檢測TLR9介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵分子含量的特異性引物、擴(kuò)增程序及定量試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)的分子生物學(xué)方 法，特別是涉及熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Q-PCR)。 技術(shù)背景
[0002] NF-K B信號(hào)通路的作用十分廣泛，尤其是在天然抗病毒免疫防御中起到重要的作 用。根據(jù)目前的研宄表明，病毒可以通過激活NF- κ B信號(hào)通路，進(jìn)而誘導(dǎo)固有免疫功能改 變，目前研宄病毒致病或者感染機(jī)制中更注重宿主在病毒感染過程中免疫反應(yīng)變化。TLR9 屬于胞內(nèi)受體，可以與細(xì)胞自主內(nèi)吞的配體CpG DNA的結(jié)合，募集銜接分子MyD88,形成 TLR9復(fù)合體，經(jīng)過一系列復(fù)雜的信號(hào)傳遞，最終激活NF- κ B，啟動(dòng)靶基因的表達(dá)，介導(dǎo)多種 反應(yīng)。TLR9介導(dǎo)的MyD88依賴型NF- κ B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的差異表達(dá)在抗病毒的研宄 中有著至關(guān)重要的作用。
[0003] 在病毒感染機(jī)體后，快速有效的檢測NF- K B通路中關(guān)鍵分子的差異性表達(dá)對(duì)我 們研宄病毒的感染機(jī)制是非常必要的，但是目前的檢方法由于技術(shù)缺陷、操作繁瑣、試驗(yàn)時(shí) 間長、無標(biāo)準(zhǔn)化、成本高等原因讓試驗(yàn)者面臨很大的困難。目前，還沒有開發(fā)出一種準(zhǔn)確、快 速、簡單費(fèi)用低廉的檢測TLR9介導(dǎo)的MyD88依賴型NF- κ B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子mRNA表達(dá) 水平的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有各種技術(shù)對(duì)病毒感染機(jī)制研宄中NF- κ B信號(hào)通路中關(guān) 鍵分子差異性表達(dá)存在的不足，包括分析耗時(shí)長、不能高通量、操作繁瑣等缺陷。提供了一 種快速檢測對(duì)TLR9介導(dǎo)的MyD88依賴型NF- κ B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子相對(duì)含量的技術(shù)，可 以反映機(jī)體或者是體外培養(yǎng)的細(xì)胞在病毒感染的不同階段NF- κ B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的 表達(dá)情況。設(shè)計(jì)了 12對(duì)特異性引物，分別為：TLR9、TRAF3、TRAF6、IRAK4、TAKl、TAB2、IKKa、 RELA、I κ Ββ、MyD88、TIRAP、β -Actin，以便用于熒光定量分析。同時(shí)，我們對(duì)檢測的關(guān)鍵分 子在96孔板上進(jìn)行合理排布，使其得到更加充分的利用，能過更加高效的進(jìn)行研宄分析。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種檢測TLR2/4介導(dǎo)的NF- κ B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子含量的特異性引物，序列如下： 用于對(duì)TLR9進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO : 1、SEQ ID NO :2所示，該 序列與豬TLR9mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TRAF3進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4所示， 該序列與豬TRAF3mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TRAF6進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6所示， 該序列與豬TRAF6mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)IRAK4進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8所示， 該序列與豬IRAMmRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TAKl進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :0所示，該 序列與豬TAKlmRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TAB2進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :2所示， 該序列與豬TAB2mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)IKKa進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14所示， 該序列與豬IKK a mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)RELA進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16所示， 該序列與豬RELA mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)Ικ Ββ進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18所 示，該序列與豬I κ B β mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TIRAP進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20所示， 該序列與豬TIRAP mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)MyD88進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22所示， 該序列與豬MyD88mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)β-Actin進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24所 示，該序列與豬β-Actin mRNA的一段互補(bǔ)。
