專(zhuān)利名稱(chēng)：低溫失活的工業(yè)用面包酵母的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種研制具有Lti特性的工業(yè)用面包酵母菌株的方法，根據(jù)本發(fā)明方法研制的酵母菌株，所說(shuō)菌株在制備烤制用生面團(tuán)中的應(yīng)用，制備含有這些酵母菌株之一的冷卻烤制用生面團(tuán)的方法以及根據(jù)本發(fā)明方法制備的烤制用生面團(tuán)。
已知用酵母發(fā)酵的烤制用生面團(tuán)的口味和質(zhì)地比用化學(xué)試劑發(fā)酵的生面團(tuán)有許多優(yōu)點(diǎn)。商業(yè)上銷(xiāo)售的面包房產(chǎn)品也是已知的。例如制作面包卷和croissants的生面團(tuán)，這些產(chǎn)品在發(fā)酵和焙烤前打算保存在冰箱中，不過(guò)它們含有化學(xué)發(fā)酵劑。
相應(yīng)地，EP0,487,878描述了具有Lti特性的作為發(fā)酵劑的酵母菌株在制備制面包產(chǎn)品(其在冷藏后放在爐子中烘烤)中的應(yīng)用，換句話(huà)說(shuō)Lti特性是在冷藏期間活性非常低但在這些溫度下能存活的特性(Lti是英語(yǔ)表達(dá)“低溫失活”的首字母縮略詞)。然而這些酵母太旺盛，即是說(shuō)在稍高的冷卻溫度即8-12℃之間，或甚至于14℃時(shí)釋放太多的氣體，事實(shí)上，有時(shí)在通常的工業(yè)貯存冷藏產(chǎn)品條件下過(guò)長(zhǎng)時(shí)間后普遍能觀察到這種現(xiàn)象。這種活力尤其應(yīng)歸因子這些菌株中MAL等位基因的存在，該等位基因是活化的并且不受分解代謝途徑的阻遏，而且這種活力還歸因于未足夠選擇這些菌株的Lti特性。最終，這些酵母就不能最佳地順利地響應(yīng)其工業(yè)生產(chǎn)所需的所有條件，例如良好的干燥性能或高的生長(zhǎng)率。
另外，WO93/01724和EP0,556,905描述了具有與EP0,487,878中所述相似特性的酵母菌株的應(yīng)用。但是，所描述的菌株屬于Lts突變體類(lèi)型(Lts是英語(yǔ)表達(dá)“低溫敏感性”的首字母縮略詞；Singh等人，1974，Genetics 77，651-659)，其通常在冷卻溫度下快速地喪失其生活力。此外，這些酵母適應(yīng)最佳工業(yè)生產(chǎn)及應(yīng)用的能力很差。的確，它們是單倍體和營(yíng)養(yǎng)缺陷型實(shí)驗(yàn)室酵母，其在傳統(tǒng)的工業(yè)用培養(yǎng)基上幾乎不能生長(zhǎng)。此外，與那些工業(yè)用制面包酵母菌株例如“Levure de boulangerie bleue”(LBB)(藍(lán)面包酵母)(Lesaffre，F(xiàn)rance)相比，這些酵母在上述培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)潛力和生產(chǎn)率可能很低。而且，這些菌株的遺傳穩(wěn)定性可能也不足以適應(yīng)其工業(yè)生產(chǎn)。的確在一些生產(chǎn)中有失去Lts特性的危險(xiǎn)。最后，這些菌株幾乎不能在與一種工業(yè)用面包酵母菌株能生存的干燥方式相同的傳統(tǒng)干燥過(guò)程中存活。
WO93/01724還描述了一種制備含有作為發(fā)酵劑的Lts酵母的包裝好的且冷藏過(guò)的烤制用生面團(tuán)的方法。在該方法中，通過(guò)將所說(shuō)酵母至少與面粉和水混合來(lái)制備所說(shuō)生面團(tuán)，然后將該生面團(tuán)放入到一個(gè)容器中并密封，然后在所說(shuō)的生面團(tuán)在保持于冷卻溫度的所述容器中發(fā)酵。從而獲得了含有冷卻生面團(tuán)的密封容器，其中在該容器貯存于低溫的整個(gè)過(guò)程中所述Lts酵母實(shí)際上應(yīng)該是失活的。
但是，由于各種原因該方法不是令人滿(mǎn)意的。首先，在打開(kāi)容器過(guò)程中，由于減壓可觀察到生面團(tuán)快速膨脹。不幸的是，這種膨脹趨于毀壞生面團(tuán)的傳統(tǒng)質(zhì)地。
此外，Lts酵母在稍高冷卻溫度即所說(shuō)的8至12℃或者甚至于14℃溫度下能釋放太多的氣體和氣味，事實(shí)上在工業(yè)貯存冷卻產(chǎn)品的常規(guī)條件下常常能觀察到這種狀況。從而，在貯存幾個(gè)星期以后，該容器的內(nèi)部壓力就可能有引起容器爆炸的危險(xiǎn)。再者，在生面團(tuán)和容器的大氣中存在的氣味的濃度也具有改變生面團(tuán)的傳統(tǒng)嗅味以及感觀質(zhì)量的危險(xiǎn)。
另外，在較低冷卻溫度，即所說(shuō)的最高達(dá)8℃時(shí)，推測(cè)所述酵母沒(méi)有釋放使容器內(nèi)壓力急劇升高的氣體，從而沒(méi)有釋放出氣味。于是，推測(cè)這些氣味主要是在生面團(tuán)發(fā)酵期間產(chǎn)生的，發(fā)酵之后幾乎沒(méi)有氣味產(chǎn)生。相應(yīng)地，由于氣味本性上是不穩(wěn)定的，所以在貯存期間生面團(tuán)也可快速地失去其感觀質(zhì)量。
最終，在生面團(tuán)發(fā)酵期間酵母被高度激活，并且簡(jiǎn)單地通過(guò)將含有這些酵母的生面團(tuán)貯存于冷卻溫度下因而帶來(lái)了酵母易失活的麻煩。的確，此后酵母具有高度活躍的發(fā)酵代謝作用。
因而，在生面團(tuán)的整個(gè)保存期間，促進(jìn)酵母發(fā)酵的氣味特性的出現(xiàn)，但是不要超出一定的濃度是有利的。還能消除由于容器的內(nèi)部壓力而強(qiáng)制產(chǎn)生的限制也是十分有利的。
