基于核酸適配體的雙酚a比色檢測(cè)法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明關(guān)于水環(huán)境檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及到基于非標(biāo)記的雙酚A適配體，陽離子聚 合物以及納米金顆粒比色法檢測(cè)水中雙酚A的方法，即一種基于核酸適配體的雙酚A比色 檢測(cè)法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙酚A是世界上使用較為廣泛的工業(yè)化合物之一，在塑料制品的加工過程中，添 加雙酚A可以使其具有無色透明、耐用、輕巧等特性；同時(shí)由于其具有一定的耐腐蝕性，因 此還被廣泛用于食品飲料等的包裝；此外，雙酚A還被用于奶瓶、水瓶、牙齒填充物、眼鏡片 以及其他數(shù)百種日用品的制造過程中。然而隨著雙酚A的廣泛使用，越來越多的問題也日 益暴露出來。有研究表明，雙酸A屬低毒性化學(xué)物，是一種弱內(nèi)分泌干擾物，它可以模擬人 類和動(dòng)物雌激素的行為以及破壞雌激素與雌激素受體結(jié)合過程，從而導(dǎo)致人類及動(dòng)物產(chǎn)生 多種疾病，如使動(dòng)物產(chǎn)生雌性早熟、精子數(shù)下降、前列腺增長(zhǎng)等作用以及增加卵巢癌、前列 腺癌、白血病等癌癥的發(fā)生的可能性。
[0003] 傳統(tǒng)檢測(cè)雙酚A的方法有氣相色譜，高效液相色譜法，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，氣 相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。此外，電化學(xué)傳感器法和免疫電化學(xué)法也用于檢測(cè)環(huán)境中的雙酚A， 如酶聯(lián)免疫分析法等。雖然這些方法具有較高的檢測(cè)限和靈敏度，但是在實(shí)際操作過程中 需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，如萃取、濃縮和衍生化等，同時(shí)還需要昂貴而復(fù)雜的精密儀 器以及訓(xùn)練有素的技術(shù)人員，費(fèi)力費(fèi)時(shí)，難以滿足大規(guī)模應(yīng)用及實(shí)時(shí)原位檢測(cè)的需要。
[0004] 比色法是一種相對(duì)簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法，利用基于核酸適配體、陽離子聚合物以 及納米金比色檢測(cè)雙酚A的方法目前還未見報(bào)道。盡管在先專利申請(qǐng)2015510012212. 6 公開了一種基于核酸適配體的比色法檢測(cè)17 β -雌二醇的方法，但是其技術(shù)方案是針對(duì) 17 β-雌二醇提出的，具有靶標(biāo)特異性，這是基于核酸適配體的普遍性問題，所以在先申請(qǐng) 的公開對(duì)本申請(qǐng)的實(shí)現(xiàn)沒有任何的啟示作用。為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本申請(qǐng)基于靶標(biāo) 特異性，優(yōu)選出核酸適配體，提供一種基于核酸適配體的雙酚A比色檢測(cè)法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種基于核酸適配體的雙酚A比色 檢測(cè)法，特別是一種操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好、成本低且高效地檢測(cè)水中雙酚A的方 法。本發(fā)明方法用于檢測(cè)水中的雙酚A時(shí)，操作靈活簡(jiǎn)便，無需復(fù)雜的儀器設(shè)備和專業(yè)的操 作人員，且具有良好的靈敏度和特異性。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供一種雙酚A比色法檢測(cè)用的核酸適配體，所示核酸適配體 具體如SEQ ID No. 1所示。所述核酸適配體是通過selex方法篩選出，能與祀標(biāo)雙酸A特 性性結(jié)合。
[0008] 第二方面，本發(fā)明提供一種基于所述核酸適配體的雙酚A比色檢測(cè)法，所述比色 檢測(cè)法具體包括如下步驟：
