基于dna文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法及核酸適配體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法及核酸適配體，該方法包括：蛋白磁珠交聯(lián)步驟，將對(duì)照蛋白和靶蛋白分別與磁珠交聯(lián)；第一輪篩選步驟，在初始DNA文庫(kù)溶液中加入靶蛋白磁珠復(fù)合物進(jìn)行第一輪篩選；重復(fù)篩選步驟，將前一輪篩選產(chǎn)物稀釋2~10倍作為下一輪篩選的DNA文庫(kù)溶液進(jìn)行第二至N輪篩選；合成DNA步驟，對(duì)所述最終篩選產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，合成在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)且具有高親和性的DNA序列得所述核酸適配體。本發(fā)明利用低濃度作為篩選條件以篩選出在極低濃度下都能與靶蛋白結(jié)合的高親和力的核酸適配體，大大降低了PCR條件對(duì)篩選過(guò)程的影響，顯著縮短了篩選的時(shí)間，減少了篩選輪數(shù)，提高了篩選的成功率。
【專利說(shuō)明】基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法及核酸適配體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法及核酸適配體。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸適配體是指可與目標(biāo)分子特異性結(jié)合的單鏈的寡核苷酸鏈分子(DNA或RNA), 一般小于IOOmer。與抗體相比，核酸適配體與靶分子之間分子識(shí)別功能與抗體極為相似，但作用的靶分子范圍更廣，包括毒素免疫原性弱和不具有免疫原性的物質(zhì)及能夠識(shí)別單抗不能區(qū)分的相似物質(zhì)，比抗體具有更高的特異性，親和力更高。因其結(jié)構(gòu)和性能的獨(dú)特優(yōu)越性，核酸適配體日益廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究、疾病診治和藥物研發(fā)。
[0003]通常,核酸適配體是通過(guò)指數(shù)級(jí)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolutionof ligands by exponential enrichment, SELEX),篩選得到的。指數(shù)級(jí)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)的基本途徑是將包含大容量的隨機(jī)寡核苷酸序列的DNA文庫(kù)溶液與靶分子共同孵育，并通過(guò)各種分離途徑將結(jié)合復(fù)合物與未結(jié)合序列分離、洗脫、獲得與靶分子結(jié)合的序列并對(duì)這些序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，經(jīng)分離為單鏈后，生成次級(jí)文庫(kù)，再用于下輪篩選，如此數(shù)輪反復(fù)后，挑選出富集的適配體，并進(jìn)行測(cè)序即獲得特異性識(shí)別靶分子的寡核苷酸序列，即核酸適配體。大容量的分子文庫(kù)幾乎涵蓋了所有可能的立體構(gòu)象，理論上可以針對(duì)任何靶分子篩選，得到其特異性識(shí)別的核酸適配體序列。
[0004]目前尚未建立針對(duì)任意靶標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)篩選流程，亦不能保證凡篩選必有效。技術(shù)篩選過(guò)程復(fù)雜、篩選成功率受到眾多影響因素制約。尤其是PCR條件對(duì)SELEX篩選過(guò)程具有明顯的影響，一個(gè)差的PCR條件甚至導(dǎo)致篩選的完全失敗。