本發(fā)明的主題是克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，從而提供了一種研制具有Lti特性的工業(yè)用面包酵母菌株的方法，以及一種制備含有所說(shuō)酵母菌株的冷卻的烤制用生面團(tuán)的方法。
為此，在研制具有Lti特性的工業(yè)用面包酵母菌株的方法中，首先將具有Lti特性的單倍體釀酒酵母菌株與至少具有一個(gè)MAL等位基因的單倍體釀酒酵母菌株進(jìn)行雜交，所述等位基因是活化的但受分解代謝抑制，然后在第二階段，將分離的后代雜交，最后，選擇出一種具有Lti表現(xiàn)型，具有一種活化的但受分解代謝抑制的Mal表現(xiàn)型并且具有在分批補(bǔ)料發(fā)酵方法中生長(zhǎng)的潛力的原養(yǎng)型二倍體菌株。
在利備冷藏的包裝好的烤制用生面團(tuán)的方法中，通過(guò)將本發(fā)明的酵母至少與水和面粉混合來(lái)制備所述生面團(tuán)，然后將該生面團(tuán)包裝在具有排氣閥門(mén)的容器中。
詞語(yǔ)“MAL等位基因”在本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中是指一種復(fù)合基因，該基因是編碼三種功能即α-葡糖苷酶、一種透性酶和一種調(diào)節(jié)蛋白的MAL基因族的一部分。詞語(yǔ)“活化的但受分解代謝抑制的MAL等位基因”是指一種MAL等位基因，其功能的表達(dá)是例如受培養(yǎng)基中存在的葡萄糖或蔗糖的抑制(稱(chēng)為誘導(dǎo)型MAL等位基因)，或是指一種MAL等位基因，其能表達(dá)其功能但它的功能本身例如受培養(yǎng)基中存在的葡萄糖或蔗糖的抑制(稱(chēng)為組成型MAL等位基因)。
另外，詞語(yǔ)“生長(zhǎng)潛力”是指由工業(yè)生產(chǎn)上可使用的方法，尤其是由傳統(tǒng)的面包酵母培養(yǎng)方法，已知稱(chēng)之為分批補(bǔ)料法(在通氣條件下將糖溶液慢速地逐漸地加入到一種懸浮液中，以便避免在生物量產(chǎn)生期間形成乙醇并且達(dá)到最大產(chǎn)量)培養(yǎng)時(shí)具有高產(chǎn)量及高生產(chǎn)率的能力。
此外，術(shù)語(yǔ)“原養(yǎng)型”是指在僅含有碳源，氮源、磷酸鹽或硫，微量元素以及微量維生素的培養(yǎng)基上繁殖的酵母。該培養(yǎng)基也稱(chēng)為“基本培養(yǎng)基”。
另外，詞語(yǔ)“冷卻溫度”是指所有低于或等于12℃的溫度，在該溫度下生面團(tuán)不會(huì)凍結(jié)。
最后，在其余的描述中，術(shù)語(yǔ)“生面團(tuán)”或“烤制用生面團(tuán)”是指?jìng)鹘y(tǒng)的烤制用生面團(tuán)，例如匹薩(pizza)生面團(tuán)，面包生面團(tuán)或croissant生面團(tuán)。特別是這些生面團(tuán)含有至少適當(dāng)量的例如小麥面粉，鹽類(lèi)，油和水。
于是，可以研制具有在冷卻溫度下的生面團(tuán)中失活但存活的特性甚至在更高的溫度，即最高達(dá)18℃下實(shí)際仍失活的特性的出乎意料的Lti面包酵母菌株。
這些面包酵母菌株還具有更適合于工業(yè)上使用的特性。因此這些菌株具有類(lèi)似于或甚至于等同于商品工業(yè)菌株例如LBB酵母的生長(zhǎng)產(chǎn)率。這些菌株還出乎意料地適用于為了其保存目的而進(jìn)行的干燥過(guò)程中，而在再水合后并不以顯著方式失去其活性。最后，還應(yīng)注意到這些菌株與其Lti特性相關(guān)的令人驚奇的遺傳穩(wěn)定性。
最終，使用制備本發(fā)明所述生面團(tuán)的方法，可以避免與容器內(nèi)部壓力相關(guān)的所有缺陷。因而可以使用更具柔韌性的包裝材料。并且，由于酵母的殘留活性(所述酵母在整個(gè)保存期間產(chǎn)生氣味但并未使生面團(tuán)復(fù)活(rise))，還由于貯存期間產(chǎn)生的過(guò)量氣味外溢至包裝之外而改善了生面團(tuán)的口味。
最終，在其貯存期間，生面團(tuán)為氣體所飽和，從而可直接烘烤該生面團(tuán)，因?yàn)樯鎴F(tuán)中氣體的存在足以使之在烘烤時(shí)復(fù)活。從而避開(kāi)了發(fā)酵生面團(tuán)的預(yù)備階段。
為了實(shí)現(xiàn)研制具有Lti特性的酵母菌株的本發(fā)明方法，首先將具有Lti特性的單倍體釀酒酵母菌株與至少具有一個(gè)活化的但受分解代謝抑制的MAL等位基因的單倍體釀酒酵母菌株雜交。
為了達(dá)到該目的，可以選擇一種具有良好Lti特性的單倍體釀酒酵母菌株，所述Lti特性即是在例如3至10℃之間，較好的是在10℃以上時(shí)能失活。
還可以選擇一種含有至少一個(gè)受分解代謝抑制的誘導(dǎo)型MAL等位基因的釀酒酵母菌株，所謂誘導(dǎo)型是指在工業(yè)培養(yǎng)基中栽培的該酵母其組成上并不存在α-葡糖苷酶。的確，這些培養(yǎng)基包含作為主要糖類(lèi)的引起分解代謝抑制作用的糖類(lèi)，例如葡萄糖和/或蔗糖。另一方面，在烤制用生面團(tuán)中，僅當(dāng)酵母已缺失引起分解代謝抑制的糖類(lèi)時(shí)，該酵母才合成α-葡糖苷酶以便于利用生面團(tuán)的麥芽糖。從而可以選擇例如MAL2、MAL3或MAL6等位基因。
此外，受分解代謝抑制的MAL等位基因也是組成型的，即α-葡糖苷酶天然地存在于酵母中，盡管受培養(yǎng)基中存在的葡萄糖或蔗糖的抑制。在烤制用生面團(tuán)中，僅當(dāng)該酵母已缺失引起分解代謝抑制的糖類(lèi)時(shí)該酵母才直接利用生面團(tuán)的麥芽糖。因此可以選擇例如MAL2-8c等位基因。