[0009] 標(biāo)準(zhǔn)液制備：向核酸適配體溶液中加入雙酚A溶液，得濃度已知的雙酚A濃度梯度 溶液；向所述雙酚A濃度梯度溶液加入陽離子聚合物溶液、納米金溶液，即得比色檢測(cè)用標(biāo) 準(zhǔn)液；
[0010] 對(duì)照液制備：向核酸適配體溶液中加入水，即得比色檢測(cè)用對(duì)照液；
[0011] 標(biāo)準(zhǔn)線繪制：對(duì)所述標(biāo)準(zhǔn)液、對(duì)照液的吸光度進(jìn)行檢測(cè)，基于所述檢測(cè)所得數(shù)據(jù)繪 制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0012] 吸光度檢測(cè)：參照所述標(biāo)準(zhǔn)液制備的方法，將雙酚A溶液用待測(cè)樣品代替，制得樣 品檢測(cè)液；以所述對(duì)照液為對(duì)照，對(duì)樣品檢測(cè)液的吸光度進(jìn)行檢測(cè)，將檢測(cè)所得數(shù)據(jù)帶入所 述標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可對(duì)比計(jì)算得出待測(cè)樣品中的雙酚A濃度。
[0013] 優(yōu)選地，標(biāo)準(zhǔn)液制備的步驟中，所述核酸適配體溶液具體指核酸適配體的 Na2HPO4-NaH2PO^沖液，pH = 8 ;所述核酸適配體溶液的制備具體為：在I. 5mL的離心管中， 加入4 μ L初始濃度為500nM的雙酚A適配體和相應(yīng)體積的pH = 8的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖 液放置在25°C條件下備用。
[0014] 優(yōu)選地，標(biāo)準(zhǔn)液制備的步驟中，所述加入雙酚A溶液后，還需混勻、20~30°C恒溫 孵育30分鐘；所述雙酚A溶液的初始濃度包括25 μ M ;所述濃度梯度包括12個(gè)濃度。
[0015] 優(yōu)選地，標(biāo)準(zhǔn)液制備的步驟中，所述加入陽離子聚合物溶液后，還需混勻、20~ 30°C恒溫孵育20分鐘；所述陽離子聚合物溶液中的陽離子聚合物具體為聚二烯基丙二甲 基氯化銨；所述陽離子聚合物溶液的初始濃度包括500nM。
[0016] 優(yōu)選地，標(biāo)準(zhǔn)液制備的步驟中，所述加入納米金溶液后，還需20~30°C恒溫孵育 15分鐘；所述納米金溶液的加入量為每個(gè)濃度梯度加100 μ L。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述恒溫孵育的溫度為25°C。
[0018] 優(yōu)選地，所述恒溫孵育具體采用恒溫孵育器。
[0019] 優(yōu)選地，對(duì)照液制備的步驟中，所述水為超純水。
[0020] 優(yōu)選地，標(biāo)準(zhǔn)線繪制、吸光度檢測(cè)的步驟中，所述吸光度的測(cè)定是在650nm和 520nm波長(zhǎng)條件下進(jìn)行的。
[0021] 優(yōu)選地，標(biāo)準(zhǔn)線繪制的步驟中，所述基于所述檢測(cè)所得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線具體指： 標(biāo)準(zhǔn)液于650nm、520nm測(cè)得的吸光度分別為A 65Q、A52。，吸光度比A雙aA = A 65。以52。;對(duì)照液于 65〇nm、52〇nm測(cè)得的吸光度分別為A對(duì)照 650、A5fif照520，吸光度比A5fif照=A 5fif照650/A對(duì)照520，以雙酸 A的濃度為橫坐標(biāo)、Aswa = A 6M/A52。為縱坐標(biāo)作圖；在低濃度雙酚A的條件下，A _A與空 白對(duì)照組之差ΔΑ進(jìn)行擬合線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為AA = 4.05X 10 4C 雙ffiA+〇· 003 〇
[0022] 優(yōu)選地，吸光度檢測(cè)的步驟中，所述檢測(cè)所得數(shù)據(jù)具體指樣品檢測(cè)液與對(duì)照液的 吸光度比差A(yù) A。
[0023] 第三方面，本發(fā)明提供一種基于所述核酸適配體的雙酚A比色檢測(cè)法用檢測(cè)體 系，所述檢測(cè)體系包括標(biāo)準(zhǔn)液、對(duì)照液、樣品檢測(cè)液；
[0024] 所述標(biāo)準(zhǔn)液的制備具體包括：向核酸適配體溶液中加入雙酚A溶液，得濃度已知 的雙酚A濃度梯度溶液；向所述雙酚A濃度梯度溶液加入陽離子聚合物溶液、納米金溶液， 即得標(biāo)準(zhǔn)液；