[0005]為了得到高親和性結(jié)合的核酸適體，在篩選的過(guò)程中，通常是通過(guò)逐步減少DNA文庫(kù)與靶物質(zhì)孵育的時(shí)間，增加洗滌次數(shù)和洗滌時(shí)間以及與增加對(duì)照物質(zhì)的量及孵育時(shí)間來(lái)增強(qiáng)篩選壓力。然而，DNA適配體與靶物質(zhì)孵育時(shí)，DNA的濃度是影響兩者之間的結(jié)合主要因素之一。但目前的SELEX技術(shù)，在每輪篩選后均采用PCR擴(kuò)增，用較高濃度的DNA文庫(kù)與靶物質(zhì)孵育，未能利用調(diào)控濃度作為提高篩選壓力的主要手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于，針對(duì)現(xiàn)有核酸適配體篩選方法每輪篩選后均采用PCR擴(kuò)增導(dǎo)致技術(shù)篩選過(guò)程復(fù)雜、篩選成功率低的缺陷，提供一種基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法及核酸適配體。
[0007]本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:構(gòu)造一種基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法，包括以下步驟:
[0008]蛋白磁珠交聯(lián)步驟，將對(duì)照蛋白和靶蛋白分別與磁珠交聯(lián)，得到對(duì)照蛋白磁珠復(fù)合物和靶蛋白磁珠復(fù)合物；[0009]第一輪篩選步驟，在初始DNA文庫(kù)溶液中加入所述靶蛋白磁珠復(fù)合物進(jìn)行正篩選并洗脫后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分離為單鏈，得到第一輪篩選產(chǎn)物；
[0010]重復(fù)篩選步驟，將前一輪篩選產(chǎn)物稀釋2~10倍作為下一輪篩選的DNA文庫(kù)溶液，先加入對(duì)照蛋白磁珠復(fù)合物進(jìn)行負(fù)篩，再加入靶蛋白磁珠復(fù)合物進(jìn)行正篩，并在洗脫后得到篩選產(chǎn)物和上清；將每輪篩選產(chǎn)物及上清中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并比較每輪篩選產(chǎn)物和上清中的DNA量是否滿足預(yù)設(shè)要求，是則得到最終篩選產(chǎn)物執(zhí)行合成DNA步驟，否則執(zhí)行重復(fù)篩選步驟進(jìn)行下一輪篩選；
[0011]合成DNA步驟，對(duì)所述最終篩選產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，合成在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)的DNA序列，并經(jīng)檢測(cè)將能與所述靶蛋白特異性結(jié)合并具有高親和力的DNA序列做為該蛋白的核酸適配體。
[0012]在根據(jù)本發(fā)明所述的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中，所述靶蛋白為內(nèi)皮糖蛋白，所述對(duì)照蛋白為牛血清蛋白。
[0013]在根據(jù)本發(fā)明所述的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中，所述第一輪篩選步驟具體包括:
[0014]正篩步驟:取初始DNA文庫(kù)溶液于95°C加熱并置冰上迅速冷卻，加入靶蛋白磁珠復(fù)合物，置于37°C搖床孵育1.5^2.5h，移去上清，用緩沖液洗滌三次；
[0015]文庫(kù)洗脫步驟:加入無(wú)菌水后在95攝氏度加熱15~20分鐘，冰上冷卻，置磁力架3~5分鐘，取上清； [0016]PCR擴(kuò)增步驟:以該上清為模板DNA文庫(kù)溶液，并將該模板DNA文庫(kù)溶液擴(kuò)增16~20個(gè)循環(huán)后，分離單鏈并脫鹽處理，得到第一輪篩選產(chǎn)物。
[0017]在根據(jù)本發(fā)明所述的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中，所述重復(fù)篩選步驟具體包括:
[0018]文庫(kù)的預(yù)處理步驟:將前一輪篩選產(chǎn)物取稀釋2~10倍后做為下一輪篩選的DNA文庫(kù)溶液，在95°C加熱并置冰上迅速冷卻；