然后使來(lái)源于首次雜交的二倍體子代在傳統(tǒng)的孢子形成培養(yǎng)基上形成孢子，以獲得單倍體分離子代。在該階段，通過(guò)在包含作為唯一碳源的麥芽糖的培養(yǎng)基，例如YPM-瓊脂培養(yǎng)基(見(jiàn)培養(yǎng)基部分)上培養(yǎng)，可以核驗(yàn)單倍體分離子代的Mal特性。還可以例如通過(guò)在8-10℃的冷卻溫度下在YPD-瓊脂培養(yǎng)基上(見(jiàn)培養(yǎng)基部分)至少培養(yǎng)21天而檢驗(yàn)單倍體分離子代的Lti特性。至少三星期后，根據(jù)沒(méi)有可見(jiàn)的細(xì)胞生長(zhǎng)而鑒定出存活的但仍保持相對(duì)失活狀態(tài)的Lti菌落。事實(shí)上，Lti候選株沒(méi)有可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)相當(dāng)于親代非Lti單倍體菌株充分生長(zhǎng)。
然后，在第二階段，在合適培養(yǎng)基上相對(duì)性別的分離子代進(jìn)行相互雜交。因此可將從相同的首次雜交獲得的分離子代進(jìn)行雜交，或?qū)牟煌氖状坞s交獲得的分離子代進(jìn)行雜交，即是說(shuō)，各自具有可能為不同親本的，以及其親本之一可能是相同的兩個(gè)分離子代進(jìn)行雜交。從而獲得了具有各種各樣特性的大量的二倍體酵母菌株。
例如將二倍體酵母培養(yǎng)于基本培養(yǎng)基上可以檢驗(yàn)其原養(yǎng)型特性。通過(guò)在例如YPM-瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)也可檢驗(yàn)Mal表現(xiàn)型。因而從其親本遺傳了一個(gè)或多個(gè)受分解代謝抑制的MAL基因的酵母可以利用麥芽糖，并且然后由培養(yǎng)基中存在的pH指示劑顯示這一特性。使之在例如合適的培養(yǎng)基上形成孢子也可檢驗(yàn)酵母的二倍體性狀。最后，通過(guò)例如在8℃的冷卻溫度下將其在YPD-瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)21天可檢驗(yàn)二倍體菌株的Lti特性。在這種情況下，Lti菌株在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)非常緩慢。
結(jié)果，在這些二倍體酵母菌株中篩選出一種具有Lti表現(xiàn)型，具有活化的但受分解代謝抑制的Mal表現(xiàn)型以及具有在分批補(bǔ)料方法中的生長(zhǎng)的潛力的原養(yǎng)型菌株。
在該階段，因而可選擇比前面階段所用的更嚴(yán)格更精確的篩選標(biāo)準(zhǔn)。從而可以通過(guò)檢測(cè)菌株在例如8-14℃溫度下幾天之內(nèi)在烤制用生面團(tuán)中產(chǎn)生的CO2量而篩選特定的Lti特性。
也可以根據(jù)其在分批補(bǔ)料方法中的生長(zhǎng)能力來(lái)篩選所說(shuō)的二倍體菌株，即將其培養(yǎng)于要求酵母具有碳源呼吸代謝作用能力的培養(yǎng)基上。
從而通過(guò)使用本發(fā)明研制的方法，可以研制具有顯著Lti特性的酵母菌株。的確，對(duì)MAL基因的抑制使生面團(tuán)中存在的酵母的活性延遲產(chǎn)生，所述生面團(tuán)處于其中所述酵母又具有潛在活性的溫度下。這種延遲作用實(shí)際上可由下列事實(shí)解釋?zhuān)唇湍冈谀軌蚶名溠刻侵氨仨毷紫壤靡鸱纸獯x抑制作用的糖類(lèi)，并且這些糖類(lèi)存在的量不足以確保酵母的最適發(fā)酵活性。
另外，當(dāng)Lti酵母具有誘導(dǎo)性的但受分解代謝抑制的MAL等位基因時(shí)，這種延遲作用甚至更大，因?yàn)槭聦?shí)上當(dāng)酵母已經(jīng)利用了引起分解代謝抑制的糖類(lèi)之后，必須另外合成能具有利用麥芽糖的功能的產(chǎn)物。結(jié)果Lti酵母對(duì)冷藏溫度以上的溫度變化更不敏感。
因此這些酵母可用于制備冷卻保藏以后在爐子上烘烤的面包房產(chǎn)品。
因而可以制備在分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中具有高于0.5克干生物量/每克糖的生長(zhǎng)產(chǎn)率以及在最高達(dá)8℃溫度時(shí)CO2產(chǎn)生量低于7ml/小時(shí)/每kg生面團(tuán)，最高達(dá)12℃時(shí)CO2產(chǎn)生量低于12ml/小時(shí)/每kg生面團(tuán)的工業(yè)用面包房釀酒酵母菌株。該酵母在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后，在最高至18℃時(shí)具有的CO2產(chǎn)生量還低于10ml/每克濃縮酵母。
還可以篩選例如在最高至12℃溫度時(shí)CO2產(chǎn)生量低于3ml/小時(shí)/每kg生面團(tuán)的酵母菌株。
在以上獲得的各個(gè)釀酒酵母菌株中，其中兩個(gè)菌株作為例子，已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定，于94年1月28日保存于NationalCollection of Industrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)，P.O.Box 31，135 Abbey Road，ABERDEEN AB98DG，Scotland(英國(guó))，兩菌株的保藏號(hào)為NCIMB 40611和40612。
菌株NCIMB 40611還有下列特征-形態(tài)學(xué)為大小相對(duì)均勻的橢園形細(xì)胞。
-發(fā)酵特性為能發(fā)酵蔗糖、葡萄糖和麥芽糖的酵母。
同樣，菌株NCIMB 40612具有下列特性-形態(tài)學(xué)為大小相對(duì)均勻的橢園形細(xì)胞。
-發(fā)酵特性為能發(fā)酵蔗糖、葡萄糖和麥芽糖的酵母。