[0006] 一種檢測TLR9介導(dǎo)的NF- K B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子含量的擴(kuò)增程序，95°C預(yù)變性 30s ;進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增：95°C變性15s，60°C延伸30s，同時(shí)采集熒光信號(hào)強(qiáng)度。
[0007] 含有權(quán)利要求1所述的檢測TLR9介導(dǎo)的NF- κ B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子含量的定量 試劑盒，試劑盒包含熒光定量反應(yīng)預(yù)混酶和含有引物的熒光定量96孔反應(yīng)板，試劑盒由下 述試劑組成：2. 5mL熒光定量預(yù)混酶；3mL無菌水；含有引物的PCR 96孔反應(yīng)板一塊。
[0008] 本發(fā)明的有益效果是：TLR9介導(dǎo)的MyD88依賴型NF- K B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子的 差異表達(dá)在抗病毒的研宄中有著至關(guān)重要的作用，對(duì)病毒性疾病的防治具有重要意義。已 經(jīng)表明，多種病毒性疾病在感染機(jī)體的過程中引起TLR9介導(dǎo)的MyD88依賴型NF- κ B信號(hào) 通路中關(guān)鍵分子mRNA表達(dá)譜的蓋白，通過本發(fā)明設(shè)計(jì)，各種引物的反應(yīng)溫度都進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn) 化，片段長度也進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，所有的mRNA定量均可以在相同條件下完成，使不同的實(shí)驗(yàn) 間具有可比性。本發(fā)明能夠建立在mRNA檢測的熒光定量PCR技術(shù)平臺(tái)上，不僅可以縮短實(shí) 驗(yàn)時(shí)間，減少實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)使用，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和說服力，提供一個(gè)全新的檢測標(biāo)準(zhǔn)和 評(píng)估體系。通過病毒感染后組織采樣或者人工培養(yǎng)細(xì)胞系快速完成總RNA的提取，并于熒 光定量PCR上進(jìn)行檢測。本發(fā)明有效的縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間、減少經(jīng)費(fèi)的使用等。通過優(yōu)化的實(shí) 驗(yàn)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，組成檢測靈敏、方便的試劑盒，為TLR9介導(dǎo)的MyD88依賴型NF- κ B 信號(hào)通路中關(guān)鍵分子提供可靠的檢測技術(shù)。
[0009]
【附圖說明】
[0010] 圖1為96孔反應(yīng)板的整體布局； 圖2為TLR9檢測的溶解曲線； 圖3為TRAF3檢測的溶解曲線； 圖4為TRAF6檢測的溶解曲線； 圖5為IRAK4檢測的溶解曲線； 圖6為TAKl檢測的溶解曲線； 圖7為TAB2檢測的溶解曲線； 圖8為IKKa檢測的溶解曲線； 圖9為RELA檢測的溶解曲線； 圖10為I κ Ββ檢測的溶解曲線； 圖11為MyD88檢測的溶解曲線； 圖12為TIRAP檢測的溶解曲線； 圖13為β-Actin檢測的溶解曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 以Genbank公布的引物序列為參考，從NCBI上下載已知序列使用DNASTAR軟件進(jìn) 行序列比對(duì)，選取針對(duì)各個(gè)靶基因高度保守與特異的基因片段，用Premier軟件設(shè)計(jì)了相 關(guān)引物，引物方向均為Y -3'，具體如下： SEQ ID NO：l CATCTCCCAGGCGGTCAA SEQ ID NO ：2 TCGGCTATGGATGTCATTGTG SEQ ID NO ：3 GCGTGTCAAGAAGGCATCG SEQ ID NO ：4 GTTCCTCAAACTGGCAATCAT SEQ ID NO ：5 GCGTATGACAGCCACCTCC SEQ ID NO ：6 AACCCTCCCTCCGAAGAC SEQ ID NO ：7 GACGATACTCCACCACTCT SEQ ID NO ：8 TGTCTGGGCAAACTTCTC SEQ ID NO ：9 GACCTGAAACCACCAAAC SEQ ID NO： 10 TTCCCAAAGAATAATACCC SEQ ID N0：11 ATAGTGCCATTGGATAGGG SEQ ID NO ：12 AAGGGACATGATCGTGCT SEQ ID NO ：13 AGGACCTGTTGACCTTACT SEQ ID NO ：14 GTATTTATTCCAGTTTCACG SEQ ID NO ：15 GCTCTACCTCCTGTTGTCT SEQ ID NO ：16 GTATCTTCCTTCTCCCATT SEQ ID NO ：17 TGCCCGTTATCCACAAAGA SEQ ID NO ：18 TGAACCACAATGTCGTCGTAT SEQ ID NO ：19 ATGCTTCACAGCCTACCTCA SEQ ID NO ：20 ACGAAAGCCACCATCAGG SEQ ID NO ：21 GTGCCGTCGGATGGTTAGT SEQ ID NO ：22 AACAGGGTTCAGTCGCTTC SEQ ID NO ：23 GGACTTCGAGCAGGAGATGG SEQ ID NO ：24 GCACCGTGTTGGCGTAGAGG 一種檢測TLR2/4介導(dǎo)的NF- κ B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子含量的特異性引物，序列如下： 用于對(duì)TLR9進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO : 1、SEQ ID NO :2所示，該 序列與豬TLR9mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TRAF3進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4所示， 該序列與豬TRAF3mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TRAF6進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列