[0019]反篩步驟:取對(duì)照蛋白磁珠復(fù)合物3~IOug加入預(yù)處理得到的DNA文庫(kù)溶液中，37°C搖床孵育30分鐘~1.5小時(shí)，置磁力架上收集上清；
[0020]正篩步驟:將反篩得到的上清稀釋，加入靶蛋白磁珠復(fù)合物3~10ug，37°C搖床孵育30分鐘~1.5小時(shí)，移除上清，用緩沖液清洗三次，得DNA靶蛋白磁珠復(fù)合物；
[0021]文庫(kù)洗脫步驟:在DNA靶蛋白磁珠復(fù)合物中加入無(wú)菌水，95攝氏度加熱15~20分鐘，冰上冷卻，置磁力架3~5分鐘，收集上清；重復(fù)用無(wú)菌水洗滌，收集每次的上清混合得到該輪篩選產(chǎn)物。
[0022]本發(fā)明還相應(yīng)提供了一種核酸適配體，采用如上所述的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法制備獲得。
[0023]實(shí)施本發(fā)明的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法及核酸適配體，具有以下有益效果:本發(fā)明利用低濃度作為篩選壓力以篩選出在極低濃度下都能與靶蛋白結(jié)合的高親和力的核酸適配體，大大降低了 PCR條件對(duì)篩選過(guò)程的影響，簡(jiǎn)化了整個(gè)篩選過(guò)程，顯著縮短了篩選的時(shí)間，減少了篩選輪數(shù)，提高了篩選的成功率。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0024]下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，附圖中:
[0025]圖1為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法的流程圖；
[0026]圖2為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法的過(guò)程示意圖；
[0027]圖3A-3G為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中各輪篩選產(chǎn)物及上清中DNA經(jīng)PCR后的電泳圖；
[0028]圖4A-4B為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中空白對(duì)照組的激光共聚焦實(shí)驗(yàn)明場(chǎng)和暗場(chǎng)圖；
[0029]圖5A-5F為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中牛血清蛋白對(duì)照組的激光共聚焦實(shí)驗(yàn)明場(chǎng)和暗場(chǎng)圖；
[0030]圖6A-6F為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中內(nèi)皮糖蛋白實(shí)驗(yàn)組的激光共聚焦實(shí)驗(yàn)明場(chǎng)和暗場(chǎng)圖；
[0031 ] 圖7A-7G為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中選出的在文庫(kù)中占優(yōu)勢(shì)的DNA序列及其模擬二級(jí)結(jié)構(gòu)圖；
[0032]圖8A-8B為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中，E-Al與蛋白結(jié)合情況的流式檢測(cè)結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0034]本發(fā)明主要通過(guò)將包含大容量的隨機(jī)寡核苷酸序列的DNA文庫(kù)溶液與靶蛋白共同孵育，并通過(guò)各種分離途徑將結(jié)合復(fù)合物與未結(jié)合序列分離、洗脫、獲得與靶蛋白結(jié)合的序列并對(duì)這些序列進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，經(jīng)分離為單鏈后，生成次級(jí)文庫(kù)，再用于下輪篩選。從第二輪開(kāi)始，將前一輪文庫(kù)稀釋、使其濃度逐輪遞減進(jìn)行篩選，并不再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，數(shù)輪反復(fù)后，將篩選產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序，合成在文庫(kù)中數(shù)量占優(yōu)的DNA序列，經(jīng)測(cè)Kd值考察后，獲得特異性識(shí)別靶分子的寡核苷酸序列，即核酸適配體。