在制備本發(fā)明所述的冷卻的包裝好的烤制用生面團(tuán)的方法中，通過(guò)將本發(fā)明所說(shuō)的一種酵母至少與水和面粉混合制備一種生面團(tuán)，然后將該生面團(tuán)包裝于含有排氣閥門(mén)的容器中。
從而可以在冷藏溫度下混合然后包裝生面團(tuán)。
該容器中的大氣也可由一種惰性氣體如氮?dú)饣蚨趸紗为?dú)組成或由其混合而成。例如通過(guò)抽真空從容器中吸出氧氣，然后注入惰性氣體，隨后密封所說(shuō)容器來(lái)制造所述大氣環(huán)境。這種大氣環(huán)境特別能避免真菌繁殖。
具體地講，還可以將所述酵母與生面團(tuán)混合，所述酵母量為0.1-1％的濃縮或再水化酵母的干物質(zhì)量。
此外，這些酵母可以含有海藻糖。并且可向生面團(tuán)中加入1.2-2％NaCl，以便減少天然生面團(tuán)菌叢的過(guò)分繁殖。
本發(fā)明所述的冷藏生面團(tuán)具有用傳統(tǒng)面包酵母發(fā)酵的并具有上面所述相同組成的生面團(tuán)所特有的質(zhì)地和口味。但是當(dāng)后者在正常冷藏溫度下保存2-60天時(shí)優(yōu)選本發(fā)明的冷藏生面團(tuán)。
下面列舉的實(shí)施例是為了說(shuō)明研制Lti菌株的方法，制備本發(fā)明所述生面團(tuán)的方法，由該研制方法獲得的Lti菌株，以及由本發(fā)明制備方法得到的包裝好的冷藏生面團(tuán)。
除非另有說(shuō)明，所述百分?jǐn)?shù)是指重量百分?jǐn)?shù)。在描述各個(gè)實(shí)施例之前先描述各種試驗(yàn)，各種培養(yǎng)基的組分以及附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明。
試驗(yàn)1.生面團(tuán)中CO2的產(chǎn)生量為了實(shí)施該試驗(yàn)，制備用作為培養(yǎng)基的烤制用生面團(tuán)。該生面團(tuán)包含60.2％面粉，29.2％水，1.4％NaCl，7.2％花生油，以及2％Lti酵母(其中含15％干物質(zhì))。所有成分保存于4℃，并且在4-8℃之間制備該生面團(tuán)。
為此，首先將含30％干物質(zhì)的幾克Lti酵母懸液置于50mlFalcon管中，并加入相同量的水，以得到含15％干物質(zhì)的懸液，然后振蕩整個(gè)試管而制備一種均勻酵母懸液。接著，將上述面粉和鹽混合，然后加入花生油和水，最后加入Lti酵母懸液。最后，拌合該生面團(tuán)，直到不再粘滯，但不要操作過(guò)長(zhǎng)時(shí)間。從而獲得了一種光滑生面團(tuán)。然后取出100克的這種生面團(tuán)轉(zhuǎn)移到Risograph(RDesign，USA)，然后立即檢測(cè)放出的CO2。
首先在8℃每隔1小時(shí)檢測(cè)放出的氣體，共檢測(cè)120小時(shí)。然后將溫度升高到12℃，并每隔1小時(shí)檢測(cè)放出的氣體，共檢測(cè)120小時(shí)。最后，將溫度升高到30℃，并每隔10分鐘檢測(cè)放出的氣體，共檢測(cè)6小時(shí)。然后計(jì)算每一溫度時(shí)氣體形成的起始斜率(ml/h/kg生面團(tuán))而測(cè)出酵母活性。
2.生長(zhǎng)能力該試驗(yàn)?zāi)康氖菫榱撕Y選與工業(yè)用酵母菌株具有相似生長(zhǎng)能力的酵母菌株。
為此，將酵母菌株培養(yǎng)于一種培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基誘導(dǎo)與在分批補(bǔ)料發(fā)酵法中培養(yǎng)的菌株相類(lèi)似的代謝作用。的確，已知在傳統(tǒng)的分批補(bǔ)料發(fā)酵法中，酵母通過(guò)呼吸代謝途徑同化碳源，它們很少積累或不積累乙醇或乙酸鹽，并且它們還能通過(guò)呼吸途徑非?？焖俚貙⒁掖蓟蛞宜猁}再同化。從而通過(guò)將其在需要酵母能完成碳源的呼吸代謝途徑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)而篩選出所需酵母。
為了上述目的，將酵母培養(yǎng)于錐形瓶(含有促進(jìn)培養(yǎng)基通氣的擋板)中，該瓶中裝有包含作為碳源的乙醇和乙酸鹽的YNEA培養(yǎng)基。為了模擬常規(guī)的工業(yè)培養(yǎng)基如含有糖蜜的培養(yǎng)基，加入小量酵母提取物。再者，用琥珀酸鹽和鹽酸將培養(yǎng)基的pH值緩沖到4，以有利于乙酸鹽以其酸形式存在。
在該試驗(yàn)中，將檢測(cè)的酵母于30℃在5ml YPD培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，并在30℃以約190轉(zhuǎn)/分鐘(rpm)的轉(zhuǎn)速攪拌12小時(shí)。然后，將1 ml預(yù)培養(yǎng)物接種到100ml YNE培養(yǎng)基(裝在含有擋板的500ml錐形瓶中)上，并于30℃攪拌(190rpm)培養(yǎng)24小時(shí)。最后，將前面的培養(yǎng)物接種于100ml YNEA培養(yǎng)基(裝于含有擋板的500ml錐形瓶中)，接種量為使培養(yǎng)液OD600接近于0.1，在30℃攪拌培養(yǎng)10小時(shí)，每隔2小時(shí)檢測(cè)OD600。
然后，選擇具有最佳生長(zhǎng)曲線(xiàn)的菌株。從而篩選起始生長(zhǎng)速率至少相當(dāng)于LBB菌株的65％，優(yōu)選接近于或相當(dāng)于對(duì)照LBB菌株的100％的菌株。
3.分批補(bǔ)料培養(yǎng)法的產(chǎn)率在分批補(bǔ)料發(fā)酵的工業(yè)生產(chǎn)條件下培養(yǎng)選出的酵母。
