防止擴(kuò)增過(guò)程中高分子量產(chǎn)物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增和檢測(cè)可存在于生物樣品中的核酸目標(biāo)的改進(jìn)的方法，包含用于產(chǎn)生擴(kuò)增子的引物對(duì)和對(duì)于所述擴(kuò)增子特異性的可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料，其中至少一個(gè)引物在5’末端用與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列修飾。防止或部分或完全抑制在擴(kuò)增過(guò)程中的高分子量產(chǎn)物的形成。本發(fā)明進(jìn)一步提供適當(dāng)修飾的引物和包含所述引物的試劑盒用于防止或抑制在核酸目標(biāo)的擴(kuò)增和檢測(cè)過(guò)程中的高分子量產(chǎn)物形成的用途。
【專利說(shuō)明】防止擴(kuò)增過(guò)程中高分子量產(chǎn)物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于體外診斷領(lǐng)域，涉及改進(jìn)的用于擴(kuò)增和檢測(cè)生物樣品中可存在的核酸目標(biāo)的方法，包括用于產(chǎn)生擴(kuò)增子的至少一個(gè)引物對(duì)和對(duì)于所述擴(kuò)增子特異性的可檢測(cè)的探針，其中至少一個(gè)引物在5’末端用與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列修飾。所述改進(jìn)具體基于的事實(shí)為，防止或部分或全部抑制在擴(kuò)增過(guò)程中除所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增子之外的副產(chǎn)物(即高分子量產(chǎn)物的)的形成。如果本發(fā)明在診斷類型的應(yīng)用中使用，則避免假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。本發(fā)明進(jìn)一步提供適當(dāng)修飾的引物和包含所述引物的試劑盒用于防止或抑制在擴(kuò)增和檢測(cè)核酸目標(biāo)過(guò)程中高分子量產(chǎn)物形成的用途。
[0002] 【背景技術(shù)】
在分子診斷領(lǐng)域，核酸的擴(kuò)增和檢測(cè)非常重要。核酸擴(kuò)增和檢測(cè)的診斷應(yīng)用的實(shí)例是病毒例如人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、西尼羅河病毒(WNV)的檢測(cè)，或?qū)θ祟惷庖呷毕莶《?HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)和/或丙型肝炎病毒(HCV)的存在進(jìn)行的血液捐獻(xiàn)物的常規(guī)篩查。所述擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)也適于細(xì)菌核酸目標(biāo)或腫瘤學(xué)標(biāo)志物的分析等。
[0003]對(duì)于擴(kuò)增和檢測(cè)核酸目標(biāo)最突出和廣泛使用的方法是利用聚合酶酶類的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR, US 4.683.195和US 4.683.202)。相關(guān)重要的改進(jìn)是，如在PCR過(guò)程中利用攜帶報(bào)告基團(tuán)或標(biāo)記物的修飾的寡核苷酸對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)，所述修飾的寡核苷酸已知為水解或5’-核酸酶探針，例如在COBAS? TaqMan? (US 5.210.015和US 5.487.972)上的商業(yè)測(cè)定中所使用的。其它改進(jìn)的擴(kuò)增和檢測(cè)方法已知為分子信標(biāo)技術(shù)(W0 95/13399)或利用包含小溝結(jié)合物(minor groove binder,MGB)部分的寡核苷酸的方法(W0 03/062445和 WO 2006/135765)。
[0004]進(jìn)一步已知多種引物(在這些引物的至少一種的5’末端包含添加的具有高GC含量的寡核苷酸)的使用顯示在擴(kuò)增效率中的改進(jìn)(Q.Liu等，Genome Research vol.7(1997)，ρ.389-398; WO 01/94638; US 2004/0110182)。對(duì)于例如其 5’ 末端已添加 GGAC單元的引物，經(jīng)過(guò)大約12到40個(gè)PCR循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物的最終數(shù)量明顯高于未修飾的引物。
[0005]Afonina 等(BioTechniques vol.43(3) (2007)， p.1-3; WO 2006/135765)描述通過(guò)使用具有在5’末端隨機(jī)分散的，短的腺嘌呤和胸腺嘧啶豐富的片段的引物和小溝結(jié)合物(MGB)熒光水解探針，增加實(shí)時(shí)PCR熒光信號(hào)并從而獲得改進(jìn)的擴(kuò)增效率。
[0006]并且，在一些PCR測(cè)定中，副產(chǎn)物，像高分子量產(chǎn)物的形成，可以對(duì)擴(kuò)增效率具有實(shí)質(zhì)性的影響，如產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。具體而言對(duì)于低滴度樣品，由于高分子量擴(kuò)增產(chǎn)物的形成而預(yù)期檢測(cè)信號(hào)的減少或信號(hào)丟失，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。當(dāng)進(jìn)行更多的PCR循環(huán)時(shí)，擴(kuò)增效率通常更加減少。
[0007]在定量PCR反應(yīng)中，經(jīng)常添加內(nèi)部驗(yàn)證和定量標(biāo)準(zhǔn)品并且共擴(kuò)增。其作為制備和擴(kuò)增過(guò)程的對(duì)照并對(duì)抑制效果進(jìn)行補(bǔ)償。內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增過(guò)程中高分子量產(chǎn)物的形成可以導(dǎo)致抑制信號(hào)和無(wú)效標(biāo)準(zhǔn)，使得由內(nèi)部驗(yàn)證和定量標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照的PCR反應(yīng)無(wú)效。然而，現(xiàn)有技術(shù)中，例如WO 2008/064687或WO 2012/032510中描述的含尾部的引物不適于防止或抑制擴(kuò)增子的高分子量產(chǎn)物的形成，擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行越長(zhǎng)或者PCR循環(huán)進(jìn)行越多，所述擴(kuò)增子的高分子量產(chǎn)物產(chǎn)生越多。所述含尾部的引物更能夠減少基于所應(yīng)用引物的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的形成。
[0008]假陽(yáng)性結(jié)果的來(lái)源是“遺留污染(carryover contamination) ”,其中來(lái)自先前PCR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增子)污染后續(xù)的PCR測(cè)定。污染物可以通過(guò)技術(shù)員、設(shè)備或甚至經(jīng)由氣溶膠傳遞。高分子量產(chǎn)物比單個(gè)擴(kuò)增子對(duì)污染防止措施像尿嘧啶-DNA糖基化酶(US
6.713.294)更有抗性，并從而顯著地增加遺留污染的風(fēng)險(xiǎn)。在真正的陰性樣品中，其中不存在目標(biāo)核酸，污染物產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。在真正的陽(yáng)性樣品中，其中存在目標(biāo)核酸，污染物與真正的目標(biāo)共擴(kuò)增。該共擴(kuò)增可以歪曲定量測(cè)定的結(jié)果，而其中真正的目標(biāo)的準(zhǔn)確量必須被確定。
[0009]因此，本領(lǐng)域有需要以提供用于核酸目標(biāo)的簡(jiǎn)單和可靠的擴(kuò)增和檢測(cè)的方法。具體存在需要以提供致力于抑制高分子量副產(chǎn)物的適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)的方法。
[0010]
【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增和檢測(cè)可存在于生物樣品中的核酸目標(biāo)的新方法和用途，包括用于產(chǎn)生擴(kuò)增子的至少一個(gè)引物對(duì)和對(duì)于所述擴(kuò)增子特異性的可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料，其中至少一個(gè)引物在5’末端用與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列修飾。所述改進(jìn)具體基于以下事實(shí)，即，防止或部分或完全抑制在擴(kuò)增過(guò)程中高分子量產(chǎn)物的形成，并從而由此避免如假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。從而，本發(fā)明的一個(gè)主題是:
用于擴(kuò)增和檢測(cè)生物樣品中的核酸目標(biāo)的方法，其中防止或抑制擴(kuò)增過(guò)程中高分子量產(chǎn)物的形成，所述方法包括下列步驟:
a)使所述樣品中的核酸與擴(kuò)增試劑接觸，所述擴(kuò)增試劑至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷單體、用于產(chǎn)生擴(kuò)增子的延長(zhǎng)的正向引物或延長(zhǎng)的反向引物和對(duì)于所述擴(kuò)增子特異性的可檢測(cè)的探針或DNA`結(jié)合染料，其中所述延長(zhǎng)的正向引物或所述反向引物的至少一種包含添加到所述引物的5’末端的與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列，所述聚N序列由一種類型核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)；
b)將所述核酸與所述擴(kuò)增試劑在足以使擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生的一段時(shí)間和條件下孵育；并
c)經(jīng)由所述可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料檢測(cè)所述擴(kuò)增子。
[0011]本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于擴(kuò)增和檢測(cè)可存在于生物樣品中的核酸目標(biāo)的新方法和用途，包括用于產(chǎn)生擴(kuò)增子的至少一個(gè)引物對(duì)和對(duì)于所述擴(kuò)增子特異性的可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料，其中兩條引物均在5’末端用與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列修飾。所述改進(jìn)具體基于以下事實(shí)，g卩，防止或部分或完全抑制在擴(kuò)增過(guò)程中高分子量產(chǎn)物的形成，并從而由此避免如假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。從而，本發(fā)明的一個(gè)主題是:
用于擴(kuò)增和檢測(cè)生物樣品中的核酸目標(biāo)的方法，其中防止或抑制擴(kuò)增過(guò)程中高分子量產(chǎn)物的形成，所述方法包含下列步驟:
