一株快速發(fā)酵面包酵母菌株及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速發(fā)酵面包酵母菌株及其構(gòu)建方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過在親本面包酵母菌株中，完全敲除葡萄糖磷酸變位酶基因PGM2，同時選用強(qiáng)啟動子PGK1過表達(dá)H/ACA小核仁RNA(SNR84)全序列，來獲得該快速發(fā)酵面包酵母菌株。所述快速發(fā)酵面包酵母菌株在不加糖面團(tuán)發(fā)酵中1h?CO2產(chǎn)氣量達(dá)到818mL，較親本菌株提高了21.2％(親本菌株不加糖面團(tuán)發(fā)酵1h?CO2產(chǎn)氣量675mL)，同時發(fā)酵時間縮短了18.0％。該面包酵母在不加糖面團(tuán)中發(fā)酵能力強(qiáng)，滿足了面食加工市場對“快速”酵母的需求，有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】一株快速發(fā)酵面包酵母菌株及其構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
:
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及工業(yè)微生物的育種，尤其是一株快速發(fā)酵面包酵母及其構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
:
[0002]現(xiàn)今，面食花樣繁多，制作方法也多種多樣，但不管采取何種制作方法，面團(tuán)的發(fā)酵過程都是整個工藝中的重要步驟，它直接影響著面食產(chǎn)品的質(zhì)量。歐美等發(fā)達(dá)國家考慮到健康因素普遍以咸面包為主食，面包普遍為不加糖或低糖(加糖量低于6%)。我國人口眾多，其中有一半左右的人口以面食為主，而且大都是饅頭等不加糖面團(tuán)發(fā)酵類面食，據(jù)統(tǒng)計(jì)北方約有70%的小麥面粉用來制作饅頭。
[0003]面團(tuán)發(fā)酵的實(shí)質(zhì)是面粉在各種酶的作用下，將各種雙糖和多糖轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的單糖，再經(jīng)酵母的發(fā)酵作用轉(zhuǎn)化成二氧化碳，使面團(tuán)膨脹和生成其它發(fā)酵物質(zhì)，使面包增加風(fēng)味、面團(tuán)成熟的過程。面團(tuán)發(fā)酵能力是衡量面包酵母產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)。良好的面團(tuán)起發(fā)能力可以大大縮短面團(tuán)發(fā)酵周期，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。
[0004]在不加糖面團(tuán)中，最主要的可發(fā)酵糖是麥芽糖。麥芽糖經(jīng)麥芽糖通透酶運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)經(jīng)麥芽糖酶水解為兩個葡萄糖分子進(jìn)入糖酵解途徑，供細(xì)胞利用。6-磷酸葡萄糖是糖酵解過程的第一個中間物，在繼續(xù)進(jìn)行各種化學(xué)反應(yīng)生成CO2和H20、釋放能量的同時，由葡萄糖磷酸變位酶(PGM2)轉(zhuǎn)化成1-磷酸葡萄糖合成糖原，減少糖酵解途徑的通量。因此，敲除葡萄糖磷酸變位酶編碼基因PGM2，阻斷6-磷酸葡萄糖到1-磷酸葡萄糖的轉(zhuǎn)化，可以增加糖酵解途徑的通量，提高有氧條件下CO2的產(chǎn)量，從而提高面團(tuán)發(fā)酵力。
[0005]SNR84基因編碼H/ACA snoRNA (小核仁RNA)。大部分H/ACA小核仁RNA參與堿基修飾，像大亞基rRNA的假尿苷化，指定rRNA中假尿苷的形成位點(diǎn)；小部分H/ACA小核仁RNA在剪切前體rRNA中也起到重要作用。據(jù)推測，SNR84參與到激活大亞基rRNA假尿苷化的功能，加快大亞基rRNA的成熟速率和提高大亞基rRNA的數(shù)量。當(dāng)成熟的大亞基rRNA在指數(shù)生長期快速形成時，大部分相關(guān)酶的產(chǎn)率提高。Lee等以半乳糖為碳源，通過過表達(dá)SNR84基因提高了釀酒酵母在半乳糖中的生長及酒精產(chǎn)量。
