如SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6所示， 該序列與豬TRAF6mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)IRAK4進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8所示， 該序列與豬IRAMmRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TAKl進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :0所示，該 序列與豬TAKlmRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TAB2進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :2所示， 該序列與豬TAB2mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)IKKa進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14所示， 該序列與豬IKK a mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)RELA進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16所示， 該序列與豬RELA mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)Ικ Ββ進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18所 示，該序列與豬I κ B β mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TIRAP進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20所示， 該序列與豬TIRAP mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)MyD88進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22所示， 該序列與豬MyD88mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)β-Actin進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24所 示，該序列與豬β-Actin mRNA的一段互補(bǔ)。
[0012] 一套用于對(duì)TLR9介導(dǎo)的MyD88依賴型NF- κ B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子mRNA進(jìn)行相 對(duì)定量檢測(cè)的的引物，及配套內(nèi)參引物。針對(duì)內(nèi)參基因和mRNA的12對(duì)特異性引物分別為 TLR9、TRAF3、TRAF6、IRAK4、TAK1、TAB2、IKK a、RELA、I κ B β、MyD88、TIRAP、β -Actin。
[0013] 一種檢測(cè)TLR9介導(dǎo)的NF-κ B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子含量的擴(kuò)增程序，使得TLR9、 TRAF3、TRAF6、IRAK4、TAK1、TAB2、IKKa、RELA、I κΒβ、MyD88、TIRAP、β-Actin 可以同時(shí) 被檢測(cè)，達(dá)到快速分析的目的。
[0014] 含有權(quán)利要求1所述的檢測(cè)TLR9介導(dǎo)的NF- K B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子含量的定量 試劑盒，針對(duì)1'1^9、了狀卩3、了狀卩6、1狀1(4、了六1(1、了六82、11?(1、1^1^、11〇80、]\^〇88、1'1狀？、 β -Actin進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，試劑盒包含熒光定量反應(yīng)預(yù)混酶和含有引物的熒光定量96 孔反應(yīng)板，試劑盒由下述試劑組成：2. 5mL熒光定量預(yù)混酶；3mL無(wú)菌水；含有引物的PCR 96孔反應(yīng)板一塊，圖1為96孔反應(yīng)板的整體布局。
[0015] 表1為96孔反應(yīng)板的各孔中引物的分布情況。舉例說(shuō)明：A1-3,表示A1、A2、A3三 孔；TLR9,表示A1-3中所含的為檢測(cè)TLR9的特異性引物；陰性對(duì)照，表示該孔不含有特異 性引物，作空白對(duì)照用。
[0016] 表1 96孔反應(yīng)板的各孔中引物的分布情況
實(shí)施過(guò)程包括總mRNA的獲取、cDAN制備和檢測(cè)三個(gè)過(guò)程。
[0017] 總mRNA的獲取：取細(xì)胞懸液300 μ L于一干凈的EP管中，加入900 μ LTRIZOL，充分 混合均勻后室溫作用5-10min。加入氯仿200 μ L，充分搖勻后靜置IOmin ; 12000r/min，4°C， 離心15min。取上清，約400 μ L，加入等體積的異丙醇輕搖混勾，4°C靜置15min ;12000r/ min，4°C，離心15min。棄去上清，加入75%乙醇Iml輕搖混勾；8000r/min，4°C，離心10min。 棄去上清，放置于干凈濾紙上干燥5-10min ;加入10-15 μ LO. I % DEPC水溶解6min，-70°C 保存?zhèn)溆?。也可根?jù)實(shí)際需求，按照商品化試劑盒要求進(jìn)行操作。
[0018] cDAN制備：在無(wú) RNA酶PCR管中依次加入3 μ L總mRNA (可根據(jù)RNA濃度調(diào)整）， IyL 01igo(dT)18引物，9yL無(wú) RNA酶水，70°C孵育IOmin后，立即置冰浴lmin。隨后依 次加入反轉(zhuǎn)錄緩沖液（5x) 5 μ L，dNTP 5 μ L，RNA酶抑制劑1 μ L，反轉(zhuǎn)錄酶1 μ L，42°C孵育 60min進(jìn)行cDAN合成。最后，70°C孵育IOmin滅活反轉(zhuǎn)錄酶，-20°C保存?zhèn)溆靡部筛鶕?jù)實(shí)際 需求，按照商品化試劑盒要求進(jìn)行操作。
