和io，ooo : i(i，ooo，ooo野生型拷貝+ioo突變拷貝)的比例。對于高達(dá)iooo : i比例的突變目標(biāo)，觀察到清楚的可說明的解鏈曲線。而在此之上，來自野生型的解鏈曲線開始干擾突變體解鏈曲線，表明野生型目標(biāo)的擴(kuò)增的有效阻斷不再發(fā)生。 理解在此所述的實(shí)施例和實(shí)施方案只是用于說明性的目的，并且根據(jù)其的各種改變或變化是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的并且包括在本申請的精神和范圍中以及所附權(quán)利要求的范圍中。
權(quán)利要求
檢測目標(biāo)序列的方法，其中所述目標(biāo)序列在生物樣品的多核苷酸中，其中樣品可以另外或可替換地含有第二多核苷酸，所述第二多核苷酸含有第二序列，其中所述第二序列與所述目標(biāo)序列至少有一個(gè)核苷酸不同，所述方法包括i.在允許阻斷劑寡核苷酸在存在第二序列或目標(biāo)序列時(shí)與所述第二序列雜交或目標(biāo)序列雜交的條件下，將樣品與阻斷劑寡核苷酸接觸，ii.在雜交的阻斷劑寡核苷酸的存在下，將樣品與至少一種引物和顯著缺乏5’-3’核酸外切酶活性的聚合酶接觸，以便發(fā)生引物的模板依賴性延伸，其中，引物與阻斷劑寡核苷酸雜交序列上游的多核苷酸雜交，如果存在該多核苷酸；其中阻斷劑寡核苷酸與第二序列的雜交足以削弱第二序列通過聚合酶的擴(kuò)增，其中阻斷劑寡核苷酸不包含嵌入核苷酸，并且進(jìn)一步其中寡核苷酸與目標(biāo)序列的雜交沒有顯著削弱目標(biāo)序列通過顯著缺乏5’-3’核酸酶活性的聚合酶的擴(kuò)增。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述阻斷劑寡核苷酸是可檢測標(biāo)記的。
3. 權(quán)利要求l的方法，其中在所述第二序列和目標(biāo)序列之間存在單個(gè)核苷酸差異，并且除了在所述單個(gè)核苷酸的位置外，所述阻斷劑寡核苷酸與所述目標(biāo)序列完全互補(bǔ)。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中在所述第二序列和目標(biāo)序列之間存在2-6個(gè)核苷酸差異，并且除了在這2-6個(gè)核苷酸的位置，所述阻斷劑寡核苷酸與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中-所述阻斷劑寡核苷酸和第二序列的解鏈溫度；禾口_所述阻斷劑寡核苷酸和目標(biāo)序列的解鏈溫度之間的差異為至少5。C，根據(jù)在2. 5%甘油、50慮Tricine pH8. 3、45mM醋酸鉀中測量的。
6. 權(quán)利要求l的方法，其中所述阻斷劑寡核苷酸含有至少一個(gè)非天然核苷酸，其中與對照寡核苷酸相比，非天然、非嵌入核苷酸提高了所述阻斷劑寡核苷酸的解鏈溫度，其中，除了天然核苷酸代替了非天然核苷酸，所述對照寡核苷酸在其他方面與所述阻斷劑寡核苷酸相同。
7. 權(quán)利要求l的方法，其中所述阻斷劑寡核苷酸含有至少一個(gè)非核苷酸部分，其中與對照寡核苷酸相比，所述非核苷酸部分提高了阻斷劑寡核苷酸的解鏈溫度，其中，除了缺乏所述非核苷酸部分，所述對照寡核苷酸在其他方面與所述阻斷劑寡核苷酸相同。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中所述非核苷酸部分結(jié)合DNA的小溝。