a)使所述樣品中的核酸與擴(kuò)增試劑接觸，所述擴(kuò)增試劑至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷單體、用于生成擴(kuò)增子的延長(zhǎng)的正向引物和延長(zhǎng)的反向引物和對(duì)于所述擴(kuò)增子特異性的可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料，其中所述延長(zhǎng)的正向引物和反向引物各自包含添加到所述引物的5’末端的與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列，所述聚N序列由一種類型核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)；
b)在足以使擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生的一段時(shí)間和條件下孵育所述核酸和所述擴(kuò)增試劑；并
c)經(jīng)由所述可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料檢測(cè)所述擴(kuò)增子。
[0012]本發(fā)明進(jìn)一步的一個(gè)主題是:
用于防止或抑制PCR擴(kuò)增過(guò)程中高分子量產(chǎn)物形成的方法，所述方法包括下列步驟:
a)使生物樣品中的核酸與擴(kuò)增試劑接觸，所述擴(kuò)增試劑至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷單體、用于產(chǎn)生擴(kuò)增子的延長(zhǎng)的正向引物和/或延長(zhǎng)的反向引物和對(duì)于所述擴(kuò)增子特異性的可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料，其中所述延長(zhǎng)的正向引物和/或反向引物的至少一種包含添加到所述引物的5’末端的與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列，所述聚N序列由一種類型核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)；
b)在足以使擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生的一段時(shí)間和條件下孵育所述核酸和所述擴(kuò)增試劑；并
c)經(jīng)由所述可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料檢測(cè)所述擴(kuò)增子。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的方法添加了對(duì)本領(lǐng)域的若干改進(jìn):通過(guò)防止或抑制在PCR過(guò)程中高分子量產(chǎn)物的形成，因?yàn)闊晒庖种票槐苊舛箶U(kuò)增子的后續(xù)檢測(cè)更加可靠。這應(yīng)用于目標(biāo)和/或內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品兩者的擴(kuò)增。高分子量產(chǎn)物，而不是擴(kuò)增子，導(dǎo)致在后續(xù)PCR反應(yīng)中的熒光抑制。本發(fā)明方法特別是有利于以下樣品的檢測(cè):其中不存在核酸目標(biāo)或當(dāng)應(yīng)用通常至少20個(gè)PCR循環(huán)時(shí)僅含低滴度量的核酸目標(biāo)。在一些該實(shí)施方案中，PCR循環(huán)在多于30個(gè)循環(huán)后終止，有時(shí)多于40個(gè)，優(yōu)選多于50個(gè)和最優(yōu)選多于60個(gè)循環(huán)后終止。對(duì)于大部分這些樣品，擴(kuò)增反應(yīng)在50個(gè)循環(huán)之前不終止。在存在來(lái)自先前的PCR反應(yīng)的低水平的污染的條件下，該P(yáng)CR反應(yīng)的抑制甚至更加顯著。
[0014]通過(guò)使用延長(zhǎng)的引物以阻止或抑制高分子量產(chǎn)物形成的根據(jù)本發(fā)明的方法還可以用于其中不需要用于檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料的擴(kuò)增方法。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的表述“聚N序列”指多核苷酸序列，其可以含有所有5種天然堿基:腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿苷(U)，或這些天然堿基的僅四、三、二或一種。根據(jù)本發(fā)明的聚N序列包含至少兩個(gè)或更多相同的堿基，例如，(A)m,⑴m、(G)m、(C)m、(U)m，其中m具體是數(shù)目2到10，或不同的堿基，例如(AT) n、(AG) η、(AC) η、(TA) n、(UA) η、(GA)η或(CG) η，其中η具體是數(shù)目I到5，并且通常總共不多于50個(gè)核苷酸。優(yōu)選地，所述聚N序列由衍生自腺苷㈧、胸苷(T)、尿苷⑶、胞苷(C)或鳥苷(G)的一種類型的核苷酸或兩種不同的核苷酸組成。聚N序列可以添加到至少一種所使用的引物上。添加到兩種或更多種引物的聚N序列可以是相同或不同的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，正向引物和反向引物包含相同的聚N序列。
[0016]根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供上述方法，其中步驟a)中所述的聚N序列包含聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。根據(jù)本發(fā)明使用以下聚N序列，所述聚N序列包含100%的衍生自腺苷㈧、胸苷⑴、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)的一種類型核苷酸或兩種不同核苷酸，并且長(zhǎng)度總共2到10個(gè)核苷酸或4到6個(gè)核苷酸。根據(jù)本發(fā)明具體使用包含4到6個(gè)連續(xù)腺苷堿基(A)的聚N序列尾。聚N尾還可以包含修飾的核苷酸，像烷基化的核苷酸例如N4-乙基-dC、N6-甲基-dA或2’ -O-甲基-核苷酸等，只要所修飾的寡核苷酸(引物)具有在擴(kuò)增反應(yīng)中與其互補(bǔ)物雜交和作為模板的能力。[0017]并且，本發(fā)明提供試劑盒，其用于通過(guò)任何上述方法擴(kuò)增和檢測(cè)生物樣品中的目標(biāo)核酸。所述試劑盒包含至少一種聚合酶，例如熱穩(wěn)定的聚合酶、至少四種不同的三磷酸核苷或其它核苷單體、用于產(chǎn)生至少一種擴(kuò)增子的至少一種延長(zhǎng)的正向引物和/或至少一種延長(zhǎng)的反向引物，以及至少一種對(duì)于所述擴(kuò)增子特異性的可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料，其中所述延長(zhǎng)的正向引物和反向引物的至少一種包含添加到所述引物的5’末端的與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列，所述聚N序列由一種類型核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷⑶、胞苷(C)或鳥苷(G)。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒具體是那些其中所述聚N序列包含長(zhǎng)度為2到10個(gè)核苷酸的聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C、聚G序列的試劑盒。聚N序列可以連接到至少一種所使用的引物上。連接到兩種或更多種引物的聚N序列可以是相同或不同的。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含含有相同的聚N序列的正向引物和反向引物。試劑盒可以進(jìn)一步包含額外的引物和探針、酶類像尿嘧啶-N-糖基化酶、適配體、緩沖液組分和去垢劑等。
[0018]為了幫助理解本發(fā)明，下面定義若干術(shù)語(yǔ)。
[0019]“生物樣品”可以是天然來(lái)源的任何樣品。“生物樣品”例如衍生自人并且是體液或身體的組織。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，“生物樣品”是血液。
[0020]術(shù)語(yǔ)“核苷”指由連接到糖，例如核糖或脫氧核糖的C-1'碳的堿基組成的化合物。核苷的堿基部分通常是雜環(huán)堿基，例如，嘌呤或嘧啶。
[0021]術(shù)語(yǔ)“核苷酸”指作為單體單元或在多核苷酸內(nèi)的核苷的磷酸酯?！昂塑?’-三磷酸”指具有連接到糖5’ -碳位置的三磷酸酯基團(tuán)的核苷酸，并且有時(shí)表示為“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”。修飾的核苷酸是任何核苷酸(如ATP、TTP、UTP、GTP或CTP)，其已被化學(xué)修飾，典型地通過(guò)修飾堿基、糖或磷酸部分。修飾的核苷酸包括，例如但不限于，堿基部分例如N4-乙基胞苷、N6-甲基腺苷、N6-叔丁基苯甲基腺苷或N4-叔丁基苯甲基胞苷、5-甲基胞苷、6-巰基嘌呤、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、6-硫鳥嘌呤，或糖修飾例如2’ -O-甲基-核糖和2’ -氟-或2’ -氨基-2’ -脫氧核糖等。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“核苷酸類似物”指非天然存在的任何核苷酸。
[0022]表述“其它核苷單體”指除了標(biāo)準(zhǔn)的三磷酸核苷之外的磷酸活化的核苷，其可以在酶促多核苷酸合成中采用，作為例如四磷酸核苷等。
[0023]術(shù)語(yǔ)“目標(biāo)核酸”和“目標(biāo)區(qū)域”指所要擴(kuò)增、檢測(cè)或另外分析的核酸區(qū)域。與引物或探針雜交的序列可以稱為“目標(biāo)序列”。
[0024]術(shù)語(yǔ)“核酸”和“寡核苷酸”指引物、探針和所要檢測(cè)的寡聚體片段，并應(yīng)當(dāng)對(duì)多脫氧核糖核苷酸(包含2-脫氧-D-核糖)，對(duì)多核糖核苷酸(包含D-核糖)和對(duì)任何其它類型的多核苷酸是通用的，其是嘌呤或嘧啶堿基、或修飾的嘌呤或嘧啶堿基的N-糖苷。術(shù)語(yǔ)“核酸”和“寡核苷酸”之間在長(zhǎng)度上沒(méi)有意向的差異，并且這些術(shù)語(yǔ)將互換使用。這些術(shù)語(yǔ)僅指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，這些術(shù)語(yǔ)包括雙和單鏈DNA，以及雙和單鏈RNA，以及RNA和DNA的雙鏈。
[0025]寡核苷酸的準(zhǔn)確大小取決于很多因素和寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸可以通過(guò)任何合適的方法制備，包括，例如適當(dāng)序列的克隆和限制性處理和直接化學(xué)合成，通過(guò)方法例如 Narang等，1979，Meth.Enzymol.68:90-99 的憐酸三酯法；Brown 等，1979，Meth.Enzymol.68:109-151 的憐酸二酯法；Beaucage 等，1981，Tetrahedron Lett.22:1859-1862的亞磷酰胺法；和US 4.458.066中描述的固體支持法。合成方法的綜述提供在 Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry I (3): 165-187 中。
[0026]術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增(amplification) ”、“擴(kuò)增(amplifying) ”等一般指導(dǎo)致分子或相關(guān)分子集合的拷貝數(shù)目增加的任何過(guò)程。當(dāng)其應(yīng)用于多核苷酸分子時(shí)，擴(kuò)增指產(chǎn)生多核苷酸分子或多核苷酸分子的部分的多個(gè)拷貝，典型地從小量的多核苷酸(例如，病毒基因組)開始，其中所擴(kuò)增的材料(擴(kuò)增子、PCR擴(kuò)增子)典型地是可檢測(cè)的。多核苷酸的擴(kuò)增包括各種化學(xué)和酶促過(guò)程。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(反轉(zhuǎn)錄PCR，PCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)反應(yīng)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)反應(yīng)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)過(guò)程中從一個(gè)或幾個(gè)拷貝的模板RNA或DNA分子產(chǎn)生多個(gè)DNA拷貝，是擴(kuò)增的形式。擴(kuò)增不限于起始分子的嚴(yán)格復(fù)制。例如，使用反轉(zhuǎn)錄PCR從樣品中有限量的病毒RNA產(chǎn)生多個(gè)cDNA分子，是擴(kuò)增的形式。并且，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中從單個(gè)DNA分子產(chǎn)生多個(gè)RNA分子，也是擴(kuò)增的形式。