[0019] 檢測(cè)過(guò)程：每個(gè)關(guān)鍵分子的檢測(cè)需要進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，每個(gè)反應(yīng)管的反應(yīng)體系 可為10-50 μ L。在20 μ L的熒光定量PCR反應(yīng)體系中，每孔加入樣品CDNA和雙蒸水的總 體積為9 μ L，再加入預(yù)混酶10 μ L，即可開(kāi)始反應(yīng)。對(duì)cDNA擴(kuò)增以及定量程序如下：95°C預(yù) 變性30s ;進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增：95°C變性10s，60°C延伸30s，同時(shí)采集熒光信號(hào)強(qiáng)度。通過(guò) 常規(guī)方法對(duì)各PCR管的Ct值進(jìn)行分析，經(jīng)與對(duì)照內(nèi)參進(jìn)行比較后得出結(jié)果。圖2-13為各 引物111?9、丁狀卩3、丁狀卩6、1狀1(4、丁八1(1、丁八82、11?(1、1^1^、11〇80、]\^〇88、1'1狀？、0-八(^111 檢測(cè)的溶解曲線。在熒光定量PCR的檢測(cè)中，引物的特異性和反應(yīng)條件的優(yōu)化直接關(guān)系著 檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實(shí)施過(guò)程中表現(xiàn)為擴(kuò)增時(shí)溶解曲線的波峰是否單一、穩(wěn)定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)TLR9介導(dǎo)的NF- K B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子含量的特異性引物，其特征在于 序列如下： 用于對(duì)TLR9進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO : 1、SEQ ID NO :2所示，該 序列與豬TLR9 mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TRAF3進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4所示， 該序列與豬TRAF3 mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TRAF6進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6所示， 該序列與豬TRAF6 mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)IRAK4進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8所示， 該序列與豬IRAK4 mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TAKl進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :0所示，該 序列與豬TAKl mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TAB2進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :11、SEQ ID NO :2所示， 該序列與豬TAB2 mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)IKKa進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :13、SEQ ID NO :14所示， 該序列與豬IKKa mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)RELA進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16所示， 該序列與豬RELA mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)Ik 進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18所 示，該序列與豬IkB|3 mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)TIRAP進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :20所示， 該序列與豬TIRAP mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)MyD88進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22所示， 該序列與豬MyD88 mRNA的一段互補(bǔ)； 用于對(duì)0-Actin進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24所 示，該序列與豬0-Actin mRNA的一段互補(bǔ)。2. -種檢測(cè)TLR9介導(dǎo)的NF- K B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子含量的擴(kuò)增程序，其特征在于： 95°C預(yù)變性30s ;進(jìn)行40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增：95°C變性15s，60°C延伸30s，同時(shí)采集熒光信號(hào)強(qiáng) 度。3. 含有權(quán)利要求1所述的檢測(cè)TLR9介導(dǎo)的NF- K B信號(hào)通路中關(guān)鍵分子含量的定量試 劑盒，其特征在于：試劑盒包含熒光定量反應(yīng)預(yù)混酶和含有引物的熒光定量96孔反應(yīng)板， 試劑盒由下述試劑組成：2. 5 mL熒光定量預(yù)混酶；3 mL無(wú)菌水；含有引物的PCR 96孔反應(yīng) 板一塊。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)TLR2/4介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵分子含量的特異性引物，序列如下：用于對(duì)TLR9進(jìn)行定量PCR的特異性引物，序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示，該序列與豬TLR9 mRNA的一段互補(bǔ)。本發(fā)明有效的縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間、減少經(jīng)費(fèi)的使用等。通過(guò)優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，組成檢測(cè)靈敏、方便的試劑盒，為T(mén)LR9介導(dǎo)的MyD88依賴型NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵分子提供可靠的檢測(cè)技術(shù)。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開(kāi)號(hào)】CN104946777
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510406020
【發(fā)明人】楊國(guó)宇, 魏戰(zhàn)勇, 胡慧, 鄭蘭蘭, 宋月, 索江華
【申請(qǐng)人】河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2015年7月10日