[0035]請(qǐng)參閱圖1，為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法的流程圖。如圖1所示，該實(shí)施例提供的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法主要包括以下步驟:
[0036]首先，在步驟SlOl中，執(zhí)行蛋白磁珠交聯(lián)步驟，將對(duì)照蛋白和靶蛋白分別與磁珠交聯(lián)，得到對(duì)照蛋白磁珠復(fù)合物和靶蛋白磁珠復(fù)合物。
[0037]隨后，在步驟S102中，執(zhí)行第一輪篩選步驟，在初始DNA文庫(kù)溶液中加入所述靶蛋白磁珠復(fù)合物進(jìn)行正篩選并洗脫后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分離為單鏈，得到第一輪篩選產(chǎn)物。
[0038]隨后，在步驟S103中，執(zhí)行重復(fù)篩選步驟，將前一輪篩選產(chǎn)物稀釋2~10倍作為下一輪篩選的DNA文庫(kù)溶液，先加入對(duì)照蛋白磁珠復(fù)合物進(jìn)行負(fù)篩，再加入靶蛋白磁珠復(fù)合物進(jìn)行正篩，并在洗脫后得到篩選產(chǎn)物和上清；將每輪篩選產(chǎn)物及上清中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并比較每輪篩選產(chǎn)物和上清中的DNA量是否滿足預(yù)設(shè)要求，是則得到最終篩選產(chǎn)物執(zhí)行合成DNA步驟，否則執(zhí)行重復(fù)篩選步驟進(jìn)行下一輪篩選。[0039]最后，在步驟S104中，執(zhí)行合成DNA步驟，對(duì)所述最終篩選產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，合成在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)的DNA序列，并經(jīng)檢測(cè)將能與所述靶蛋白特異性結(jié)合并具有高親和力的DNA序列作為該蛋白的核酸適配體。
[0040]本發(fā)明還相應(yīng)提供了采用該方法值得的核酸適配體。
[0041]本發(fā)明利用調(diào)控濃度這一與DNA親和力密切相關(guān)的因素，做為提高篩選壓力的手段，篩選出了具有高親和力的靶蛋白核酸適配體；本發(fā)明除了第一輪篩選需要使用PCR擴(kuò)增外，其余輪篩選的PCR擴(kuò)增均用于篩選產(chǎn)物的驗(yàn)證及克隆測(cè)序前的準(zhǔn)備，而不作為下一輪篩選文庫(kù)的擴(kuò)增，因此顯著降低了 PCR條件對(duì)篩選過(guò)程的影響，簡(jiǎn)化了整個(gè)篩選過(guò)程，大大縮短了篩選的時(shí)間，提高了篩選的成功率。
[0042]請(qǐng)參閱圖2，為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法的過(guò)程示意圖。在本實(shí)施例中，取革巴蛋白為內(nèi)皮糖蛋白(Endogl in ),對(duì)照蛋白為牛血清蛋白(BSA)?！揪唧w實(shí)施方式】如下:
[0043](1)文庫(kù)與引物預(yù)處理步驟
[0044]使用無(wú)菌水將上、下游引物配置成50uM濃度，DNA文庫(kù)用PBS溶解為50uM的溶液，均保存于20°C。并配 置文庫(kù)終濃度為5nM的PCR溶液體系，設(shè)置溫度梯度PCR優(yōu)化該DNA文庫(kù)的擴(kuò)增溫度，選擇特異性擴(kuò)增最明顯且無(wú)雜帶的溫度作為后續(xù)步驟的PCR擴(kuò)增最適溫度。
[0045]( 2 )蛋白磁珠交聯(lián)步驟
[0046]該步驟如圖2中步驟S201所示，具體如下:
[0047]①取150~300 μ I的磁珠，用25mM的MES (2_嗎啉乙磺酸)，其pH值為5.0洗滌兩
次并棄上清。