[0006]目前，很多研究通過對麥芽糖代謝途徑直接相關(guān)基因的改造提高麥芽糖代謝速度，從而提高面團(tuán)發(fā)酵力，對麥芽糖代謝途徑間接相關(guān)基因的改造或?qū)ξ粗柠溠刻谴x網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的報道較少，同時，目前對于H/ACA小核仁RNA的研究基本上集中在理論研究，關(guān)于H/ACA小核仁RNA的應(yīng)用僅有少數(shù)報道，尤其在選育快速發(fā)酵菌株中的研究更是空白。因此，本發(fā)明通過完全敲除PGM2編碼的葡萄糖磷酸變位酶基因，同時過表達(dá)SNR84基因編碼的H/ACAsnoRNA，選育快速發(fā)酵面包酵母菌株，滿足酵母應(yīng)用相關(guān)領(lǐng)域?qū)湍傅妮^高要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

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[0007]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題之一是提供一株快速發(fā)酵面包酵母菌株。
[0008]所述快速發(fā)酵面包酵母菌株是在出發(fā)酵母菌株中完全敲除PGM2編碼的葡萄糖磷酸變位酶，同時過表達(dá)由SNR84基因編碼的H/ACA小核仁RNA全序列所得。
[0009]所述PGM2基因其Gene ID為:855131，序列如核苷酸序列表中SEQ NO:1所示；所述SNR84基因其Gene ID為:9164879，序列如核苷酸序列表中SEQ NO: 2所示。
[0010]優(yōu)選的，所述出發(fā)酵母菌株為面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616。
[0011]本發(fā)明所解決的另一個技術(shù)問題是提供一種快速發(fā)酵面包酵母菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0012](1)PGM2基因的敲除
[0013]①以質(zhì)粒pUC6為模板，PCR擴(kuò)增KanMX基因；
[0014]②將步驟(1)-①得到的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入出發(fā)酵母菌株中，獲得KanMX替代敲除PGM2的重組菌株I ;
[0015]③用pGAP質(zhì)粒去除步驟(1)-②獲得菌株中的KanMX基因，獲得完全敲除PGM2的重組菌株2 ；
[0016](2)SNR84基因的過表達(dá)
[0017]①以面包酵母CICC31616總DNA為模板，PCR擴(kuò)增SNR84基因；
[0018]②將步驟(2)- ①得到的PCR產(chǎn)物連接到含有PGKl強(qiáng)啟動子的質(zhì)粒上，獲得表達(dá)質(zhì)粒I ;
[0019]③以表達(dá)質(zhì)粒I為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得SNR84基因和強(qiáng)啟動子的連接片段；
[0020]④將步驟(2)-③獲得的片段連接到帶有KanMX抗性的載體上，得到表達(dá)質(zhì)粒2 ；
[0021]⑤將步驟(2)-④獲得的表達(dá)質(zhì)粒2導(dǎo)入重組菌株2中，獲得完全敲除PGM2同時過表達(dá)SNR84的重組菌株。
[0022]所述含有PGKl強(qiáng)啟動子的質(zhì)粒優(yōu)選pUC質(zhì)粒；
[0023]所述帶有KanMX抗性的載體優(yōu)選Y印352載體；
[0024]優(yōu)選的，所述出發(fā)酵母菌株為面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616。
[0025]所述面包酵母(Saccharomyces cerevisiae) CICC31616,是一株保存于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心的菌株，公眾可通過購買獲得。
[0026]所述重組菌株可通過上述方法構(gòu)建，也可以用其他分子生物學(xué)手段獲得。這些方法已有許多文獻(xiàn)報道，如Joseph Sambrook等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版,科學(xué)出版社，1995。