[0025] 所述對(duì)照液的制備具體包括：向核酸適配體溶液中加入水，即得比色檢測(cè)用對(duì)照 液；
[0026] 所述樣品檢測(cè)液的制備具體包括：向核酸適配體溶液中加入陽離子聚合物溶液、 納米金溶液，即得樣品檢測(cè)液；向所述樣品檢測(cè)液中加入檢測(cè)樣品、以所述對(duì)照液為對(duì)照， 即可進(jìn)行樣品檢測(cè)。
[0027] 本發(fā)明的原理是（如圖1所示）：通過雙酚A適配體與陽離子聚合物聚二烯基丙 二甲基氯化銨和雙酚A之間的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)以及陽離子聚合物聚集納米金的反應(yīng)來構(gòu)建雙酚A 檢測(cè)體系。具體反應(yīng)為當(dāng)檢測(cè)體系中不存在雙酚A時(shí)，雙酚A適配體可以與陽離子聚合物 通過靜電引力結(jié)合形成類似雙鏈的結(jié)構(gòu)，此時(shí)由于陽離子聚合物的正電荷被屏蔽，所以其 無法破壞納米金顆粒之間的靜電平衡，納米金不發(fā)生聚集，反應(yīng)液依然為紅色；而當(dāng)檢測(cè)體 系中存在雙酚A時(shí)，由于適配體與雙酚A之間的結(jié)合力大于適配體與陽離子聚合物之間的 結(jié)合力，所以適配體首先與雙酚A發(fā)生特異性反應(yīng)，此時(shí)溶液中的陽離子聚合物處于自由 狀態(tài)且因其帶正電，而納米金帶負(fù)電，所以陽離子聚合物能夠破壞納米金顆粒之間的電荷 平衡，使其發(fā)生聚集現(xiàn)象，顏色由酒紅色變?yōu)樽仙踔潦撬{(lán)色。最終反應(yīng)液顏色的變化程度 與雙酚A濃度成正相關(guān)，即雙酚A濃度越高，與雙酚A特異性結(jié)合的適配體也就越多，自由 狀態(tài)的陽離子聚合物濃度也就越高，納米金的聚集程度也就越大，最終導(dǎo)致反應(yīng)液的顏色 就越深，因此通過比色信號(hào)的輸出，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)水中雙酚A的檢測(cè)。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：
[0029] (1)本發(fā)明方法用于檢測(cè)水體中的雙酚A，無需對(duì)檢測(cè)的樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理， 核酸適配體無需標(biāo)記。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比較，該方法操作簡(jiǎn)便，無需使用大型的儀器設(shè) 備，不需要專業(yè)的儀器操作人員，降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)的效率；
[0030] (2)本發(fā)明用于檢測(cè)水體中的雙酚A，其反應(yīng)溫度在20~30°C條件下吸光度之差 值幾乎無差異，因此本發(fā)明在室溫條件下就可以完成對(duì)雙酚A的檢測(cè)，使得該方法的應(yīng)用 具有一定的優(yōu)越性；
[0031] (3)本發(fā)明方法具有良好的選擇性，當(dāng)被檢測(cè)液中含有多種內(nèi)分泌干擾物、金屬離 子、抗生素以及金屬離子，本發(fā)明依然具有很好的特有性，當(dāng)將雙酚A與雌二醇以及己烯雌 酚混合時(shí)，其對(duì)雙酚A的檢出在誤差范圍內(nèi)無影響；
[0032] (4)本發(fā)明方法用于檢測(cè)水體中雙酚A，具有操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快，靈敏等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0033] 通過閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更明顯：
[0034] 圖1、本發(fā)明檢測(cè)方法的原理圖；
[0035] 圖2、雙酚A濃度從0~1500nM的吸光度A65Q/A52。的比值；
[0036] 圖3、低濃度雙酚A樣品組與對(duì)照組A6mA52。之差ΔΑ與雙酚A濃度之間關(guān)系的線 性擬合圖；
[0037] 圖4、基于核酸適配體比色法檢測(cè)水中雙酚A的方法的選擇性驗(yàn)證結(jié)果；
[0038] 圖5、基于核酸適配體比色法檢測(cè)水中雙酚A的方法所涉