[0027]術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增子”指在具體目標(biāo)核酸的擴(kuò)增之后產(chǎn)生的多核苷酸分子(或共同地，多種分子)。用于產(chǎn)生擴(kuò)增子的擴(kuò)增方法可以是任何合適的方法，最典型地，例如通過(guò)使用PCR方法。擴(kuò)增子典型地但不專有地是DNA擴(kuò)增子。擴(kuò)增子可以是單鏈的或雙鏈的，或在以任何濃度比的其混合物中。
[0028]術(shù)語(yǔ)“高分子量產(chǎn)物”指擴(kuò)增子的寡聚體(或多聚體或多聯(lián)體)并因此包含對(duì)引物、探針和DNA結(jié)合染料的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。隨著更多PCR循環(huán)進(jìn)行，這些具有約1000個(gè)堿基對(duì)到10000個(gè)堿基對(duì)的高分子量產(chǎn)物形成增加，具體是因?yàn)閿U(kuò)增子非特異性地充當(dāng)引物。
[0029]術(shù)語(yǔ)“雜交”指由兩條單鏈核酸由于互補(bǔ)堿基配對(duì)而形成雙鏈體結(jié)構(gòu)。雜交可以在完全互補(bǔ)的核酸鏈之間或包含小的錯(cuò)配區(qū)域的“基本上互補(bǔ)的”核酸鏈之間發(fā)生。只有完全互補(bǔ)的核酸鏈可以雜交的條件稱作“嚴(yán)格雜交條件”或“序列特異性雜交條件”。在較低嚴(yán)格雜交條件下可以獲得基本上互補(bǔ)的序列的穩(wěn)定的雙鏈體。根據(jù)本領(lǐng)域提供的指導(dǎo)(參見，例如 Sambrook 等，2nd Edition 1989, Part 1-3, Molecular Cloning - A LaboratoryManual, Cold Spring H arbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York),核酸【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員可以經(jīng)驗(yàn)性地考慮多種變量包括，例如寡核苷酸的長(zhǎng)度和堿基對(duì)濃度、離子強(qiáng)度和錯(cuò)配堿基對(duì)的發(fā)生率，從而確定雙鏈體穩(wěn)定性。
[0030]通常，將嚴(yán)格條件選擇為，在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH值，對(duì)于特定序列比熱解鏈點(diǎn)(Tm)低約5°C。Tm是50%的雙鏈體解離的溫度(在規(guī)定的離子強(qiáng)度和pH)。放松雜交條件的嚴(yán)格性將允許序列錯(cuò)配被容忍；容忍的錯(cuò)配程度可以通過(guò)雜交條件的適當(dāng)調(diào)整來(lái)控制。
[0031]術(shù)語(yǔ)“引物”指寡核苷酸，無(wú)論天然的或合成的，其能夠在誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成的條件下充當(dāng)RNA或DNA合成的起始點(diǎn)，所述條件即，在存在四種不同三磷酸核苷和用于聚合的試劑(即，DNA聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶)的情況下，在適當(dāng)緩沖液中和在適當(dāng)?shù)臏囟认?。引物?yōu)選為單鏈寡脫氧核糖核苷酸。引物的適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)度取決于引物意向的用途，但典型地在從15到35個(gè)核苷酸的范圍。短引物分子通常需要更低的溫度以與模板形成足夠穩(wěn)定的雜交復(fù)合物。引物不需要反映模板核酸的準(zhǔn)確的序列，但必須足夠互補(bǔ)以與模板雜交。引物可以摻入額外特征，所述特征增加結(jié)合到目標(biāo)序列的特異性(例如修飾的核苷酸，像EP O 866 071和EP I 201 768中描述的3’末端烷基化的核苷酸)，或者允許檢測(cè)或固定化引物但不改變引物充當(dāng)RNA或DNA合成的起始點(diǎn)的基本性質(zhì)。例如，引物可以在5’端包含額外的核酸序列，其不雜交到目標(biāo)核酸，但其促進(jìn)所擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和/或根據(jù)本發(fā)明抑制或防止高分子量產(chǎn)物的形成。與模板足夠互補(bǔ)以雜交的引物的區(qū)域在本文中稱作雜交區(qū)域。
[0032]如本發(fā)明所使用的術(shù)語(yǔ)“延長(zhǎng)的引物”或“聚N延長(zhǎng)的引物”指在5’端包含額外的多核苷酸序列(聚N)的引物，所述額外的多核苷酸序列可以包含所有五種天然堿基:腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)、尿苷(U)和胸苷(T)，或這些天然堿基的僅四、三、二或一種。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的聚N序列分別包含至少兩個(gè)或更多相同的堿基，例如，㈧m、⑴m、(G)m、(C)m或(U)m，其中m是數(shù)目2到10,或不同的堿基,例如(AT)n、(AG)n、(AC)n、(TA)n、(UA) η、(GA) n或(CG) n，其中n分別是數(shù)目I到5，并且通?？偣膊欢嘤?0個(gè)核苷酸。聚N序列可以例如包括聚Α、聚Τ、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。根據(jù)本發(fā)明在大部分情況下應(yīng)用如下聚N序列，所述聚N序列包含100%的衍生自腺苷(Α)、胸苷(Τ)、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)的一種類型核苷酸或兩種不同核苷酸，并且長(zhǎng)度總共2到10個(gè)核苷酸，或4到6個(gè)核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，使用至少一種適當(dāng)延長(zhǎng)的引物。添加到至少兩種延長(zhǎng)的引物的每一種的聚N序列可以是相同或不同的。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的表述“聚N序列”指由衍生自腺苷㈧、胸苷⑴、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)的一種類型的核苷酸或兩種不同的核苷酸組成的多核苷酸序列。聚N序列包含至少兩個(gè)或更多相同的堿基，例如，⑷m、⑴m、(G)m>⑶m、(C)m,其中m具體是數(shù)目2到10，或不同的堿基，例如(AT) n、(AG) η、(AC) η、(TA) n、(UA) η、(GA) η 或(CG) η，其中 η 具體是數(shù)目I到5，并且通常總共不多于50個(gè)核苷酸。添加到兩種或更多種所使用的引物的聚N序列可以是相同或不同的。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，正向引物和反向引物包含聚N序列，所述聚N序列可以是相同或不同的。聚N尾還可以包含修飾的核苷酸，像烷基化的核苷酸例如Ν4-乙基-dC、N6-甲基-dA或2’ -O-甲基-核苷酸等，只要所修飾的寡核苷酸(引物)具有在擴(kuò)增反應(yīng)中與其互補(bǔ)物雜交和作為模板的能力。在一些實(shí)施方案中，無(wú)論正向或反向引物，僅一種引物包含該聚N尾都可以是有用的。
[0034]在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供上述方法，其中步驟a)中所述的聚N序列包含聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。根據(jù)本發(fā)明使用以下聚N序列，所述聚N序列包含100%的衍生自腺苷㈧、胸苷⑴、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)的一種類型的核苷酸或兩種不同核苷酸，并且長(zhǎng)度總共2到10個(gè)核苷酸。根據(jù)本發(fā)明也使用在長(zhǎng)度上包含4到6個(gè)核苷酸的聚N序列。根據(jù)本發(fā)明具體使用包含四到六個(gè)連續(xù)腺苷(A)堿基的序列尾。
[0035]如本文所用，“上游”引物指其延長(zhǎng)產(chǎn)物是編碼鏈的子序列的引物?！跋掠巍币镏钙溲娱L(zhǎng)產(chǎn)物是互補(bǔ)的非編碼鏈的子序列的引物。
[0036]如本文所用，“正向”引物指在PCR中從在反義鏈3’端的起始密碼子向在模板DNA(核酸目標(biāo))5’端的終止密碼子延伸的引物，而“反向”引物指從在有義鏈5’端的終止密碼子向在模板DNA 3’端的起始密碼子延伸的引物。正向引物通常設(shè)計(jì)以退火到起始密碼子上游的模板DNA，而反向引物設(shè)計(jì)以退火到終止密碼子下游的模板DNA的區(qū)域。
[0037]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“探針”指由于互補(bǔ)堿基配對(duì)而與目標(biāo)核酸的序列形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。探針用于檢測(cè)或捕獲目標(biāo)核酸。探針優(yōu)選為單鏈寡脫氧核糖核苷酸。探針典型地將由“雜交區(qū)域”組成，或包含“雜交區(qū)域”，所述“雜交區(qū)域”優(yōu)選由對(duì)應(yīng)目標(biāo)序列的區(qū)域的10到50個(gè)核苷酸、更優(yōu)選15到35個(gè)核苷酸組成。
[0038]“對(duì)應(yīng)”指至少基本上與指定的核酸或其互補(bǔ)物互補(bǔ)。探針不需要反映模板核酸的準(zhǔn)確的序列，但必須足夠互補(bǔ)以在所選雜交條件下與目標(biāo)雜交。探針寡核苷酸可以包含，或結(jié)合，額外特征，所述額外特征允許檢測(cè)或固定化探針，但不顯著改變雜交區(qū)域的雜交特征。例如，探針可以通過(guò)摻入一種或更多種標(biāo)記的核苷酸或通過(guò)結(jié)合一種或更多種分離的可檢測(cè)的部分而被標(biāo)記。標(biāo)記的核苷酸或可檢測(cè)的部分包含例如，但不限于熒光染料，像熒光素、羅丹明、香豆素和花菁，或淬滅染料，像黑洞粹滅劑(Black Hole Quenchers),如來(lái)自Biosearch Technologies Inc., Novato, CA的BHQ-2。探針可以是如技術(shù)人員已知的例如水解或5’ -核酸酶探針、分子信標(biāo)探針、包含小溝結(jié)合劑的探針或雜交探針等。 [0039]如本文所用，如果在寡核苷酸和目標(biāo)序列之間存在的錯(cuò)配的數(shù)目少于在寡核苷酸和非目標(biāo)序列之間存在的錯(cuò)配的數(shù)目，則寡核苷酸引物或探針是對(duì)于目標(biāo)序列“特異性的”。雜交條件可以選擇為，在該雜交條件下只有存在的錯(cuò)配的數(shù)目不多于在寡核苷酸和非目標(biāo)序列之間存在的錯(cuò)配的數(shù)目，才形成穩(wěn)定的雙鏈體。在該條件下，目標(biāo)特異性寡核苷酸僅能與目標(biāo)序列形成穩(wěn)定的雙鏈體。因此，在適當(dāng)?shù)膰?yán)格雜交條件下目標(biāo)特異性探針的使用使能夠檢測(cè)特異的目標(biāo)序列。類似地，在適當(dāng)?shù)膰?yán)格擴(kuò)增條件下目標(biāo)特異性引物的使用使能夠特異性擴(kuò)增那些包含目標(biāo)引物結(jié)合位點(diǎn)的目標(biāo)序列。
