一株用于面包發(fā)酵的耐冷凍酵母菌株及其選育方法
【專利摘要】一株用于面包發(fā)酵的耐冷凍酵母菌株及其選育方法。本發(fā)明提供的酵母菌株為釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)BT-N，保藏號(hào)為CGMCC?No7151。該菌在其它發(fā)酵性能不受影響的情況下，-20℃冷凍21d后細(xì)胞冷凍存活率為92.75％，相對發(fā)酵力為53.24％，與親本菌株(凍存活率為35.36％，相對發(fā)酵力為28.46％)相比，分別增加了57.39％和24.78％。通過敲除面包酵母CICC31616中性海藻糖酶編碼基因NTH1，同時(shí)選用強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1過表達(dá)6-磷酸海藻糖合成酶編碼基因TPS1來實(shí)現(xiàn)。選育得到的酵母菌株對發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般工廠的設(shè)備和條件均可使用，因而有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】一株用于面包發(fā)酵的耐冷凍酵母菌株及其選育方法
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及工業(yè)微生物的育種，尤其是一株用于面包發(fā)酵的耐冷凍酵母菌株及其選育方法。
【背景技術(shù)】:
[0002]冷凍面團(tuán)技術(shù)是面包生產(chǎn)的一種新工藝，是將面包生產(chǎn)中的面團(tuán)制作和烘烤兩個(gè)環(huán)節(jié)相分離的過程。與傳統(tǒng)面包制作法相比，冷凍面團(tuán)法具有生產(chǎn)效率高、面包質(zhì)量穩(wěn)定、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)。但面團(tuán)冷凍時(shí)，溫度一般為18~-20°C，面團(tuán)中的酵母在冷凍、凍藏和解凍過程中都會(huì)受到嚴(yán)重傷害，尤其是發(fā)酵后的面團(tuán)經(jīng)過冷凍工序后，酵母的存活率和產(chǎn)氣能力顯著下降。普通面包酵母凍存20天后，活力下降一半以上，導(dǎo)致解凍后的面團(tuán)膨脹不足，醒發(fā)時(shí)間延長，且成品面包體積小、結(jié)構(gòu)粗糙、口感差，產(chǎn)品質(zhì)量明顯下降。正是這些缺陷的存在，限制了冷凍面團(tuán)技術(shù)的發(fā)展。在我國，對于冷凍面團(tuán)的工藝研究較多，但有關(guān)面包酵母耐冷凍機(jī)制和菌種選育的研究較少，特別是在耐冷凍酵母產(chǎn)品方面還是一個(gè)空白，不僅制約了酵母工業(yè)的發(fā)展，同時(shí)也制約了冷凍面團(tuán)技術(shù)在我國的推廣應(yīng)用。耐冷凍面包酵母的研究是冷凍面團(tuán)技術(shù)在國內(nèi)發(fā)展的潛力所在。
[0003]海藻糖是一種細(xì)胞在應(yīng)對環(huán)境變化而合成的具有高抗性的物質(zhì)，是生物體內(nèi)的一種典型的應(yīng)激代謝物。酵母的耐凍性與前發(fā)酵期開始時(shí)胞內(nèi)海藻糖基本含量相關(guān)，海藻糖能保護(hù)細(xì)胞免受凍傷。目前普遍認(rèn)為，海藻糖是面包酵母耐冷凍性的主要機(jī)制，胞內(nèi)海藻糖含量越高，酵母耐冷凍能越好。增加胞內(nèi)海藻糖含量是提高面包酵母耐冷凍性能的一種重要途徑。
[0004]酵母海藻糖的分解代謝是在兩類海藻糖酶的作用下進(jìn)行的，它們是分別由ATHl基因編碼的酸性海藻糖酶(Athl)和由N THl和NTH2基因編碼的中性海藻糖酶(Nthl和Nth2)。在胞內(nèi)海藻糖的分解代謝中，中性海藻糖酶Nthl起主要作用。海藻糖的合成酶比較復(fù)雜，6磷酸海藻糖合成酶(T6ps)和6磷酸海藻糖磷酸脂酶(T6pp)被認(rèn)為是兩個(gè)最重要的合成酶，分別由TPSl和TPS2編碼，其中6磷酸海藻糖合成酶基因TPSl是催化海藻糖合成的關(guān)鍵基因。因此，為了提高面包酵母耐冷凍能力，可通過敲除海藻糖分解酶基因和過表達(dá)海藻糖合成酶基因提高面包酵母胞內(nèi)海藻糖含量以增強(qiáng)細(xì)胞的耐冷凍性能。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]本發(fā)明的目的是提供一株用于面包發(fā)酵的耐冷凍酵母菌株及其選育方法。
[0006]本發(fā)明提供的酵母菌株是具有耐冷凍性能的酵母菌株，具體為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) BTN。該菌株已于2013年I月18日保藏于中國微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào))，保藏號(hào)為 CGMCC N0.7151。