[0048]②用MES配置終濃度為50mg/ml的EDC (二氯乙烷)和NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)。
[0049]③取EDC和NHS各75~150 μ I至清洗過(guò)的磁珠，充分混勻于室溫?fù)u床孵育30~45分鐘，置磁力架上4分鐘，去上清。用150-300μ I的MES清洗兩次。磁珠已活化。
[0050]④分別取牛血清蛋白和內(nèi)皮糖蛋白25ug加入活化的磁珠中，室溫下置搖床孵育30~45分鐘，棄上清。
[0051]⑤用50mM的Tris (三羥甲基氨基甲烷)，其pH值為7.4，清洗包被蛋白的磁珠共4次。最后用PBS (含0.02%NaN3) 125u廣250ul重懸包被蛋白的磁珠至0.1~θ.5ug/ul。
[0052]( 3 )第一輪篩選步驟
[0053]該步驟如圖2中步驟S202-S204所示，具體如下:
[0054]①正篩步驟:如圖2中步驟S202所示，取適量初始DNA文庫(kù)溶液于95°C加熱并置冰上迅速冷卻，加入用PBS洗滌過(guò)的內(nèi)皮糖蛋白-磁珠復(fù)合物中。37°C搖床孵育1.5^2.5h，移去上清，用清洗緩沖液洗滌三次得DNA-內(nèi)皮糖蛋白-磁珠復(fù)合物。
[0055]②文庫(kù)洗脫步驟:如圖2中步驟S203所示，在正篩步驟得到的DNA-內(nèi)皮糖蛋白-磁珠復(fù)合物中加入500微升無(wú)菌水。95攝氏度加熱15~20分鐘，冰上冷卻，置磁力架3~5分鐘，收集上清。
[0056]③PCR擴(kuò)增步驟:如圖2中步驟S204所示，以文庫(kù)洗脫步驟中所得上清為模板DNA文庫(kù)溶液，并將該模板DNA文庫(kù)溶液擴(kuò)增16~20個(gè)循環(huán)后，再分離單鏈并脫鹽處理，得到第一輪篩選產(chǎn)物。[0057]④測(cè)量步驟:該步驟可以進(jìn)一步測(cè)A值，計(jì)算第一輪篩選產(chǎn)物的物質(zhì)的量。
[0058](4)重復(fù)篩選步驟即第二輪篩選~第N輪篩選
[0059]該步驟如圖2中步驟S205-S206所示，具體如下:
[0060]①文庫(kù)的預(yù)處理步驟:將前一輪篩選產(chǎn)物取1/2用作后續(xù)提及的檢測(cè)，另外1/2作為下一輪篩選的DNA文庫(kù)溶液，用結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)稀釋2~10倍后，95°C加熱并置冰上迅速冷卻，待用。
[0061]②反篩步驟:取牛血清蛋白-磁珠復(fù)合物3~10ug，用25(T500uL結(jié)合緩沖液洗滌兩次，加入上述的文庫(kù)，37°C搖床孵育30分鐘~1.5小時(shí)(該時(shí)間隨著篩選輪數(shù)的增加而延長(zhǎng))。置磁力架上收集上清。
[0062]③正篩步驟:將反篩步驟得到的上清加結(jié)合緩沖液稀釋至lmL，加入用PBS洗滌過(guò)的內(nèi)皮糖蛋白-磁珠復(fù)合物3~10ug中。37°C搖床孵育30分鐘~1.5小時(shí)(該時(shí)間隨著篩選輪數(shù)的增加而減少)，移取上清，標(biāo)記為“第N輪正篩上清”，用清洗緩沖液洗滌三次，得DNA-內(nèi)皮糖蛋白-磁珠復(fù)合物。
[0063]④文庫(kù)洗脫步驟:如圖2中步驟S206所示，在DNA-內(nèi)皮糖蛋白_磁珠復(fù)合物中加入200微升無(wú)菌水。95攝氏度加熱15~20分鐘，冰上冷卻，置磁力架3~5分鐘，收集上清。重復(fù)用無(wú)菌水洗滌磁珠，收集每次的上清混合在一起，共收集到500uf Iml的本輪篩選產(chǎn)物，即DNA文庫(kù)。
[0064](5)檢測(cè)文庫(kù)與蛋白 結(jié)合情況
[0065]前述重復(fù)篩選步驟的篩選輪數(shù)以電泳或激光共聚焦的結(jié)果來(lái)定。一般情況下，做3^4輪篩選。
[0066]①PCR擴(kuò)增和電泳。將各輪篩選的產(chǎn)物與上清作為模板，以相同循環(huán)數(shù)作PCR擴(kuò)增，對(duì)比每一輪篩選產(chǎn)物與上清的DNA量，判斷該輪篩選中能與內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合的DNA的量是否占據(jù)優(yōu)勢(shì)，是則滿足了預(yù)設(shè)要求，否則繼續(xù)下一輪篩選。