[0040]術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定的聚合酶酶類”指這樣的酶，其對(duì)熱相對(duì)穩(wěn)定并催化三磷酸核苷聚合以形成與目標(biāo)序列的核酸鏈之一互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物。如應(yīng)用于酶的術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定的”，具體指在升高的溫度(如，在55°C或更高)保留其生物活性，或在加熱和冷卻的重復(fù)循環(huán)后保留其生物活性的酶。聚合酶酶類在引物的3’端起始合成并向模板的5’端的方向進(jìn)行直至合成終止。純化的熱穩(wěn)定的聚合酶酶類更充分地描述在如US 4.889.818中，并可商購(gòu)獲得，例如從Roche Diagnostics GmbH/德國(guó)商購(gòu)獲得。
[0041]術(shù)語(yǔ)給定的核酸的“互補(bǔ)物”具體指反向平行的多核苷酸鏈，其意味著與給定的核酸具有相同長(zhǎng)度并精確地互補(bǔ)的核酸。例如序列5’-AGTTC-3’與序列5’-GAACT-3’互補(bǔ)。術(shù)語(yǔ)“完全互補(bǔ)”或“100%互補(bǔ)”等指在反向平行鏈間具有完美的沃森-克里克堿基配對(duì)的互補(bǔ)序列(在多核苷酸雙鏈體中沒(méi)有錯(cuò)配)。但是，互補(bǔ)性不需要是完美的；穩(wěn)定的雙鏈體，例如，可以包含錯(cuò)配的堿基對(duì)或未配對(duì)的堿基。術(shù)語(yǔ)“部分互補(bǔ)性”、“部分互補(bǔ)”、“不完全互補(bǔ)性”或“不完全互補(bǔ)”等指在反向平行的多核苷酸鏈間低于100%完美的任何堿基比對(duì)(例如，在多核苷酸雙鏈體中存在至少一個(gè)錯(cuò)配或未配對(duì)的堿基)。因此，核酸的互補(bǔ)物指單個(gè)唯一定義的序列。
[0042]術(shù)語(yǔ)“可檢測(cè)的”、“標(biāo)記”或“報(bào)告物”以其最寬泛的意義，指可檢測(cè)的，或允許與其相關(guān)聯(lián)的部分或性質(zhì)的檢測(cè)的任何部分或性質(zhì)。例如，包含標(biāo)記的多核苷酸是可檢測(cè)的(并在一些方面稱作為探針)。理想地，標(biāo)記的多核苷酸允許包含多核苷酸的雜交復(fù)合物的檢測(cè)。在一些方面，例如標(biāo)記連接(共價(jià)地或非共價(jià)地)于多核苷酸。在各個(gè)方面，標(biāo)記可以，可替換地或以組合地:(i)提供可檢測(cè)的信號(hào)；(ii)與第二標(biāo)記相互作用以修飾由第二標(biāo)記提供的可檢測(cè)的信號(hào)，例如FRET;(iii)穩(wěn)定化雜交，例如雙鏈體形成；(iv)賦予捕獲功能，例如疏水親和性，抗體/抗原，離子絡(luò)合，或(V)改變物理屬性，例如電泳遷移率、疏水性、親水性、溶解性，或?qū)游鲂袨椤?biāo)記在其結(jié)構(gòu)和其作用機(jī)制方面廣泛地變化。
[0043]標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于,突光標(biāo)記(包括,例如淬滅劑或吸收劑)、非突光標(biāo)記、比色標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、質(zhì)量修飾基團(tuán)、抗體、抗原、生物素、半抗原、酶(包括，例如，過(guò)氧化物酶，磷酸酶等)等。為了進(jìn)一步闡釋，熒光標(biāo)記可以包括帶負(fù)電的染料，例如熒光素家族的染料，或電中性的染料，例如羅丹明家族的染料，或帶正電的染料，例如花菁家族的染料。熒光素家族的染料包括，例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN和Z0E。羅丹明家族的染料包括，例如，德克薩斯紅、ROX、R110、R6G和TAMRA。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE, ROX、R110、R6G 和 TAMRA 是可商購(gòu)獲得的，從例如 Perkin-Elmer, Inc.(Wellesley, MA, USA)商購(gòu)獲得,德克薩斯紅是可商購(gòu)獲得的,從例如Life Technologies(Molecular Probes, Inc.) (Grand Island, NY)商購(gòu)獲得?；ㄝ技易宓娜玖习?例如CY2、CY3、CY5、CY5.5 和 CY7,并且是可商購(gòu)獲得的，從例如 GE Healthcare Life Sciences(Piscataway, NJ, USA)商購(gòu)獲得。
[0044]術(shù)語(yǔ)“DNA結(jié)合染料”或“DNA插入染料”指能結(jié)合到雙鏈核酸并在結(jié)合后發(fā)射熒光信號(hào)的染料分子，例如可從Life Technologies (Grand Island，NY)獲得的SYBRGREENI 和 SYBRGOLD 或來(lái)自 Roche Diagnostics (德國(guó))的 Lightcycler 480 Resolight0
[0045]術(shù)語(yǔ)“FRET” (熒光共振能量轉(zhuǎn)移)和等效術(shù)語(yǔ)通常指兩種染料分子的電子狀態(tài)間動(dòng)態(tài)的距離依賴性的相互作用，其中能量從供體分子轉(zhuǎn)移到受體分子而沒(méi)有從供體分子發(fā)射光子。FRET的效率取決于染料間分子間間隔的倒數(shù)，使在與生物大分子尺度相容的范圍內(nèi)有效。通常，F(xiàn)RET允許共定位分子或單分子內(nèi)構(gòu)象變化的成像、動(dòng)力學(xué)分析和/或定量，并具有超過(guò)傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡限制的空間分辨率。通常，F(xiàn)RET需要，(a)供體和受體分子必須非常接近(典型地，如10-100 A)，(b)受體的吸收譜必須與供體的熒光發(fā)射譜重疊，并且(c)供體和受體躍遷偶極取向必須大致平行。
[0046]在大多數(shù)FRET應(yīng)用中，供體和受體染料是不同的，在這種情況下FRET可以通過(guò)受體的敏化熒光的出現(xiàn)或通過(guò)供體熒光的淬滅來(lái)檢測(cè)。在一些情況下，供體和受體是相同的，并且FRET可以通過(guò)所獲得的熒光去極化來(lái)檢測(cè)。單供體/受體分子在FRET系統(tǒng)中的使用描述于例如，Packard 和 Komoriya 的 US 7.312.302 中。
`[0047]FRET已變?yōu)橹匾夹g(shù)，用于研究多種表征為分子接近性的變化的生物學(xué)現(xiàn)象。FRET技術(shù)現(xiàn)在普遍存在于很多生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，并且已適合于在很多生物學(xué)系統(tǒng)中使用，包括但不限于，核酸雜交的檢測(cè)、實(shí)時(shí)PCR測(cè)定和SNP檢測(cè)、蛋白結(jié)構(gòu)和構(gòu)象、蛋白復(fù)合物的空間分布和組裝、受體/配體相互作用、免疫測(cè)定、探測(cè)單分子相互作用、核酸結(jié)構(gòu)和構(gòu)象、用于檢測(cè)突變的引物延伸測(cè)定、自動(dòng)DNA測(cè)序、脂質(zhì)分布和轉(zhuǎn)運(yùn)、膜融合測(cè)定(膜融合的脂質(zhì)-混合測(cè)定)、膜電位檢測(cè)、突光蛋白酶底物(fluorogenic protease substrates)和用于環(huán)化AMP和鋅的指示劑。
[0048]術(shù)語(yǔ)“水解探針”或“ 5’ -核酸酶探針”表示用于根據(jù)本發(fā)明的大多數(shù)應(yīng)用并用于PCR反應(yīng)中(即在C0BAS? TaqMan?系統(tǒng)上)的探針。這些水解或5’-核酸酶探針由單鏈雜交探針組成，其通常用兩種熒光部分標(biāo)記。根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的原理，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)熒光部分由適當(dāng)波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，所吸收的能量轉(zhuǎn)移到第二個(gè)熒光部分。第二個(gè)熒光部分通常是淬滅劑分子，其還可以是非熒光淬滅劑，像BHQ-2。以這種形式使用的典型的熒光染料是例如，F(xiàn)AM、HEX、CY5、JA270、Cyan 500和CY5.5等。在PCR反應(yīng)退火步驟過(guò)程中，標(biāo)記的雜交探針結(jié)合到目標(biāo)核酸(即，擴(kuò)增產(chǎn)物)并在后續(xù)的延長(zhǎng)階段中被TaqDNA聚合酶或如技術(shù)人員已知的另一種合適的聚合酶，例如Z05聚合酶的5’到3’核酸外切酶活性降解。其結(jié)果是，被激發(fā)的熒光部分和淬滅劑部分變得在空間上彼此分離。結(jié)果是，在不存在淬滅劑的情況下激發(fā)第一熒光部分后，可以檢測(cè)到來(lái)自第一熒光部分的熒光發(fā)射。在LightCycIer?和TaqMan?技術(shù)兩種檢測(cè)方式中，發(fā)射信號(hào)的強(qiáng)度都可以與原初目標(biāo)核酸分子的數(shù)目相關(guān)聯(lián)。
[0049]表述“丙型肝炎病毒的類型”指基于其基因組組織(例如，系統(tǒng)發(fā)生分析)的丙型肝炎病毒(HCV)的分類。HCV分離物的分類入特定類型的類別反映其與其它HCV分離物的基因組相關(guān)性，和其與其它HCV分離物的相對(duì)少的相關(guān)性。本文所用的HCV分型命名法與廣泛米用的由 Simmonds 等(2005) “Consensus Proposals for a Unified System ofNomenclature of Hepatitis C Virus Genotypes”，Hepatology 42, N0.4: 962-973 修訂和提出的命名法一致。Simmonds等(2005)的系統(tǒng)將已知HCV分離物分成六(6)種HCV基因型之一，稱為基因型I到6。每個(gè)基因型進(jìn)一步細(xì)分成稱為亞型的分組，其反映相同基因型的毒株之間的相關(guān)性。HCV亞型通過(guò)在基因型后小寫羅馬字母書寫，例如亞型la、亞型lc、亞型6a等。在單個(gè)分離物內(nèi)發(fā)現(xiàn)的基因變體稱為準(zhǔn)種(quasi species)。全世界已知包括所有6種基因型的大約100個(gè)HCV亞型；亞型的數(shù)目不是靜態(tài)的；隨著更多的HCV分離物被研究和測(cè)序，有可能識(shí)別出額外的亞型(以及可能的基因型)。
[0050]術(shù)語(yǔ)“病毒類型”可以指基因型或亞型。注意，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“HCV類型”可以指HCV基因型或HCV亞型。術(shù)語(yǔ)“HCV分型”指將實(shí)驗(yàn)的(例如，未知類型)HCV分配到已知基因型(例如，1、2、3、4、5或6，或其子集)，或?qū)?shí)驗(yàn)的HCV分配到已知亞型(例如，la、lb、lc、2a、2b、2c等，或其子集)。相反，還注意到，如本領(lǐng)域通常使用，術(shù)語(yǔ)“HCV基因分型”最經(jīng)常指將HCV分配到HCV的任何亞型之一，例如，最典型地，la、lb、lc、2a、2b、2c等。但是，如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因分型” 指僅分配到1、2、3、4、5或6。
[0051]術(shù)語(yǔ)“試劑盒”用于指促進(jìn)樣品的處理、方法、測(cè)定、分析或操作的物品的組合。試劑盒可以包含描述如何使用試劑盒的書面說(shuō)明書、方法所需的化學(xué)試劑或酶類、引物和探針，以及任何其它組分。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于使用實(shí)時(shí)(RT)-PCR的“閉管”檢測(cè)的試劑盒。這些試劑盒可以包括，例如，但不限于用于樣品收集的試劑(例如，血樣的收集)、用于RNA和/或DNA的收集和純化的試劑(例如從血液)、用于擴(kuò)增和檢測(cè)的試劑(任選地包括反轉(zhuǎn)錄酶活性)、適用于反轉(zhuǎn)錄和第一鏈和第二鏈cDNA合成以產(chǎn)生一種或多種擴(kuò)增子的引物(但至少一種正向引物和/或一種反向延長(zhǎng)的引物)、尿嘧啶-DNA糖基化酶、熱穩(wěn)定的DNA依賴性的DNA聚合酶和(脫氧核糖)三磷酸核苷。在一些實(shí)施方案中，包含反轉(zhuǎn)錄酶活性和熱穩(wěn)定的DNA依賴性的DNA聚合酶活性的酶是同樣的酶,例如棲熱菌屬種(Thermus sp.) Z05聚合酶或嗜熱鏈球菌{Thermus thermophilus)聚合酶。