[0007]所述酵母菌株具體可以通過敲除出發(fā)菌株釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的中性海藻糖酶編碼基因的部分或全部序列，并同時(shí)用強(qiáng)啟動(dòng)子過表達(dá)6磷酸海藻糖合成酶編碼基因來實(shí)現(xiàn)。
[0008]本發(fā)明所提供的構(gòu)建上述酵母菌株BT-N的方法是，將PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒得到的重組基因盒(是否多一個(gè)盒字？導(dǎo)入出發(fā)菌株釀酒酵母中通過同源重組獲得重組菌。
[0009]所述的重組質(zhì)粒，是能夠完全敲除釀酒酵母的中性海藻糖編碼基因并同時(shí)過表達(dá)6磷酸海藻糖合成酶編碼基因的重組質(zhì)粒pUC-TNBAK。
[0010]所述中性海藻糖編碼基因?yàn)镹THl基因，所述6-磷酸海藻糖合成酶編碼基因?yàn)門PSl基因。
[0011]所述重組質(zhì)粒上無任何營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記。
[0012]所述中性海藻糖編碼基因NTHl的GeneID為=851564 ；6磷酸海藻糖合成酶編碼基因 TPSl 的 Gene ID 為:852423°[0013]所述酵母菌株在其它發(fā)酵性能不受影響的情況下，在_20°C冷凍21d后的細(xì)胞存活率為92.75 %，相對發(fā)酵力為53.24 %，與出發(fā)菌株(凍存活率為35.36 %，相對發(fā)酵力為28.46% )相比，分別增加了 57.39% 和 24.78%。
[0014]本發(fā)明同時(shí)提供了一種專門用于鑒定所述耐冷凍酵母菌株的基因序列，該基因序列是分別用N-S/K-S和PT-X/N-X2兩對引物以所述耐冷凍酵母菌株基因組為模板擴(kuò)增得到的片段，其序列如序列表1和序列表2所示。
[0015]有益效果:
[0016]一是本發(fā)明選育的酵母菌株所敲除的中性海藻糖編碼基因?yàn)?00%缺失，不易產(chǎn)生回復(fù)突變，同時(shí)過表達(dá)編碼6磷酸海藻糖合成酶基因是通過基因組上整合實(shí)現(xiàn)的，不易在菌株傳代中丟失，并且重組菌株中的KanMX抗性基因已經(jīng)敲除，保證了菌株及發(fā)酵產(chǎn)品的安全性；二是本發(fā)明選育的酵母菌株不僅部分切斷海藻糖分解途徑，而且提高了海藻糖合成能力，能夠提高酵母胞內(nèi)海藻糖含量從而增強(qiáng)其耐冷凍性能，而其它發(fā)酵性能沒有明顯變化。發(fā)明選育的酵母菌株對發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般工廠的設(shè)備和條件均可使用，因而有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0017]圖1是重組菌株構(gòu)建的技術(shù)路線圖。
[0018]圖2是pUC-NBAK質(zhì)粒構(gòu)建過程。
[0019]圖3是pUC-TNBAK質(zhì)粒構(gòu)建過程。
[0020]圖4是重組片段與基因組的重組過程。
【具體實(shí)施方式】:
[0021]下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022]實(shí)施例1:耐冷凍酵母菌株的選育
[0023](I)重組菌株的構(gòu)建[0024]重組菌株的構(gòu)建流程如圖1所示。雙倍體出發(fā)菌株CICC31616經(jīng)過單倍體化生成a型和α型單倍體菌株70a和17 α，通過兩次同源重組的方法構(gòu)建重組單倍體菌株，去除KanMX抗性基因并雜交該單倍體菌株，生成雙倍體重組菌株ΒΤ-Ν。
[0025]重組質(zhì)粒pUC-TNBAK的構(gòu)建流程如圖2和圖3所示。通過PCR擴(kuò)增技術(shù)，將NTHl基因兩側(cè)用于同源重組敲除該基因的序列NA和NB片段及來自pUG6質(zhì)粒的KanMX抗性基因擴(kuò)增，并以PUC19質(zhì)粒為載體將這三個(gè)片段按照NA-KanMX-NB的順序連接，得到pUC-NBAK質(zhì)粒；TPS1基因與含有強(qiáng)啟動(dòng)子的pUC-PGK連接，所得到的PGKp-TPS1-PGKt(PT)片段與上述質(zhì)粒按照NA-KanMX-PT-NB的順序連接，構(gòu)建pUC-TNBAK重組質(zhì)粒。