為此，首先將酵母于30℃振蕩培養(yǎng)于各含有400ml YPD培養(yǎng)基的幾個(gè)容器中，然后無(wú)菌條件下將3升前面的培養(yǎng)物接種于含有8升“原糖蜜”培養(yǎng)基(見(jiàn)“培養(yǎng)基”部分)的一個(gè)30升發(fā)酵罐(Chemap，瑞士)。最后，根據(jù)傳統(tǒng)分批補(bǔ)料方法進(jìn)行發(fā)酵，即在30℃攪拌(250-450rpm)及增加通氣量(0.02-0.8m3/小時(shí))的條件下培養(yǎng)24小時(shí)，通過(guò)加入適當(dāng)量的NH4OH而使pH維持在4.5，通過(guò)加入增大量的消沫劑如Contraspum 210(1.5％重量/培養(yǎng)基體積；Binggeli-Chemie，瑞士)而控制所產(chǎn)生的泡沫，并且有規(guī)模地加入適當(dāng)?shù)募哟罅康摹疤敲邸迸囵B(yǎng)基，直至終體積為約22升。
最終，在無(wú)菌條件下將最后發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到一個(gè)300升發(fā)酵罐(Chemap，瑞士)中，并且再進(jìn)行一個(gè)分批補(bǔ)料發(fā)酵階段，即在30℃，攪拌(240-350rpm)和增加通氣量(0.2至10m3/h)條件下培養(yǎng)28小時(shí)，通過(guò)加入適當(dāng)量的NH4OH而使pH維持于4.5，通過(guò)加入增大量的消沫劑如Contraspum(5％重量/體積)而控制產(chǎn)生的泡沫，并且有規(guī)律地在26小時(shí)內(nèi)加入適當(dāng)?shù)脑龃罅康摹疤敲邸迸囵B(yǎng)基，直至終體積為約180升。
在發(fā)酵的最后2小時(shí)內(nèi)，不再進(jìn)一步加入糖蜜；從而降低培養(yǎng)基中殘留的底物量，以避免在冷藏溫度下促進(jìn)酵母生長(zhǎng)的糖類(lèi)的存在。
最后，由此也有利于酵母中海藻糖的形成。該貯存糖對(duì)于在傳統(tǒng)干燥過(guò)程中提高酵母的存活力是十分重要的。
下面表1描述了在30和300升發(fā)酵過(guò)程中作為時(shí)間的函數(shù)所加入的“糖蜜”培養(yǎng)基的量。
表1<
<p>然后將300升發(fā)酵罐培養(yǎng)物冷卻到12℃，之后離心(Westfalia離心機(jī))直至獲得約20％干物質(zhì)，然后將沉淀酵母重懸于水中。然后再將該懸液離心，在這次離心期間用約300-400升無(wú)菌水/100升懸液洗滌該生物質(zhì)(biomass)。
在此階段，可加入維生素C，以便降低生物質(zhì)的氧化。維生素C還具有將pH降至4.4的優(yōu)點(diǎn)。
最后，將生物質(zhì)離心(“De Laval”離心機(jī))以除去雜質(zhì)，直到獲得28％干物質(zhì)。然后擠壓(Bücher壓榨機(jī))所說(shuō)生物質(zhì)直到獲得34-35％干物質(zhì)。從而獲得濃縮的酵母。
然后可測(cè)定酵母的生長(zhǎng)產(chǎn)率。為此，測(cè)定獲得的干生物質(zhì)量，相當(dāng)于發(fā)酵期間加入的糖類(lèi)的量(主要是存在于糖蜜中的蔗糖)。
4.遺傳穩(wěn)定性具有如Lti特性的一種特定特征的酵母菌株的遺傳穩(wěn)定性是該菌株適于工業(yè)化使用的決定性因子。
為了評(píng)估該穩(wěn)定性，對(duì)Lti特性的回復(fù)突變型進(jìn)行研究。為此，用工業(yè)分批補(bǔ)料方法將細(xì)胞培養(yǎng)物中的約108個(gè)細(xì)胞置于含YPD培養(yǎng)基的10個(gè)培養(yǎng)皿上平板培養(yǎng)，將培養(yǎng)皿在8℃培養(yǎng)，然后，檢查約4星期后此溫度下產(chǎn)生的菌落。
5.在一個(gè)溫度梯度下CO2的產(chǎn)生量在為此而特別設(shè)計(jì)的儀器中進(jìn)行該試驗(yàn)，該儀器包括例如具有不同溫度的腔室的溫度梯度裝置，在其中可放入發(fā)酵管的底端。這些管具有封閉和有刻度的上端，以及從側(cè)面分枝出的膨脹瓶。由酵母產(chǎn)生的CO2積累在每個(gè)管的有刻度的上端，被積累的氣體置換的培養(yǎng)基可能進(jìn)入到膨脹瓶中。
為了進(jìn)行該試驗(yàn)，將2ml在YPD培養(yǎng)基上培養(yǎng)過(guò)夜的待測(cè)菌株培養(yǎng)物接種于含200ml的含有0.67％的無(wú)氨基酸氨源(nitrogen base)例如由Difco公司市售的商品名為“無(wú)氨基酸酵母氮源”的產(chǎn)品，如0.5％酵母提取物，2％蔗糖、1％琥珀酸鈉以及調(diào)節(jié)pH至4.5的濃鹽酸的第一種培養(yǎng)基的500ml瓶中。在30℃攪拌培養(yǎng)24小時(shí)。
通過(guò)在20℃以6000gn離心5分鐘來(lái)分離細(xì)胞，并將其懸浮于含200ml的含有0.67％無(wú)氨基酸氮源，0.3％酵母提取物和0.3％蔗糖，1％琥珀酸鈉和為將pH調(diào)至4.5的濃鹽酸的第二種培養(yǎng)基的500ml瓶中。在30℃攪拌培養(yǎng)24小時(shí)。
在4℃，以6000gn離心5分鐘而將細(xì)胞分離，用50ml蒸餾水將所得的沉淀的酵母細(xì)胞洗滌兩次。
將細(xì)胞懸浮于10ml蒸餾水中，并將其轉(zhuǎn)移至有刻度的并預(yù)先稱(chēng)重的15ml聚丙烯管中。在4℃，以3000gn將其離心10分鐘。將試管中水排干，稱(chēng)酵母沉淀物的重量，并將其以每毫升中加入相當(dāng)于具有干物質(zhì)量約27％的0.5克濃縮酵母的0.61克酵母沉淀物的量懸浮到第三種培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有0.67％無(wú)氨基酸氮源，2％麥芽糖，1％琥珀酸鈉和濃鹽酸，以將pH調(diào)到4.5。將0.5-3ml懸液(溫度＞10℃檢測(cè))或1-3ml(溫度＜10℃檢測(cè))懸液加到上面描述的發(fā)酵管中。每個(gè)發(fā)酵管中預(yù)先裝有50ml所述第三種培養(yǎng)基，換句話(huà)說(shuō)，是含有糖蜜的培養(yǎng)基，并將其冷卻到4℃。