[0052]分子生物學(xué)和核酸化學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其在現(xiàn)有技術(shù)內(nèi)，在文獻(xiàn)中被充分解釋，參見，例如，Sambrook Λ$:,
2nd Edition 19S9, Part I X Molecular Cloning A Laboratory Manyal, Cold Spring Harbor
laboratory，Cold Spring Harbor, Mew York; Oligcmuclcotide Synthesis (MJ.Gait, ed.9
19S4); Nucleic Add Hybridization (BH Haines.獅 SJ.Higgins, ed、.19S4);顧
Melhods in Enzyinology (AcacIenik Press:, Inc.)系到。[0053]原則上，所有類型的核酸目標(biāo)都可以使用本發(fā)明方法擴(kuò)增和檢測(cè)。然而，該方法具體應(yīng)用于測(cè)試包含高目標(biāo)的樣品或?qū)φ?，其中通過(guò)在較早的PCR循環(huán)中形成的擴(kuò)增子的聚合，在PCR反應(yīng)中產(chǎn)生高分子量產(chǎn)物。根據(jù)本發(fā)明的高目標(biāo)核酸的實(shí)例是病毒例如人類乳頭狀瘤病毒(HPV)、西尼羅河病毒(WNV)的核酸，或那些用于對(duì)人類免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎(HBV)和/或丙型肝炎(HCV)的存在進(jìn)行的血液捐獻(xiàn)物的常規(guī)篩查的核酸。然而，本發(fā)明的方法也適于細(xì)菌目標(biāo)或腫瘤學(xué)標(biāo)志物的分析等。
[0054]具體而言，丙型肝炎病毒(HCV)感染是正在增長(zhǎng)的世界性的關(guān)注點(diǎn)。HCV感染經(jīng)常是持續(xù)性的，并引起慢性肝病，表現(xiàn)為肝硬化和肝細(xì)胞癌癥。在美國(guó)，HCV是肝臟移植的主要原因。世界范圍內(nèi)，每年報(bào)告大約一百萬(wàn)新的HCV感染，僅在美國(guó)，估計(jì)四百萬(wàn)人被感染并且每年發(fā)生30000例新的感染。
[0055]目前，在美國(guó)每年HCV導(dǎo)致估計(jì)8000到10000例死亡。如果沒(méi)有改進(jìn)的診斷和治療方法的開發(fā)，預(yù)期世界范圍內(nèi)該數(shù)字會(huì)在接下來(lái)的幾年里顯著增加。
[0056]HCV基因組是高度多態(tài)的，并且已經(jīng)表征了很多毒株(稱為基因型和亞型)。不同的病毒類型與不同的疾病結(jié)果和對(duì)治療方案的不同反應(yīng)性相關(guān)。
[0057]HCV基因組結(jié)構(gòu)/組織與黃病毒科(Flaviviridae)的基因組結(jié)構(gòu)/組織最為相似。與大部分黃病毒蛋白的已知功能一致，HCV蛋白的N-末端很可能是結(jié)構(gòu)蛋白(包括C(衣殼/核心)，E1和E2包膜蛋白)，并且C末端非結(jié)構(gòu)蛋白，包括N2 (金屬蛋白酶)、NS3(絲氨酸蛋白酶/螺旋酶)、NS4和NS5 (NS5B RNA聚合酶)被認(rèn)為是在病毒復(fù)制中發(fā)揮作用。
[0058]原型HCV分離物(現(xiàn)在稱為HCV Ia)的表征和鑒定之后，鑒定了(并繼續(xù)鑒定)來(lái)自世界各地的其它分離物。序列比較揭示這些獨(dú)特的分離物可以彼此不同，達(dá)到在HCV基因組的全長(zhǎng)范圍多至35%的核苷酸非同一性的程度(Okamoto等(1992) Virology188:331-341)。在整個(gè)病毒基因組觀察到序列可變性，并有一些區(qū)域顯示比其它區(qū)域更多的可變性。例如，通常在5’-UTR區(qū)觀察到高序列保守性；相反，一些區(qū)域包括包膜(E)區(qū)域，顯示高可變核苷酸序列。
[0059]知道在感染中存在的病毒基因型(和/或亞型)為臨床醫(yī)生提供用于確定對(duì)感染患者的最佳療程的重要指示物。然而，可以區(qū)分日益增加數(shù)目的已知HCV類型的簡(jiǎn)單的診斷方法的開發(fā)已成為挑戰(zhàn)。
[0060]用于擴(kuò)增和檢測(cè)目標(biāo)核酸的本發(fā)明方法，其中目標(biāo)核酸是病毒核酸，優(yōu)選HCV，是優(yōu)選的根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案。
[0061]因此，本發(fā)明提供改進(jìn)的寡核苷酸引物(延長(zhǎng)的引物)，其能夠?qū)Υ嬖谟诖蟛糠制褚阎愋偷腍CV的基因組中的高序列保守區(qū)域，例如5’UTR區(qū)域，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。本發(fā)明還提供了改進(jìn)的寡核苷酸探針，其能夠通過(guò)雜交檢測(cè)HCV核酸。
[0062]本發(fā)明的引物的重要優(yōu)點(diǎn)是它們能夠擴(kuò)增所有HCV類型，而沒(méi)有同時(shí)擴(kuò)增非目標(biāo)序列。因此，所述引物使能夠從源自世界所有區(qū)域的樣品中檢測(cè)HCV的所有類型的HCV檢測(cè)分析成為可能。 [0063]因此，本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是用于擴(kuò)增和檢測(cè)生物樣品中的核酸目標(biāo)，例如HCV的核酸的方法，其中防止或抑制擴(kuò)增過(guò)程中高分子量產(chǎn)物的形成，所述方法包括下列步驟:
a)使所述樣品中的核酸與擴(kuò)增試劑接觸，所述擴(kuò)增試劑至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷單體、用于生成擴(kuò)增子的延長(zhǎng)的正向引物和/或延長(zhǎng)的反向引物，和對(duì)于所述擴(kuò)增子特異性的可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料，其中所述延長(zhǎng)的正向引物是第一 HCV特異性寡核苷酸并且所述反向引物是第二 HCV特異性寡核苷酸，所述引物的至少一種包含添加到所述引物的5’末端并與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列，所述聚N序列由一種類型核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)；
b)在足以使擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生的一段時(shí)間和條件下孵育所述核酸和所述擴(kuò)增試劑；并
c)經(jīng)由所述可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料檢測(cè)所述擴(kuò)增子。
[0064]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述方法包括在5’端包含聚N序列的引物，所述聚N序列包含聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。聚N序列，其包含100%的一種定義的選擇的核苷酸或兩種定義的選擇的核苷酸，像腺苷(A)、胸苷(T)、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)并且總共2到10個(gè)核苷酸。根據(jù)本發(fā)明具體應(yīng)用在長(zhǎng)度上包含4到6個(gè)核苷酸的聚N序列。根據(jù)本發(fā)明最具體使用包含4到6個(gè)連續(xù)腺苷(A)核苷酸的聚N序列。
[0065]根據(jù)本發(fā)明的HCV特異性引物是，例如寡核苷酸，像如下序列的包含聚N的引物:
用作正向引物的《ΙΑΟΛΛΜ;?+*Τ(:ΤΛ?ΧΧΛ+ΙΧΛΧ.ΧΠΤΛ {SEQ IP Μ?; H和用作反向引物的(Α:ΛΛΟ€Λ(；(Χ:ΤΛ?Τ: ACKj<:/\C.jTAt:C:AC:AΛ (SliQ 1Ι> NO:1)。根據(jù)本發(fā)明也可以使用在
3’末端核苷酸進(jìn)一步修飾，例如在腺苷的環(huán)外氨基烷基化的引物。
[0066]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是用于防止或抑制PCR擴(kuò)增過(guò)程中的高分子量產(chǎn)物形成的方法，所述方法包括下列步驟:
a)使生物樣品中的核酸與擴(kuò)增試劑接觸，所述擴(kuò)增試劑至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷單體、用于生成擴(kuò)增子的延長(zhǎng)的正向引物和/或延長(zhǎng)的反向引物和對(duì)于所述擴(kuò)增子特異性的可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料，其中所述延長(zhǎng)的正向引物和所述反向引物均對(duì)所要確定的核酸目標(biāo)，例如HCV是特異性的，所述引物的至少一種包含添加到所述引物的5’末端并與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列，所述聚N序列由一種類型核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)；
b)在足以使擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生的一段時(shí)間和條件下孵育所述核酸和所述擴(kuò)增試劑；并
c)經(jīng)由所述可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料檢測(cè)所述擴(kuò)增子。
[0067]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在5’端包含聚N序列的引物，所述聚N序列包含聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列。根據(jù)本發(fā)明使用以下聚N序列，所述聚N序列包含100%的一種定義的選擇的核苷酸或兩種定義的選擇的核苷酸,像腺苷(A)、胸苷(T)、腺苷-胸苷(AT)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)，并且長(zhǎng)度總共2到10個(gè)核苷酸。根據(jù)本發(fā)明具體應(yīng)用在長(zhǎng)度上包含4到6個(gè)核苷酸的適當(dāng)?shù)木跱序列。根據(jù)本發(fā)明最具體使用包含四到六個(gè)連續(xù)腺苷(A)堿基和/或胸苷(T)堿基的聚N序列。
[0068]根據(jù)本發(fā)明的HCV特異性引物是，例如寡核苷酸，像如下序列的包含聚N的引物:用作正向引物的GCAGAAAGCGTCTAGCXATGGCGTTA CSEQ ID NO: U和用作反向引物的 GCAAGCACCCTATCAGCXAGTACCACAA (SEQ ID NO: 2)。
[0069]具體而言，根據(jù)本發(fā)明使用寡核苷酸引物對(duì)來(lái)擴(kuò)增HCV核酸，其中所述引物對(duì)選自:
ΛΛΛAGCΛΟΛA AGCGTCTAGCCATGGCGTTA ISEQ ID NO: 3)顧
AAAAGCAACICACCCTAI'CAGGCAGTACCACAA (SEQ ID NO； 4),
AAAAAAGCM—;AAAGC:GT(:TA(XX:ATC;GCCnTA {SEQ !O NO: _
AAAAAAGCAAGCACCCI'ATCAGGCAGTACCACAA (SEQ ID NO: 6),
AAAAA A A AGC AGA AAC.CGTCTAGCCATGGCGTTA CSEQ ID NO: 7)和
AAA A A A A AGC A AGC ACCCTATCAGGCAGrF ACXAC AA (SEQ ID MO; 8),.111TG(:AGAAAGCCrrCTAtJCC:ATCiGC:GTTA (SEQ ID NO; 9)顧
WWGC A ACC ACCCT ATC AGGC ACTF ACC AC A A CSEQ III KO; 10),
TnTrrccAGAAAGCGTCliAGCCArFGGCGTTA (StQ ID NO: 11} |l!