[0026]TNBAK重組過程如圖4所示。以質(zhì)粒pUC-TNBAK為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到NA-KanMX-PT-NB重組基因盒。通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化重組基因盒轉(zhuǎn)入酵母單倍體細(xì)胞，通過NA和NB片段與酵母染色體上NTHl基因兩側(cè)的同源序列同源重組，從而整合到酵母染色體上并隨染色體一起復(fù)制。轉(zhuǎn)化后通過G418抗性篩選重組子，KanMX-PT片段同源重組替換了酵母染色體上的NTHl基因，從而實(shí)現(xiàn)NTHl基因的完全敲除同時(shí)利用強(qiáng)啟動(dòng)子PGKl過表達(dá)TPSl。
[0027]利用同源重組的方法分別敲除酵母CICC31616的a型和α型單倍體菌株70a和17 α的葡萄糖阻遏因子編碼基因ΝΤΗ1，并同時(shí)過表達(dá)6磷酸海藻糖合成酶編碼基因TPS1，得到a型和α型單倍體重組菌株ΛΝ+TPSla和ΛΝ+TPSla。將單倍體重組菌株中的抗性基因KanMX去除，并雜交獲得雙倍體重組菌株ΒΤ-Ν。
[0028]所述出發(fā)菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)CICC31616。
[0029](2)基因工程菌株的特異性序列
[0030]獲得的基因工程菌株BT-N染色體中含有兩段特異性序列，可通過PCR擴(kuò)增測序后進(jìn)行菌株鑒定。
[0031]特異性片段擴(kuò)增的引物序列為:
[0032]N-S:5，-ATCATCATCTGTAATCGCTTCACC-3’
[0033]K-S:5’ -CCTTTTATATTTCTCTACAGGGGCG-3’
[0034]PT-X:5’ -TTTTCTCTTTCCCCATCCTTTACGC-3’
[0035]N-X2:5’ -TCAGAATGTATGTCCATGATTCGCC-3’
[0036]PCR擴(kuò)增得到的兩段特異性片段的DNA序列見序列表1和序列表2。
[0037]實(shí)施例2:耐冷凍酵母菌株發(fā)酵實(shí)驗(yàn)
[0038](I)轉(zhuǎn)化子與單倍體親本的耐冷凍實(shí)驗(yàn)
[0039]將單倍體親本70a和17 α及其對應(yīng)的重組單倍體同時(shí)進(jìn)行液體模擬面團(tuán)培養(yǎng)基冷凍實(shí)驗(yàn)，-20°C冷凍21天后，測定細(xì)胞存活率和相對發(fā)酵力，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，親本70a的胞內(nèi)海藻糖含量為95mg/g，凍存活率為25%，相對發(fā)酵力為23.22%，其重組單倍體的胞內(nèi)海藻糖含量為118mg/g，凍存活率為83.78%，相對發(fā)酵力為47.06%, BP重組單倍體ΛΝ+TPSla比親本70a的胞內(nèi)海藻糖含量增加了 23mg/g，細(xì)胞冷凍存活率增加了 58.78%,相對發(fā)酵力增加了 23.86 %。親本17 α的胞內(nèi)海藻糖含量為155mg/g，凍存活率為44.67%,相對發(fā)酵力為35.47% ;其重組單倍體的胞內(nèi)海藻糖含量為171mg/g，凍存活率為99.23%,相對發(fā)酵力為63.78%，即重組單倍體Λ Ν+TPSla比親本17 a的胞內(nèi)海藻糖含量增加了16mg/g，細(xì)胞冷凍存活率增加了 54.56%，相對發(fā)酵力增加了 28.31%。由結(jié)果看出，NTHl基因完全缺失和6-磷酸海藻糖合成酶的過表達(dá)可增加酵母胞內(nèi)海藻糖含量，減緩冷凍初期海藻糖的分解速率，從而提高酵母的冷凍存活率和相對發(fā)酵力。
[0040]表1單倍體菌株胞內(nèi)海藻糖含量、冷凍存活率及相對發(fā)酵力
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一株用于面包發(fā)酵的耐冷凍酵母菌株，所述菌株為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCN0.Y151。
2.如權(quán)利要求1所述的一株用于面包發(fā)酵的耐冷凍酵母菌株，其特征在于，所述酵母菌種在在_20°C冷凍2Id后的細(xì)胞存活率為92.75%，相對發(fā)酵力為53.24%。
3.如權(quán)利要求1所述的一株用于面包發(fā)酵的耐冷凍酵母菌株的選育方法，其特征在于，所述選育方法是通過敲除出發(fā)菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的中性海藻糖酶編碼基因的部分 或全部序列，并同時(shí)用強(qiáng)啟動(dòng)子過表達(dá)6-磷酸海藻糖合成酶編碼基因來實(shí)現(xiàn)。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK103497903SQ201310040752
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月31日
【發(fā)明者】張翠英, 肖冬光, 董建, 吳鳴月, 孫溪 申請人:天津科技大學(xué)