在所需溫度以及在上面描述的溫度梯度裝置中培養(yǎng)發(fā)酵管。在將試管放入聲波振蕩浴中幾秒鐘后，在選定的時(shí)間間隔內(nèi)觀察生成的CO2，以便使釋放出的CO2氣泡進(jìn)入液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基除非另有說(shuō)明，給出的化合物的百分?jǐn)?shù)為重量/體積百分?jǐn)?shù)。YPM-瓊脂1％“Difco Bacto酵母提取物”。
2％“Difco Bacto胨”。
2％麥芽糖。
2％“Difco Bacto瓊脂”。
0.9％體積/體積(V/V)的溶解于純乙醇中的0.4％(V/V)Bromcresol Red溶液。YPD 2％“Difco Bacto胨”。
1％“Difco Bacto酵母提取物”。
2％葡萄糖。YPD-瓊脂含有2％“Difco Bacto胨”的YPD。YNE 0.67％“Difco無(wú)氨基酸酵母氮源”。
0.5％“Difco Bacto酵母提取物”。
1％琥珀酸二鈉。
1.12％(V/V)5M HCl。
0.7％(V/V)乙醇。YNEA 加0.3％(V/V)冰醋酸的YNE。前糖蜜 含有前糖蜜培養(yǎng)基的起始分批補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)基，它具有下列組分100kg 的軟化水263g (NH4)2HPO462gMgSO48.6g NaCl
7.82gCaCl217g 肌醇0.84g泛酸鈣0.006g 生物素糖蜜 84.85％無(wú)菌糖蜜(Aarberg，瑞士)。
13.85％水。
1％H2SO4。
按下列方式將糖蜜滅菌。在80℃熱處理30分鐘而誘導(dǎo)污染的孢子繁殖，在室溫使其繁殖20小時(shí)，在125℃滅菌2分鐘。然后冷卻之后離心(Westfalia離心機(jī))分離沉淀。
附1表示對(duì)于菌株NCIMB 40611，40612和Hindelbank面包酵母，100克含有1％濃縮酵母的生面團(tuán)在8℃，12℃和30℃時(shí)產(chǎn)生的CO2含量與時(shí)間的函數(shù)關(guān)系。
圖2和3表示菌株NCIMB 40612(圖2)和“Levure deboulangerie bleue”(藍(lán)面包酵母)(LBB，用于比較，圖3)在含糖蜜培養(yǎng)基上產(chǎn)生的CO2含量與溫度及持續(xù)時(shí)間之間的三維函數(shù)關(guān)系圖。
實(shí)施例1具有Lti特性的單倍體釀酒酵母菌株，例如具有MATα、mal3，lts500基因型的NCIMB 40613菌株用作為起始材料。該菌株按布達(dá)佩斯條約規(guī)定于94年1月28日保藏于National Collection ofIndustrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)，P.O.Box31，135 Abbey Road，ABERDEEN AB98DG，蘇格蘭(英國(guó))。
將該菌株與包含活化的但受分解代謝抑制的并且是誘導(dǎo)型的MAL等位基因的單倍體釀酒酵母菌株，尤其是具有MATa，trp5，ade7，ade1，MAL6基因型的NCIMB 40614菌株進(jìn)行雜交，該菌株已按布達(dá)佩斯條約規(guī)定于94年1月28日保藏于上面描述的保藏機(jī)構(gòu)。
使二倍體酵母形成孢子，分離單倍體的孢子，然后用傳統(tǒng)方法鑒定其性別類(lèi)型，通過(guò)在8℃YPD-Agar培養(yǎng)基上培養(yǎng)鑒別其Lti表現(xiàn)型，在YPM-Agar培養(yǎng)基上培養(yǎng)鑒別其Mal表現(xiàn)型。然后將相反性別的分離子代相互雜交。
然后篩選二倍體原養(yǎng)型酵母菌株。并也在YPM-Agar培養(yǎng)基上培養(yǎng)而檢查Mal表現(xiàn)型。最后，通過(guò)檢測(cè)上面描述的烤制用生面團(tuán)中菌株的CO2產(chǎn)生量而篩選Lti特性，并根據(jù)前面的“生長(zhǎng)潛力”試驗(yàn)培養(yǎng)酵母而檢測(cè)其在分批補(bǔ)料發(fā)酵法中的生長(zhǎng)能力。然后選出起始生長(zhǎng)速率大于對(duì)照LBB菌株65％的菌株。
在由此獲得的各種菌株中，以上面介紹的NCIMB 40611菌株作為舉例進(jìn)行了保藏。
該菌株具有顯著的Lti特性。正如在描述根據(jù)“生面團(tuán)中CO2產(chǎn)生量”試驗(yàn)獲得的結(jié)果的

圖1中所看到的那樣。在3和12℃之間時(shí)該菌株實(shí)際上是失活的。的確，在3-12℃溫度時(shí)它的CO2產(chǎn)生量低于3ml/h/kg生面團(tuán)。還觀察到在30℃時(shí)產(chǎn)生的CO2量快速上升。
此外，在“在溫度梯度下產(chǎn)生的CO2量”試驗(yàn)中獲得的結(jié)果表明在最高至18℃時(shí)在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12天之后，該菌株不釋放任何氣體。
另外，該菌株的起始生長(zhǎng)速率相當(dāng)于LBB酵母的66％，并且在根據(jù)前面描述的檢測(cè)法，該菌株在分批補(bǔ)料方法中的生長(zhǎng)產(chǎn)率相當(dāng)于以同樣方式測(cè)出的LBB菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)率，就是說(shuō)0.5g干生物量/每克糖。