TFTITTGC A AGC ACCCT ATC ACGC AGT ACC AC A A (SEQ ID NO: 12),
GGGC；AGAAAGCG1X:TAGClCA-FGGCGTrA (SEQ ID NO: 13)和
CXXXAACXIACICXri'A'fCAGCXAGI'ACCACAA (SEQ ID NO: 14}
ATATGCACiAAAG(:GT€TAGCCATGGC:GTTA (SEQ ID NO； 15)和
ATATGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCAC`AA (SEQ ID NO: 16),
AAAAAACCCACTCTATGTCCGGTC (SEQ ID NO: HI
A A ATGGCGTCTCCC ACCiCGCCTGG (SEQ ID NO: 20),
ATATATGTACGCCGGAATTGiXGGAAA (SEQ ID NO; 21)和
ATATATCTTTCCCCAGGACCTGCCGGT (SEQ ID NO: 22),
和任何所述正向引物(SEQ ID NO: 1、3、5、7、9、11、13、15、19或21)與任何反向引物(SEQ ID NO: 2、4、6、8、10、12、14、16、20或22)的任何組合。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，一種或多種額外引物可以添加到要使用于HCV擴(kuò)增的引物對(duì)，具體而言第二目標(biāo)特異性反向引物，例如序列 CTCGCAAGCACCCTATCAGGCAGT (SEQ ID NO: 32)。
[0070] 具體而言，根據(jù)本發(fā)明使用至少由引物SEQ ID NO:1和引物SEQ ID NO: 2、引物SEQ ID NO: 3 和引物 SEQ ID NO: 4、引物 SEQ ID NO: 5 和引物 SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10或引物SEQ ID NO: 15和引物SEQ ID NO: 16組成的引物對(duì)。并且，具體而言，根據(jù)本發(fā)明使用由引物SEQ ID NO:1與引物SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 32，引物SEQ ID NO: 3 與引物 SEQ ID NO: 4 和 SEQ ID NO: 32，引物 SEQ ID NO: 5 與引物 SEQ IDNO: 6和 SEQ ID NO: 32，引物SEQ ID NO: 9 與引物SEQ ID NO: 10和 SEQ ID NO: 32，或引物SEQ ID NO: 15與引物SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 32組成的引物組。根據(jù)本發(fā)明使用的另一對(duì)5’ -聚N延長(zhǎng)的引物包括以下序列的包含聚N的引物:AAACCCACTCTATGTCCGGTC(SEQ ID NO:23)和 TGGCGTCTCCCACGCGGCTGG (SEQ ID NO:24)。根據(jù)本發(fā)明使用的又一對(duì)5’ -聚N延長(zhǎng)的引物包括以下序列的包含聚N的引物:GTACGCCGGAATTGCCGGAAA (SEQ IDNO:25)和CTTTCCCCAGGACCTGCCGGT (SEQ ID NO:26)。根據(jù)本發(fā)明的引物對(duì)可以包括至少一個(gè)額外引物，具體而言第二目標(biāo)特異性反向引物。引物可以在3’-末端區(qū)域包含修飾的核苷酸，例如烷基化的核苷酸，像N4-乙基-dC、N6-甲基-dA、N4-叔丁基苯甲基_dC和N6-叔丁基苯甲基-dA以及2’-O-甲基-dU等。
[0071]本發(fā)明的寡核苷酸探針雜交到HCV基因組的區(qū)域，該區(qū)域包含在使用本發(fā)明引物擴(kuò)增的區(qū)域內(nèi)。探針能夠在單組雜交條件下特異性檢測(cè)來(lái)自所有類型的HCV核酸。當(dāng)用于檢測(cè)用本發(fā)明的引物擴(kuò)增的HCV核酸時(shí)，探針的特異性進(jìn)一步增加HCV檢測(cè)的特異性，由此將假陽(yáng)性的可能性減少到最小。
[0072]在一個(gè)實(shí)施方案中本發(fā)明提供了用于檢測(cè)HCV核酸的寡核苷酸探針，其中所述寡核苷酸探針包括HCV特異性核酸序列、可檢測(cè)標(biāo)記，例如熒光部分和任選地淬滅部分。根據(jù)本發(fā)明的探針可以，例如由下述組成:子序列FCGGAATTGCCAGGACGACCGGP (SEQID NO: 27)或其互補(bǔ)物，其中F是熒光染料如例如6-羧基-熒光素并且P是3’末端磷酸基團(tuán)，或子序列 CGGTGTACTCACCGTTCCGCAGACCACTATGGCTCT (SEQ ID NO: 28)或其互補(bǔ)物，包含花菁家族的熒光染料如例如連接到5’末端的CY5和3’末端磷酸基團(tuán)，或子序列FCGGTGTACTCACCGQTTCCG CAGACC ACTATGP (SEQ ID NO: 29)或其互補(bǔ)物，其中F是熒光染料如例如6-羧基-熒光素，Q是非熒光淬滅劑像BHQ-2并且P是3’末端磷酸基團(tuán)，或子序列GGGCGTGCCCCCGCMGACTGCTAGCCGAGTAG (SEQ ID NO: 30)或其互補(bǔ)物，包含至少熒光染料如例如CY5和/或熒光素，例如FAMjP 3’末端磷酸基團(tuán)。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，探針選自 GGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAG (SEQ ID NO: 30)，包含至少熒光染料如例如CY5 和 / 或熒光素，例如 FAM，和 3’ 末端磷酸基團(tuán)，CGGTGTACTCACCGTTCCGCAGACCACTATGGCTCT (SEQ ID NO: 28)或其互補(bǔ)物，包含至少熒光染料如例如CY5和/或熒光素，例如FAM，和3’ 末端磷酸基團(tuán)，F(xiàn)CGGAATTGCCAGGACGACCGGP (SEQ ID NO: 27)，其中 F 是 6-羧基-熒光素并且 P 是 3’ 末端磷酸基團(tuán)，F(xiàn)CGGTGTACTCACCGQTTCCGCAGACCACTATGP (SEQ ID NO: 29)，其中F是6-羧基-熒光素，Q是BHQ-2并且P是3’末端磷酸基團(tuán)，和這些探針序列各自的互補(bǔ)物。
[0073]根據(jù)本發(fā)明的所有探針序列可以用技術(shù)人員已知的可選的染料標(biāo)記，并可以在寡核苷酸探針的不同位置標(biāo)記。
[0074]本發(fā)明的另一方面涉及用于從所有已知HCV類型擴(kuò)增基因區(qū)域的方法，其包括使用至少本發(fā)明的延長(zhǎng)的正向引物和/或延長(zhǎng)的反向引物進(jìn)行PCR，并使用本發(fā)明的探針或所述探針各自的互補(bǔ)物檢測(cè)擴(kuò)增的DNA。本發(fā)明的引物和探針或所述探針各自的互補(bǔ)物使用于HCV核酸的特異性檢測(cè)的特別簡(jiǎn)單和快速方法成為可能。[0075]本發(fā)明的另一方面涉及用于擴(kuò)增和檢測(cè)HCV核酸的試劑盒，其包含至少兩種本發(fā)明的HCV特異性延長(zhǎng)的擴(kuò)增引物。這些試劑盒可以包括額外的試劑，例如本發(fā)明的探針。所述試劑盒還可以包括一種或多種擴(kuò)增試劑，例如聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶、適配體、緩沖鹽、去垢劑、三磷酸核苷和其它組分，像例如甘油和/或DMS0。
[0076]通常應(yīng)用于根據(jù)本發(fā)明的方法的核酸技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，用于擴(kuò)增核酸的特異性序列的方法，使得對(duì)以先前不可檢測(cè)的低量存在于樣品中的核酸的快速檢測(cè)成為可能(參見US 4.683.195 ；4.683.202和4.965.188)。檢測(cè)擴(kuò)增的核酸的優(yōu)選的方法是通過(guò)與序列特異性寡核苷酸探針雜交(參見Saiki等，1986，Nature 324:163-166)。
[0077]所述檢測(cè)方法可以包括但不限于結(jié)合或插入特異性染料，如溴化乙錠、SYBRGREEN或Lightcycler 480 Resolight，其插入雙鏈DNA并之后改變其熒光。具體而言，檢測(cè)步驟實(shí)時(shí)進(jìn)行。通過(guò)使用可商購(gòu)獲得的實(shí)時(shí)PCR設(shè)備(例如LightCycler?或COBAS? TaqMan?),PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)可以組合在單個(gè)封閉的試管中，并具有顯著減少的循環(huán)時(shí)間(例如 EP O 912 760、EP I 033 411 ；EP O 543 942、EP O 919 565)。由于檢測(cè)與擴(kuò)增同時(shí)發(fā)生，實(shí)時(shí)PCR方法排除對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物操作的需要，并消除擴(kuò)增產(chǎn)物間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)時(shí)PCR大大減少轉(zhuǎn)換時(shí)間并且是在臨床實(shí)驗(yàn)室中對(duì)傳統(tǒng)PCR技術(shù)的有吸引力的替代。作為如在LightCycler?技術(shù)(例如EP O 912 760、EP I 033 411)中使用的實(shí)時(shí)PCR的替代，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選應(yīng)用水解或5’-核酸酶探針技術(shù)。如使用COBAS? TaqMan?實(shí)現(xiàn)的此技術(shù)，利用由兩種熒光部分標(biāo)記的單鏈水解探針。根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的原理，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)熒光部分由適當(dāng)波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，所吸收的能量轉(zhuǎn)移到第二個(gè)熒光部分。第二個(gè)熒光部分通常是淬滅劑分子，其還可以是非熒光淬滅劑，像BHQ-2。以這種形式使用的典型的熒光染料是例如，F(xiàn)AM、HEX、CY5、JA270、Cyan 500和CY5.5等。在PCR反應(yīng)退火步驟過(guò)程中，標(biāo)記的雜交探針結(jié)合到目標(biāo)核酸(即，擴(kuò)增產(chǎn)物)并在后續(xù)的延長(zhǎng)階段中被Taq DNA聚合酶或如技術(shù)人員已知的另一種合適的聚合酶,例如Z05聚合酶的5’到3’核酸外切酶活性降解。其結(jié)果是，被激發(fā)的熒光部分和淬滅劑部分變得在空間上彼此分離。結(jié)果是，在不存在淬滅劑的情況下激發(fā)第一熒光部分后，可以檢測(cè)到來(lái)自第一熒光部分的熒光發(fā)射。在使用LightCycler?和COBAS? TaqMan?分析儀的兩種檢測(cè)方式中，發(fā)射信號(hào)的強(qiáng)度都可以與原初目標(biāo)核酸分子的數(shù)目相關(guān)聯(lián) 。根據(jù)本發(fā)明具體使用水解或5’ -核酸酶探針。
[0078]作為FRET的替代，可以使用雙鏈DNA結(jié)合染料例如熒光DNA結(jié)合染料(例如SYBRGREEN I? 或 SYBRG0LD?，可從 Life Technologies (Molecular Probes)獲得，或Lightcycler 480 Resolight,可從德國(guó) Roche Diagnostics GmbH獲得)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。與雙鏈核酸相互作用后，這些熒光DNA結(jié)合染料在用光在合適的波長(zhǎng)激發(fā)后發(fā)射熒光信號(hào)。雙鏈DNA結(jié)合染料例如核酸插入染料也可以使用(如上述)。當(dāng)使用雙鏈DNA結(jié)合染料時(shí)，通常進(jìn)行解鏈曲線用于驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的存在。