[0067]②激光共聚焦。將各輪篩選的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(并用熒光標(biāo)記引物)，分離為單鏈，與靶蛋白及對(duì)照蛋白孵育，采用激光共聚焦評(píng)價(jià)結(jié)合效果，根據(jù)預(yù)設(shè)要求判斷是否需要進(jìn)行下一輪篩選。
[0068](6)克隆、測(cè)序、合成DNA步驟。
[0069]該步驟如圖2中步驟S207-S208所示，具體如下:
[0070]先對(duì)最終篩選產(chǎn)物進(jìn)行如步驟S207所示的克隆，再進(jìn)入如步驟S208所示的測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果，選擇在文庫(kù)中占優(yōu)勢(shì)的DNA序列進(jìn)行合成，得所需的核酸適配體。
[0071](7)考察核酸適配體與靶蛋白的親和力。
[0072]將前述(5)中合成的帶有熒光標(biāo)記的DNA以及將帶熒光標(biāo)記的無(wú)關(guān)序列各IOOnM與內(nèi)皮糖蛋白孵育，利用流式細(xì)胞儀測(cè)熒光強(qiáng)度變化，并推算出kd值，確定該序列對(duì)于靶標(biāo)的特異性識(shí)別能力，將能與靶蛋白特異性結(jié)合并具有高親和力的DNA序列作為該蛋白的核酸適配體。核酸適配體對(duì)靶分子具有的高親和性。本領(lǐng)域基礎(chǔ)技術(shù)人員熟知與抗體相比，核酸適配體與小分子的平衡解離常數(shù)在微摩爾至納摩爾之間；與生物大分子之間的平衡解離常數(shù)一般在納摩和皮摩爾之間。因此，對(duì)于本發(fā)明采用的靶分子內(nèi)皮糖蛋白為小分子，因此高親和性是指DNA序列與該內(nèi)皮糖蛋白的平衡解離常數(shù)在微摩爾至納摩爾之間。
[0073]請(qǐng)參閱圖3A-3G，分別為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中各輪篩選產(chǎn)物及上清中DNA經(jīng)PCR后的電泳圖。其中，圖3A-3C分別為第二輪正篩產(chǎn)物，第二輪正篩上清和第二輪反篩產(chǎn)物的電泳圖。圖3D-3E分別為第三輪正篩產(chǎn)物和第三輪正篩上清的電泳圖。圖3F-3G分別為第四輪正篩產(chǎn)物和第四輪正篩上清的電泳圖。各圖中下方標(biāo)示的數(shù)字代表PCR的循環(huán)數(shù)。如圖可見(jiàn)，第二輪篩選后，正篩上清中DNA的量較正篩產(chǎn)物多，反篩產(chǎn)物與正篩產(chǎn)物量相似(見(jiàn)圖3A、3B和3C)。隨著篩選輪數(shù)的增加，正篩上清中的DNA逐漸減少，至第四輪，正篩產(chǎn)物較正篩上清中的DNA多(見(jiàn)圖3F-3G)，且由于此輪中與內(nèi)皮糖蛋白孵育時(shí)的DNA文庫(kù)溶液的濃度已遠(yuǎn)小于1~30ηΜ。因此建議將第二輪、第三輪及第四輪的產(chǎn)物PCR擴(kuò)增，用激光共聚焦進(jìn)行表征以進(jìn)行分析。
[0074]請(qǐng)參閱圖4A-4B分別為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中空白對(duì)照組的激光共聚焦實(shí)驗(yàn)明場(chǎng)和暗場(chǎng)圖。該空白對(duì)照組為用熒光標(biāo)記的內(nèi)皮糖蛋白-M270磁珠復(fù)合物。
[0075]圖5A-5F分別為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中牛血清蛋白對(duì)照組的激光共聚焦實(shí)驗(yàn)明場(chǎng)和暗場(chǎng)圖。該牛血清蛋白對(duì)照組為各輪篩選產(chǎn)物用熒光標(biāo)記后分別與牛血清蛋白-M270磁珠復(fù)合物孵育后做激光共聚焦的結(jié)果。其中，圖5A和5B分別為第二輪篩選產(chǎn)物與牛血清蛋白-M270磁珠復(fù)合物孵育后做激光共聚焦的明場(chǎng)和暗場(chǎng)圖；圖5C和分別為第三輪篩選產(chǎn)物與牛血清蛋白-M270磁珠復(fù)合物孵育后做激光共聚焦的明場(chǎng)和暗場(chǎng)圖；圖5E和5F分別為第四輪篩選產(chǎn)物與牛血清蛋白-M270磁珠復(fù)合物孵育后做激光共聚焦的明場(chǎng)和暗場(chǎng)圖。