最后，根據(jù)上面描述的對(duì)遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)回復(fù)突變型。因而該菌株實(shí)際上是穩(wěn)定的。
實(shí)施例2以具有Lti特性的單倍體釀酒酵母菌株，例如具有MATα、mal3，lts 500基因型的NCIMB 40613菌株作為起始材料。該菌株已根據(jù)布達(dá)佩斯條約于94年1月28日保藏于National Co1lection ofIndustrial and Marine Bacteria Ltd.(NCIMB)，P.O.Box31，135 Abbey Road，ABERDEEN AB98DG，蘇格蘭(英國(guó))。
將該菌株與包含活化的但受分解代謝抑制并且是組成型的Mal等位基因的單倍體釀酒酵母菌株，尤其是具有MATa，leu2，trp1，ura3，NAL2-8c，MAL3基因型的NCIMB 40615菌株進(jìn)行雜交，NCIMB 40615菌株已按布達(dá)佩斯條約于94年1月28日進(jìn)行保藏。
使雙倍體形成孢子，然后將分離子代雜交，按與實(shí)施例1同樣的方式篩選菌株。
在由此獲得的各個(gè)菌株中，作為舉例寄存了上面介紹的NCIMB40612菌株。
正如在描述根據(jù)“生面團(tuán)中產(chǎn)生的CO2量”試驗(yàn)中獲得的結(jié)果的圖1中所看出的那樣，實(shí)際上在3至12℃之間時(shí)該菌株是失活的。的確，在3-8℃溫度時(shí)其CO2產(chǎn)生量低于7ml/h/kg生面團(tuán)。在至少12℃時(shí)CO2產(chǎn)生量低于12ml/h/kg生面團(tuán)，并且還觀察到在30℃時(shí)產(chǎn)生的CO2含量快速上升。
此外，正如在描述由“在溫度梯度下CO2生成量”試驗(yàn)獲得的結(jié)果的圖2中所看到的那樣，該菌株還在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天之后，在最高至18℃時(shí)其CO2的生成量為每克濃縮酵母低于10ml。作為比較，還將對(duì)照LBB菌株也進(jìn)行了該試驗(yàn)(圖3)。
另外，該菌株的起始生長(zhǎng)速率相當(dāng)于LBB酵母的90％，并且根據(jù)前面描述的試驗(yàn)其在分批補(bǔ)料方法中的生長(zhǎng)產(chǎn)率相當(dāng)于按同樣方法測(cè)出的LBB菌株的生長(zhǎng)產(chǎn)率，即每克培養(yǎng)基中產(chǎn)生0.5g干生物量最后，根據(jù)上面描述的遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)試驗(yàn)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)回復(fù)突變型。因而該菌株實(shí)際上是穩(wěn)定的。
實(shí)施例3按下面方式將Lti面包酵母干燥以便能夠以粉末形式將其保存較長(zhǎng)時(shí)間。使用包含約20％干物質(zhì)并且經(jīng)離心和洗滌過(guò)的NCIMB40612菌株的培養(yǎng)物。然后例如按美國(guó)專(zhuān)利4,358,250中描述的傳統(tǒng)方法將酵母干燥。從而獲得了包含96％干物質(zhì)的干酵母粉。
然后按下面方式將這些酵母再水合。在30℃將10％干酵母加到90％水中。然后溫和地混合20分鐘，最后，在4℃加入一定量的水從而獲得了具有所需干物質(zhì)量的酵母懸液。
可以看到經(jīng)脫水，然后再水合的酵母完全保存其發(fā)酵活性。
實(shí)施例4制備包含濃縮酵母菌株NCIMB 40612的冷藏的并經(jīng)包裝好的烤制用生面團(tuán)。為此，按前面描述方法將NCIMB 40612酵母的濃縮的新鮮培養(yǎng)物用于“分批補(bǔ)料培養(yǎng)產(chǎn)率”檢測(cè)試驗(yàn)。然后將一定量的所述濃縮酵母(包含約35％干物質(zhì))與面粉、水、脂肪和鹽混合，從而得到包含0.2％濃縮酵母干物質(zhì)，60％面粉，30％水，8％人造奶油和1.8％NaCl的生面團(tuán)。
然后以與在歐洲專(zhuān)利EP 0,158,590中描述的相同方式將該生面團(tuán)包裝，不同之處在于不能透過(guò)空氣的塑料包裝物包含有一個(gè)排氣閥門(mén)，即是說(shuō)，一個(gè)閥門(mén)允許氣體從包裝物的內(nèi)部溢出到外部，并且阻止空氣從包裝物外界流進(jìn)其內(nèi)部。此外，該包裝物的內(nèi)部大氣還包含50％氮?dú)夂?0％二氧化碳。
實(shí)施例5制備包含再水合的酵母菌株NCIMB 40612的冷藏的并經(jīng)包裝好的烤制用生面團(tuán)。
使用包含10％干物質(zhì)的實(shí)施例3所述的再水合NCIMB 40612酵母懸液。由此制備包含0.3％再水合酵母干物質(zhì)，60％面粉，30％水，8％人造奶油和1.7％NaCl的生面團(tuán)。于是按與實(shí)施例4所述的相同方式包裝該生面團(tuán)。
實(shí)施例6使用在冷藏溫度下保存了一天的實(shí)施例4的生面團(tuán)，然后將該生面團(tuán)在220℃直接烘烤約15分鐘。
另外，以與上述同樣方式分別將冷藏保存7天、28天和60天的實(shí)施例4的生面團(tuán)烘烤。
最后，為了比較，制備具有與實(shí)施例4所述的相同組分的生面團(tuán)，唯一不同之處是加入傳統(tǒng)面包酵母以替代Lti酵母。將該生面團(tuán)在室溫下發(fā)酵45天，然后在與上述同樣條件下烘烤該生面團(tuán)。