[0079]在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，防止擴(kuò)增產(chǎn)物的遺留污染，例如源自更早的PCR反應(yīng)的擴(kuò)增子和高分子量產(chǎn)物(聚合的擴(kuò)增子)。防止遺留污染的普遍和有效的方式涉及尿嘧啶-DNA糖基化酶，縮寫為“UDG”或“UNG”(EC 3.2.2.3)的使用。這些包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶識(shí)別在單鏈或雙鏈DNA中存在的尿嘧啶并切割尿嘧啶堿基和脫氧核糖之間的N-糖苷鍵，留下無(wú)堿基位點(diǎn)，參見例如US 6.713.294。這些酶很好地降解包含尿嘧啶的小尺寸的擴(kuò)增子，但對(duì)包含尿嘧啶的大尺寸的高分子量產(chǎn)物(聚合的擴(kuò)增子)的效率較低。因此，污染后，高分子量產(chǎn)物可以作為后續(xù)PCR反應(yīng)的目標(biāo)，可能導(dǎo)致在陰性樣品中的假陽(yáng)性測(cè)試結(jié)果或在陽(yáng)性樣品中不準(zhǔn)確的滴度。并且，污染和尿嘧啶-DNA糖基化酶的不完全降解可以導(dǎo)致后續(xù)PCR反應(yīng)中信號(hào)抑制，并從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果或無(wú)效測(cè)試結(jié)果，這是由于聚合的擴(kuò)增子及其多種的引物和探針結(jié)合序列耗盡了引物和探針的混合物。因此，在PCR中防止高分子量產(chǎn)物對(duì)于在目標(biāo)陰性和陽(yáng)性樣品中獲得正確的測(cè)試結(jié)果是至關(guān)重要的。
[0080]然而，用于擴(kuò)增和檢測(cè)生物樣品中的目標(biāo)核酸的本發(fā)明方法具體在存在尿嘧啶-DNA糖基化酶的情況下進(jìn)行。在存在尿嘧啶-DNA糖基化酶的情況下，進(jìn)一步改進(jìn)對(duì)擴(kuò)增過(guò)程中來(lái)自先前的PCR反應(yīng)的污染性高分子量產(chǎn)物的防止和抑制。根據(jù)本發(fā)明具體合適的是組合使用尿嘧啶-DNA糖基化酶和至少一種包含含有多個(gè)腺苷(A)和/或胸苷(T)核苷酸的聚N尾的引物。
[0081]最優(yōu)化用于控制擴(kuò)增反應(yīng)中的遺留污染的尿嘧啶-N-DNA糖基化酶(UNG)的制備已被公開，例如在US 6.187.575中。使用UNG以防止遺留污染也已描述，參見Longo等“Useof uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerasechain reaction” (1990) Gene, 93:125-128。在 US 6.287.823 和 6.518.026 和 US2003/0077637中描述了使用UNG控制遺留污染的現(xiàn)有技術(shù)方法。
[0082]一般來(lái)說(shuō)，此類方法涉及兩個(gè)步驟。首先，PCR測(cè)定必須包括dUTP，從而擴(kuò)增子(其是潛在的遺留污染物)包含尿嘧啶。該方法涉及用dUTP替換擴(kuò)增反應(yīng)中一些或所有的dTTP?？蛇x地(或另外)，一個(gè)或多個(gè)尿嘧啶堿基可以摻入擴(kuò)增引物中。然而應(yīng)當(dāng)注意，如果引物中的尿嘧啶離5’端太近，則該方法在防止后續(xù)擴(kuò)增方面效率較低。dUTP的使用不干擾PCR測(cè)定。含尿嘧啶的擴(kuò)增子產(chǎn)生后，其可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)和分析，盡管存在替換胸腺嘧啶的尿嘧啶。
[0083]接下來(lái)，后續(xù)的PCR添加尿嘧啶-N-DNA糖基化酶。方便地，UNG在包含所有PCR組分的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物中`是有活性的。這使得能夠?qū)NG加入組裝的PCR反應(yīng)中，或甚至PCR預(yù)混物中。在熱循環(huán)開始之前，將反應(yīng)混合物在PCR預(yù)混物的背景下對(duì)UNG活性最優(yōu)的溫度下(約40°C到50°C)或在UNG有活性的溫度范圍內(nèi)孵育。如果存在來(lái)自先前反應(yīng)的包含尿嘧啶的污染物，UNG將切掉尿嘧啶留下無(wú)堿基位點(diǎn)。已知具有無(wú)堿基位點(diǎn)的DNA在高溫在高pH條件下是不穩(wěn)定的。當(dāng)熱循環(huán)開始時(shí)，這些DNA被降解。高溫還使UNG酶失活，允許產(chǎn)生新的包含尿嘧啶的DNA擴(kuò)增子。
[0084]根據(jù)本發(fā)明具體應(yīng)用的是組合使用包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶與引物，所述引物中的至少一種正向引物和/或至少一種反向引物在3’末端包含聚N尾，所述尾包含多個(gè)腺苷(A)和/或胸苷(T)核苷酸并且長(zhǎng)度是2到10個(gè)核苷酸。
[0085]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是用于通過(guò)任何上述方法擴(kuò)增和檢測(cè)生物樣品中的目標(biāo)核酸的試劑盒。所述試劑盒包括至少一種包含DNA聚合酶活性的酶，具體是熱穩(wěn)定的DNA聚合酶、至少一種包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶、任選包含反轉(zhuǎn)錄酶活性的酶、至少四種不同的三磷酸核苷或其它核苷單體、用于產(chǎn)生至少一種擴(kuò)增子的至少一種聚N序列延長(zhǎng)的正向引物和/或至少一種聚N序列延長(zhǎng)的反向引物，其中所述延長(zhǎng)的正向引物和/或延長(zhǎng)的反向引物包含添加到所述引物的5’末端并與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列，所述聚N序列由一種類型核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G);以及至少一種對(duì)于所述擴(kuò)增子特異性的可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料，以及各自的緩沖液。所述試劑盒進(jìn)一步包含用于例如樣品制備的試劑、內(nèi)部對(duì)照、額外引物和探針、適配體、去垢劑和緩沖液組分等。根據(jù)本發(fā)明使用的適配體是短的、單鏈DNA-或RNA-寡核苷酸(25-70個(gè)堿基)，其通過(guò)其3D結(jié)構(gòu)結(jié)合特定分子(即，蛋白，Z05
DNA 聚合酶)(#MWili C.Tuerk.糊 1.Gold; Syittfoifttic evdution of ligands by exponential enrkhim'n1: RNA ligands to
bwcteriophrtgeT^I DKA polymerase, Scienct% volume 1990, p, 505-S10)。
[0086]具體合適的試劑盒是其中所述聚N序列包含長(zhǎng)度為2到10個(gè)核苷酸的聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C、聚G序列的試劑盒。聚N序列可以連接到至少一種引物的5’端并且在使用兩種或更多5’端延長(zhǎng)引物的情況下，可以是相同或不同的。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案是使用在5’端包含相同聚N序列的引物。具體而言，根據(jù)本發(fā)明使用包含四到六個(gè)連續(xù)腺苷㈧堿基的聚N序列。
[0087]【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
圖1:未延長(zhǎng)的參考引物的結(jié)果:在經(jīng)過(guò)60和30到60個(gè)PCR循環(huán)后，在用于高陽(yáng)性對(duì)照(HPC)的PCR反應(yīng)中的高分子量產(chǎn)物(HMWP，聚合的擴(kuò)增子，少或未遷移進(jìn)4%瓊脂糖凝膠)的形成；對(duì)于PCR反應(yīng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析，分析經(jīng)過(guò)60個(gè)循環(huán)后的HPC的12份重復(fù)，或各自經(jīng)過(guò)30、40、50和60個(gè)循環(huán)后的三份重復(fù)；所使用的引物:SEQ ID N0:1和2 (4%瓊脂糖凝膠)。
[0088]圖2:具有2個(gè)G的5’延長(zhǎng)的引物的結(jié)果:經(jīng)過(guò)30、40、50和60個(gè)循環(huán)后，用于高陽(yáng)性對(duì)照的PCR反應(yīng)中的HMWP顯著減少；所使用的引物:SEQ ID NO: 13和14，每個(gè)用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3’端修飾(4%瓊脂糖凝膠)。
[0089]圖3:具有4個(gè)T的5’延長(zhǎng)的引物的結(jié)果:經(jīng)過(guò)30、40、50和60個(gè)循環(huán)后，用于高陽(yáng)性對(duì)照的PCR反應(yīng)中的HMWP顯著減少；所使用的引物:SEQ ID NO: 9和10，每個(gè)用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3’端修飾(4 %瓊脂糖凝膠)。
[0090]圖4:具有4個(gè)A的5’延長(zhǎng)的引物的結(jié)果:經(jīng)過(guò)30、40、50和60個(gè)循環(huán)后，用于高陽(yáng)性對(duì)照的PCR反應(yīng)中無(wú)HMWP ;所使用的引物:SEQ ID N0:3和4，每個(gè)用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3’端修飾(4%瓊脂糖凝膠)。
[0091]圖5:具有6個(gè)A的5’延長(zhǎng)的引物的結(jié)果:經(jīng)過(guò)30、40、50和60個(gè)循環(huán)后，用于高陽(yáng)性對(duì)照的PCR反應(yīng)中無(wú)HMWP ；所使用的引物:SEQ ID NO: 5和6，每個(gè)用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3’端修飾(4%瓊脂糖凝膠)。
[0092]圖6:具有8個(gè)A的5’延長(zhǎng)的引物的結(jié)果:經(jīng)過(guò)30、40、50和60個(gè)循環(huán)后，用于高陽(yáng)性對(duì)照的PCR反應(yīng)中無(wú)HMWP (但輕微形成引物二聚體)；所使用的引物:SEQ ID N0:7和8，每個(gè)用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3’端修飾(4%瓊脂糖凝膠)。
[0093]圖7:具有2個(gè)AT的5’延長(zhǎng)的引物的結(jié)果:經(jīng)過(guò)30、40、50和60個(gè)循環(huán)后，用于高陽(yáng)性對(duì)照的PCR反應(yīng)中無(wú)HMWP ;所使用的引物:SEQ ID NO: 15和16，每個(gè)用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3’端修飾(4%瓊脂糖凝膠)。
[0094]在5’端用三或四種不同堿基延長(zhǎng)的引物(所謂的混合的懸垂變體，例如分別是GACTTA和CTCTAA)的結(jié)果:經(jīng)過(guò)50和60個(gè)PCR循環(huán)后，在用于高陽(yáng)性對(duì)照的PCR反應(yīng)中適度形成HMWP ;經(jīng)過(guò)30、40、50和60個(gè)循環(huán)后，對(duì)PCR反應(yīng)進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析；所用的引物:SEQ ID NO: 17和18，每個(gè)用叔丁基苯甲基(tBu-Bn)在3’端修飾(4%瓊脂糖凝膠)。
實(shí)施例