[0076]圖6A-6F分別為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中內(nèi)皮糖蛋白實(shí)驗(yàn)組的激光共聚焦實(shí)驗(yàn)明場(chǎng)和暗場(chǎng)圖。該內(nèi)皮糖蛋白實(shí)驗(yàn)組為各輪篩選產(chǎn)物用熒光標(biāo)記后分別與內(nèi)皮糖蛋白-M270磁珠復(fù)合物孵育后做激光共聚焦的結(jié)果。其中，圖6A和6B分別為第二輪篩選產(chǎn)物與內(nèi)皮糖蛋白-M270磁珠復(fù)合物孵育后做激光共聚焦的明場(chǎng)和暗場(chǎng)圖；圖6C和6D分別為第三輪篩選產(chǎn)物與內(nèi)皮糖蛋白-M270磁珠復(fù)合物孵育后做激光共聚焦的明場(chǎng)和暗場(chǎng)圖；圖6E和6F分別為第四輪篩選產(chǎn)物與內(nèi)皮糖蛋白-M270磁珠復(fù)合物孵育后做激光共聚焦的明場(chǎng)和暗場(chǎng)圖。
[0077]前述所有激光共聚焦實(shí)驗(yàn)的條件相同。從圖中顯示，內(nèi)皮糖蛋白實(shí)驗(yàn)組在第三、四輪可見(jiàn)熒光。而牛血清蛋白對(duì)照組未見(jiàn)熒光，表明這兩輪篩選產(chǎn)物與內(nèi)皮糖蛋白結(jié)合明顯較對(duì)照蛋白強(qiáng)，因此可以建議在第三輪篩選或者第四輪篩選后進(jìn)行克隆測(cè)序。
[0078]請(qǐng)參閱圖7A-7G，為根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中，從克隆、測(cè)序結(jié)果中選出在文庫(kù)中占優(yōu)勢(shì)的DNA序列及其模擬二級(jí)結(jié)構(gòu)圖。克隆測(cè)序結(jié)果表明第二輪篩選產(chǎn)物測(cè)序，其中有3%為同一序列。第三輪篩選產(chǎn)物中，該序列達(dá)25%。第四輪篩選產(chǎn)物中，測(cè)序該序列達(dá)68%，稱該序列為E-Al。其中，圖7A為E-Al的克隆測(cè)序結(jié)果圖；圖7B-7G為E-Al的多種模擬二級(jí)結(jié)構(gòu)圖。
[0079]圖8A-8B為根 據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法中，E-Al與蛋白結(jié)合情況的流式檢測(cè)結(jié)果圖。合成帶熒光標(biāo)記的E-A1，經(jīng)文庫(kù)與內(nèi)皮糖蛋白孵育后用流式細(xì)胞儀測(cè)試熒光強(qiáng)度。其中圖8A為流式細(xì)胞儀檢測(cè)，對(duì)比無(wú)關(guān)序列和E-Al分別與內(nèi)皮糖蛋白的孵育后熒光強(qiáng)度變化圖。曲線Kl為空白對(duì)照，曲線K2為無(wú)關(guān)序列，曲線K3為E-A1。圖SB為用流式測(cè)其熒光強(qiáng)度，計(jì)算平衡常數(shù)及行E-Al與內(nèi)皮糖蛋白平衡解離常數(shù)的擬合；計(jì)算出E-Al的kd約為6.9nM±0.56，實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明篩選得到的E-Al與靶蛋白具有高的親和性，可能作為內(nèi)皮糖蛋白檢測(cè)的分子探針。
[0080] 本發(fā)明是根據(jù)特定實(shí)施例進(jìn)行描述的，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)明白在不脫離本發(fā)明范圍時(shí)，可進(jìn)行各種變化和等同替換。此外，為適應(yīng)本發(fā)明技術(shù)的特定場(chǎng)合或材料，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行諸多修改而不脫離其保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明并不限于在此公開(kāi)的特定實(shí)施例，而包括所有落入到權(quán)利要求保護(hù)范圍的實(shí)施例。
【權(quán)利要求】