三種分別保存了7天、28天和60天的經(jīng)烘烤的生面團(tuán)具有與按上述傳統(tǒng)方式用酵母發(fā)酵的生面團(tuán)非常相似的口味及質(zhì)地。
另一方面，保存了1天的經(jīng)烘烤的生面團(tuán)具有的口味及質(zhì)地與按傳統(tǒng)方法用酵母發(fā)酵的生面團(tuán)有一些差異。這可以用下列事實(shí)解釋?zhuān)诒４娴牡谝惶爝^(guò)程中，Lti酵母還沒(méi)有產(chǎn)生使生面團(tuán)十分相似于傳統(tǒng)生面團(tuán)的足量的氣味和氣體。
權(quán)利要求
1.制備具有Lti特性的面包酵母菌株的方法，其特征在于，首先將具有Lti特性的單倍體釀酒酵母菌株與至少具有一個(gè)活化的但受分解代謝抑制的MAL等位基因的單倍體釀酒酵母菌株進(jìn)行雜交，然后在第二階段，將分離子代進(jìn)行雜交，并且最后，選出具有Lti表現(xiàn)型、活化的但受分解代謝抑制的Mal表現(xiàn)型，和在分批補(bǔ)料方法中具生長(zhǎng)能力的原養(yǎng)型二倍體菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在第二階段，將各自來(lái)自于不同的第一雜交組合的分離子代進(jìn)行雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，在酵母中，活化的但受分解代謝抑制的MAL等位基因可以是組成型的或誘導(dǎo)型的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，為檢測(cè)所要選擇的所述二倍體菌株的Lti特性，將其在3至30℃之間的溫度下檢測(cè)幾天內(nèi)烤制用生面團(tuán)中產(chǎn)生的CO2量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，檢測(cè)所要選擇的所述二倍體菌株在分批補(bǔ)料方法中的生長(zhǎng)能力，是在需要碳源呼吸代謝的一種培養(yǎng)基中進(jìn)行的。
6.工業(yè)用面包酵母菌株釀酒酵母，它在分批補(bǔ)料方法中的生長(zhǎng)產(chǎn)率大于0.5克干生物量/每克糖，在最高達(dá)8℃時(shí)CO2產(chǎn)生量低于7ml/h/kg生面團(tuán)，在最高達(dá)12℃時(shí)CO2產(chǎn)生量低于12m1/h/kg生面團(tuán)，并且在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天后，在最高達(dá)18℃溫度時(shí)CO2產(chǎn)生量還低于10ml/每克濃縮酵母。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的菌株，其特征在于，在最高達(dá)12℃時(shí)它具有低于3ml/h/kg生面團(tuán)的CO2生產(chǎn)量。
8.選自權(quán)利要求6的釀酒酵母菌株NCIMB 40612以及權(quán)利要求7的NCIMB 40611的工業(yè)用面包酵母菌株。
9.權(quán)利要求1-8中任何一項(xiàng)所述的工業(yè)用面包酵母菌株用于制備在冷藏保存后在爐子中烘烤的面包房產(chǎn)品的應(yīng)用。
10.制備經(jīng)冷藏的并經(jīng)包裝好的烤制用生面團(tuán)的方法，其中所述生面團(tuán)制備如下，即通過(guò)將權(quán)利要求1-9中任何一項(xiàng)所述的酵母至少與水和面粉混合，然后將該生面團(tuán)包裝于有排氣閥門(mén)的容器中。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，將所述生面團(tuán)在冷藏溫度下混合并然后進(jìn)行包裝。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，將生面團(tuán)在包含氮?dú)饣蚨趸蓟蚱鋬烧叩幕旌衔锏拇髿庵邪b。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，將酵母以0.1-1％干物質(zhì)量的濃縮或再水合酵母的量與生面團(tuán)混合。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，所述酵母含有海藻糖。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備方法，其特征在于，向所述生面團(tuán)中加入1.2至2％的NaCl。
16.根據(jù)權(quán)利要求10-15中任何一項(xiàng)所述的冷藏的并經(jīng)包裝好的烤制用生面團(tuán)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的烤制用生面團(tuán)，其特征在于，將其于冷藏溫度下保存至少1天。
全文摘要
制備具有Lti特性的面包酵母菌株的方法，其中首先將具有Lti特性的單倍體釀酒酵母菌株與至少具有一個(gè)活化的受分解代謝抑制的MAL等位基因的單倍體釀酒酵母菌株雜交，然后在第二階段，將分離子代進(jìn)行雜交，最后，選出具Lti表現(xiàn)型、活化的但受分解代謝抑制的Mal表現(xiàn)型以及具有在分批補(bǔ)料方法中具生長(zhǎng)能力的原養(yǎng)型二倍體菌株。將所研制的菌株用于一種制備冷藏的經(jīng)包裝好的烤制用生面團(tuán)的方法中，其中將該Lti酵母至少與水和面粉混合，然后將該生面團(tuán)包裝于含有排氣閥門(mén)的容器中。
文檔編號(hào)C12R1/865GK1118007SQ9510249
公開(kāi)日1996年3月6日 申請(qǐng)日期1995年3月16日 優(yōu)先權(quán)日1994年3月16日
發(fā)明者J·巴恩什, C·吉斯勒, P·尼德堡格 申請(qǐng)人:雀巢制品公司