[0095]所有實(shí)驗(yàn)在等效實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行(即，使用相同的預(yù)混組合物、相同的引物濃度、相同的樣品制備概況、相同的熱循環(huán)概況并且每份凝膠分析相同量的擴(kuò)增子)。從而如下進(jìn)行實(shí)驗(yàn):由根據(jù)本發(fā)明的修飾的引物替換預(yù)混物中的參考引物。除非在圖中另有說(shuō)明，通常以5份重復(fù)測(cè)試HPC，并且PCR循環(huán)在30、40、50、60個(gè)循環(huán)后終止；擴(kuò)增產(chǎn)物在4%瓊脂糖凝膠上分析。
[0096]實(shí)施例1:
樣品材料:
用于實(shí)驗(yàn)的HPC (高陽(yáng)性對(duì)照)由約5E+06 IU/mL的高滴度樣品組成，所述樣品包括在陰性人血漿中被殼的(armored) HCV RNA材料。被殼的RNA由被囊化在MS2細(xì)菌噬菌體外殼蛋白中的非感染性的體外轉(zhuǎn)錄的目標(biāo)區(qū)域的HCV RNA組成(供應(yīng)商即Ambion)，并包含HCV引物和探針結(jié)合區(qū)域。人血漿對(duì)于HCV RNA、HIV-1 RNA和HBV DNA是非反應(yīng)性的。如果使用高滴度陽(yáng)性HCV患者樣品也獲得類似結(jié)果。
[0097]核酸提取
對(duì)于核酸提取，每個(gè)反應(yīng)使用ImL樣品材料。除非在圖中另有說(shuō)明，通常每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件測(cè)試樣品材 料的5份重復(fù)。核酸提取方法是現(xiàn)有技術(shù)并且為技術(shù)人員所知
(參見_細(xì) Sanibrook 等,2nd Edition 1989, Part 1^3, Molecular
CIO ni ιιι? A Labowtory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New
York; Oligonucleotide Syiithciii(M.J.Gait, ed., 1984》?？蛇x地,可以使用可商購(gòu)獲得的核
酸提取試劑盒，即高純度病毒核酸試劑盒(Roche Diagnostics)或C0BAS? AmpliPrep總核酸分離試劑盒(TNAI) (Roche Diagnostics)。
[0098]在此處所述實(shí)驗(yàn)中，核酸提取基于C0BAS? AmpliPrep總核酸分離試劑盒(TNAI)(Roche Diagnostics)。樣本制備試劑由磁性玻璃顆粒懸浮物、裂解試劑、蛋白酶試劑、洗脫緩沖液和清洗試劑組成。在核提取前將定量標(biāo)準(zhǔn)品RNA加入樣本。通過(guò)與蛋白酶和離液裂解/結(jié)合緩沖液(其釋放核酸并保護(hù)所釋放的HCV RNA免于血清或血漿中的RNA酶)一起孵育裂解被殼的HCV顆粒和定量標(biāo)準(zhǔn)品RNA被殼的顆粒。隨后，HCV RNA和定量標(biāo)準(zhǔn)品RNA結(jié)合到磁性玻璃顆粒上。未結(jié)合的物質(zhì)例如鹽、蛋白和其它細(xì)胞雜質(zhì)通過(guò)清洗磁性顆粒去除。吸收的核酸在升高的溫度下用水緩沖液洗脫。
[0099]PCR反應(yīng)混合物
由根據(jù)本發(fā)明的修飾的引物替換預(yù)混物中的參考引物。以大批次制備不含正向引物和反向引物的預(yù)混物。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，用如圖1-8中所規(guī)定的延長(zhǎng)的引物或參考引物補(bǔ)充此不完全的預(yù)混物。
[0100]表1:預(yù)混物組合物
【權(quán)利要求】
1.用于擴(kuò)增和檢測(cè)樣品中的核酸目標(biāo)的方法，其中防止或抑制擴(kuò)增過(guò)程中高分子量產(chǎn)物的形成，所述方法包括下列步驟: a)使所述樣品中的核酸與擴(kuò)增試劑接觸，所述擴(kuò)增試劑至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷單體、用于產(chǎn)生至少一種擴(kuò)增子的至少一種延長(zhǎng)的正向引物和/或至少一種延長(zhǎng)的反向引物，和至少一種對(duì)于所述擴(kuò)增子特異性的可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料，其中所述延長(zhǎng)的正向引物和/或反向引物的至少一種包含添加到所述引物的5’末端的與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列，所述聚N序列由一種類型的核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷㈧、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)； b)將所述核酸與所述擴(kuò)增試劑在足以使擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生的條件下孵育一段時(shí)間，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)在50個(gè)循環(huán)之前不終止；和 c)經(jīng)由所述可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料檢測(cè)所述擴(kuò)增子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述聚N序列由聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列或其混合物組成，并且長(zhǎng)度為2到10個(gè)核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述聚N序列在長(zhǎng)度上由4到6個(gè)核苷酸組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述目標(biāo)核酸是病毒核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述病毒核酸是HCV的核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟b)在存在包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶的情況下進(jìn)行。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6的方法，其中所述添加到所述引物5’末端的與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列由一種類型的核苷酸或兩種不同核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)或胸苷(T)，并且孵育步驟b)在存在包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶的情況下進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的方法，其中至少一種所述延長(zhǎng)的正向引物包括下列的序列之
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的方法，其中至少一種所述可檢測(cè)的探針包括下列的序列之一: (SEQ ID NO:27), (SEQ ID NO:28), (SEQ ID NO:29), (SEQ ID NO:30)和這些序列各自的互補(bǔ)序列或子序列。
10.用于防止或抑制PCR擴(kuò)增過(guò)程中的高分子量產(chǎn)物形成的方法，所述方法包括下列步驟: a)將樣品中的核酸與擴(kuò)增試劑接觸，所述擴(kuò)增試劑至少包含聚合酶、三磷酸核苷或其它核苷單體、用于產(chǎn)生至少一種擴(kuò)增子的至少一種延長(zhǎng)的正向引物和/或至少一種延長(zhǎng)的反向引物，和對(duì)于所述擴(kuò)增子特異性的至少一種可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料，其中所述延長(zhǎng)的正向引物和/或反向引物包含添加到所述引物的5’末端的與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列，所述聚N序列由一種類型的核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)； b)將所述核酸與所述擴(kuò)增試劑在足`以使擴(kuò)增反應(yīng)發(fā)生的條件下孵育一段時(shí)間，其中所述擴(kuò)增反應(yīng)在50個(gè)循環(huán)之前不終止；和 c)經(jīng)由所述可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料檢測(cè)所述擴(kuò)增子。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述聚N序列由聚A、聚T、聚AT、聚U、聚C或聚G序列或其混合物組成，并且長(zhǎng)度為2到10個(gè)核苷酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的方法，其中所述聚N序列在長(zhǎng)度上由4到6個(gè)核苷酸組成。
13.根據(jù)權(quán)利要求11-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述目標(biāo)核酸是病毒核酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述病毒核酸是HCV的核酸。
15.根據(jù)權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的方法，其中步驟b)在存在包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶的情況下進(jìn)行。
16.根據(jù)權(quán)利要求11-15中任一項(xiàng)的方法，其中至少一種所述延長(zhǎng)的正向引物包括下列的序列之一:
17.根據(jù)權(quán)利要求11-16中任一項(xiàng)的方法，其中至少一種所述可檢測(cè)的探針包括下列的序列之一:
(SEQ ID NO:27), (SEQ ID NO:28), (SEQ ID NO:29), (SEQ ID NO:30)和這些序列各自的互補(bǔ)序列或子序列。
18.至少一種延長(zhǎng)的正向引物和/或至少一種延長(zhǎng)的反向引物在用于防止或抑制PCR擴(kuò)增過(guò)程中的高分子量產(chǎn)物形成中的用途，所述至少一種延長(zhǎng)的正向引物和/或至少一種延長(zhǎng)的反向引物各自包含添加到各引物的5’末端的聚N序列，所述聚N序列由一種類型的核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)，所述PCR擴(kuò)增在50個(gè)循環(huán)前不終止。
19.用于擴(kuò)增和檢測(cè)樣品中的目標(biāo)核酸的試劑盒，其中防止或抑制擴(kuò)增過(guò)程中高分子量產(chǎn)物的形成，所述試劑盒包括: (a)至少一種包含DNA聚合酶活性的酶， (b)至少一種包含尿嘧啶-DNA糖基化酶活性的酶，(c)三磷酸核苷或其它核苷單體， (d)用于產(chǎn)生至少一種擴(kuò)增子的至少一種延長(zhǎng)的正向引物和/或至少一種延長(zhǎng)的反向引物，和 (e)至 少一種對(duì)于所述擴(kuò)增子特異性的可檢測(cè)的探針或DNA結(jié)合染料， 其中所述延長(zhǎng)的正向引物和/或反向引物的至少一種包含添加到所述引物的5’末端的與目標(biāo)序列不互補(bǔ)的聚N序列，所述聚N序列由一種類型的核苷酸或兩種不同的核苷酸組成，所述核苷酸衍生自腺苷(A)、胸苷(T)、尿苷(U)、胞苷(C)或鳥苷(G)，并且長(zhǎng)度為4到10個(gè)核苷酸。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103773841SQ201310492172
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月18日
【發(fā)明者】R.巴比爾, F.貝格曼, D.西茨曼 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司