1.一種基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法，其特征在于，包括以下步驟: 蛋白磁珠交聯(lián)步驟，將對(duì)照蛋白和靶蛋白分別與磁珠交聯(lián)，得到對(duì)照蛋白磁珠復(fù)合物和靶蛋白磁珠復(fù)合物； 第一輪篩選步驟，在初始DNA文庫(kù)溶液中加入所述靶蛋白磁珠復(fù)合物進(jìn)行正篩選并洗脫后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分離為單鏈，得到第一輪篩選產(chǎn)物； 重復(fù)篩選步驟，將前一輪篩選產(chǎn)物稀釋2~10倍作為下一輪篩選的DNA文庫(kù)溶液，先加入對(duì)照蛋白磁珠復(fù)合物進(jìn)行負(fù)篩，再加入靶蛋白磁珠復(fù)合物進(jìn)行正篩，并在洗脫后得到篩選產(chǎn)物和上清；將每輪篩選產(chǎn)物及上清中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并比較每輪篩選產(chǎn)物和上清中的DNA量是否滿足預(yù)設(shè)要求，是則得到最終篩選產(chǎn)物執(zhí)行合成DNA步驟，否則執(zhí)行重復(fù)篩選步驟進(jìn)行下一輪篩選； 合成DNA步驟，對(duì)所述最終篩選產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，合成在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)的DNA序列，并經(jīng)檢測(cè)將能與所述靶蛋白特異性結(jié)合并具有高親和力的DNA序列作為該蛋白的核酸適配體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法，其特征在于，所述靶蛋白為內(nèi)皮糖蛋白，所述對(duì)照蛋白為牛血清蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法，其特征在于，所述第一輪篩選步驟具體包括: 正篩步驟:取初始DNA文庫(kù)溶液于95°C加熱并置冰上迅速冷卻，加入靶蛋白磁珠復(fù)合物，置于37°C搖床孵育1.5^2.5h，移去上清，用緩沖液洗滌三次； 文庫(kù)洗脫步驟:加入無(wú)菌水后在95°C加熱15~20分鐘，冰上冷卻，置磁力架3~5分鐘，取上清； PCR擴(kuò)增步驟:以該上清為模板DNA文庫(kù)溶液，并將該模板DNA文庫(kù)溶液擴(kuò)增16~20個(gè)循環(huán)后，分離單鏈并脫鹽處理，得到第一輪篩選產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法，其特征在于，所述重復(fù)篩選步驟具體包括: 文庫(kù)的預(yù)處理步驟:將前一輪篩選產(chǎn)物取稀釋2~10倍后做為下一輪篩選的DNA文庫(kù)溶液，在95°C加熱并置冰上迅速冷卻； 反篩步驟:取對(duì)照蛋白磁珠復(fù)合物3~10ug加入預(yù)處理得到的DNA文庫(kù)溶液中，37°C搖床孵育30分鐘~1.5小時(shí)，置磁力架上收集上清； 正篩步驟:將反篩得到的上清稀釋，加入靶蛋白磁珠復(fù)合物3~10ug，37°C搖床孵育30分鐘~1.5小時(shí)，移除上清，用緩沖液清洗三次，得DNA靶蛋白磁珠復(fù)合物； 文庫(kù)洗脫步驟:在DNA靶蛋白磁珠復(fù)合物中加入無(wú)菌水，95攝氏度加熱15~20分鐘，冰上冷卻，置磁力架3~5分鐘，收集上清；重復(fù)用無(wú)菌水洗滌，收集每次的上清混合得到該輪篩選產(chǎn)物。
5.—種核酸適配體,其特征在于,米用根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的基于DNA文庫(kù)濃度遞減的核酸適配體篩選方法制備獲得。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103966222SQ201310040069
【公開(kāi)日】2014年8月6日 申請(qǐng)日期:2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月1日
【發(fā)明者】趙永祥, 李霞, 盧小玲 申請(qǐng)人:廣西醫(yī)科大學(xué)