9. 權(quán)利要求l的方法，其中所述阻斷劑寡核苷酸以至少7(TC的解鏈溫度與第二序列雜交，根據(jù)在2. 5%甘油、50慮Tricine pH8. 3、45mM醋酸鉀中測量的。
10. 反應(yīng)混合物，其含有-顯著缺乏5' -3'核酸外切酶活性的聚合酶；-含有目標(biāo)序列的多核苷酸；-含有第二序列的多核苷酸，其中所述第二序列與目標(biāo)序列至少有一個(gè)核苷酸不同；_與所述第二序列和目標(biāo)序列雜交的阻斷劑寡核苷酸，其中所述阻斷劑寡核苷酸不含嵌入核苷酸；其中所述阻斷劑寡核苷酸與第二序列的雜交，足以削弱在適于在不存在阻斷劑寡核苷酸時(shí)擴(kuò)增的條件下所述第二序列通過聚合酶的擴(kuò)增，但寡核苷酸與目標(biāo)序列的雜交沒有顯著削弱目標(biāo)序列通過聚合酶的擴(kuò)增。
11. 權(quán)利要求10的反應(yīng)混合物，其中所述阻斷劑寡核苷酸對于第二序列的Tm高于阻斷 劑寡核苷酸對于目標(biāo)序列的Tm不超過20。C，根據(jù)在2. 5%甘油、50慮Tricine pH8. 3、45mM 醋酸鉀中測量的。
12. 權(quán)利要求10的反應(yīng)混合物，其中所述阻斷劑核苷酸以至少7(TC的解鏈溫度與第二 序列雜交，根據(jù)在2. 5%甘油、50慮Tricine pH8. 3、45mM醋酸鉀中測量的。
13. 權(quán)利要求10的反應(yīng)混合物，其中 -所述阻斷劑寡核苷酸和第二序列的解鏈溫度；禾口 _所述阻斷劑寡核苷酸和目標(biāo)序列的解鏈溫度之間的差異為至少5。C，根據(jù)在2. 5%甘油、50慮Tricine pH8. 3、45mM醋酸鉀中測量的。
14. 權(quán)利要求10的反應(yīng)混合物，其中所述阻斷劑寡核苷酸含有至少一個(gè)非天然核苷 酸，其中與對照寡核苷酸相比，所述非天然核苷酸提高了所述阻斷劑寡核苷酸的解鏈溫度， 其中，(a)除了天然核苷酸代替了非天然核苷酸，所述對照寡核苷酸在其他方面與阻斷劑寡 核苷酸相同，或(b)除了缺乏非核苷酸部分，所述對照寡核苷酸在其他方面與阻斷劑寡核 苷酸相同。
15. 試劑盒，其含有-顯著缺乏5' -3'核酸外切酶活性的聚合酶； -含有目標(biāo)序列的多核苷酸；-含有第二序列的多核苷酸，其中所述第二序列與目標(biāo)序列至少有一個(gè)核苷酸不同； _與所述第二序列和目標(biāo)序列雜交的阻斷劑寡核苷酸，其中所述阻斷劑寡核苷酸不含 嵌入核苷酸；其中所述阻斷劑寡核苷酸與第二序列的雜交足以削弱在適于在不存在阻斷劑寡核苷 酸時(shí)擴(kuò)增的條件下所述第二序列通過聚合酶的擴(kuò)增，但寡核苷酸與目標(biāo)序列的雜交沒有顯 著削弱目標(biāo)序列通過聚合酶的擴(kuò)增。
全文摘要
提供了通過抑制相關(guān)序列的擴(kuò)增來擴(kuò)增目標(biāo)多核苷酸序列的方法和組合物。該方法使用缺乏5′-3′核酸外切酶活性的聚合酶和不可延伸的阻斷劑寡核苷酸，該阻斷劑寡核苷酸優(yōu)選與非目標(biāo)序列和引物的下游雜交，由此防止通過聚合酶的模板依賴性引物延伸。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101778952SQ200880102467
公開日2010年7月14日 申請日期2008年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月8日
發(fā)明者N·牛頓 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司