[0027]本發(fā)明所述的面包酵母重組菌株，其在不加糖面團(tuán)發(fā)酵中每小時產(chǎn)氣較親本菌株提高21.2%，發(fā)酵時間縮短18.0%。
[0028]有益效果:
[0029]1、本發(fā)明提供一種快速發(fā)酵面包酵母，滿足了面食加工市場對“快速”酵母的需求。
[0030]2、本發(fā)明提供的快速發(fā)酵面包酵母是在保持優(yōu)良基本發(fā)酵性能的前提下，在不加糖面團(tuán)發(fā)酵中表現(xiàn)出較高的面團(tuán)起發(fā)能力，從而縮短發(fā)酵時間,提高經(jīng)濟(jì)效益。
[0031]3、本發(fā)明所述的快速發(fā)酵面包酵母菌株是通過完全敲除PGM2編碼的葡萄糖磷酸變位酶，同時過表達(dá)由SNR84基因編碼的H/ACA小核仁RNA全序列所得，是對葡萄糖磷酸變位酶和H/ACA小核仁RNA的創(chuàng)造性運(yùn)用，為其理論研究和應(yīng)用研究開辟了新的領(lǐng)域。
[0032]4、選育得到的菌株對發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般工廠的設(shè)備和條件均可使用，因而有廣泛的應(yīng)用前景，必將帶動我國焙烤食品行業(yè)、饅頭產(chǎn)業(yè)和零售行業(yè)的發(fā)展?！緦＠綀D】

【附圖說明】:
[0033]圖1為Y印-KPS質(zhì)粒構(gòu)建過程；
[0034]圖2為表達(dá)質(zhì)粒Y印-KPS的PCR驗(yàn)證
[0035]其中:(a)中M為marker ;I為以Y印-KPS為模板，PCR擴(kuò)增SNR84片段
[0036](b)中M為marker ; I為以Y印-KPS為模板，PCR擴(kuò)增片段PS ；
[0037]圖3為敲除PGM2重組菌株的驗(yàn)證
[0038]其中:M為marker ;1為以重組菌株2的基因組為模板，PCR擴(kuò)增PGM2片段；2為以出發(fā)菌CICC31616基因組為模板，PCR擴(kuò)增PGM2片段；3為以重組菌株2的基因組為模板，PCR擴(kuò)增KanMX片段；4為以重組菌株I的基因組為模板，PCR擴(kuò)增KanMX片段
[0039]圖4為完全敲除PGM2的重組菌株中過表達(dá)SNR84基因的驗(yàn)證
[0040]其中:M為marker ；1為以完全敲除PGM2且過表達(dá)SNR84基因重組菌株的酵母質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增PS片段；2為以出發(fā)菌CICC31616酵母質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增PS片段。

【具體實(shí)施方式】
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[0041]下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明的一種快速發(fā)酵面包酵母菌株及其選育方法。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0042]實(shí)施例1:快速發(fā)酵面包酵母菌株的構(gòu)建
[0043](I)表達(dá)質(zhì)粒Y印-KPS的構(gòu)建
[0044]表達(dá)質(zhì)粒Y印-KPS的構(gòu)建流程如圖1所示；
[0045]以酵母菌株CICC31616總DNA為模板，PCR擴(kuò)增SNR84基因全序列，反應(yīng)體系見表
I:
[0046]上游引物:5’-GGAAGATCTATTGCACAACTTAAGTTTGTCGAGG-3> (SEQ ID NO:3)；
[0047]下游引物:5’-GGAAGATCTTAATGTGTCTCTTTGAGTCATGTTCCTT-3’ (SEQ ID NO:4);劃線部分為酶切位點(diǎn)；
[0048]表1 SNR84基因的PCR擴(kuò)增
[0049]

【權(quán)利要求】
1.一株快速發(fā)酵面包酵母菌株，是在酵母出發(fā)菌株中完全敲除葡萄糖磷酸變位酶基因PGM2的同時過表達(dá)H/ACA小核仁RNA的編碼基因SNR84獲得。
2.如權(quán)利要求1所述的一株快速發(fā)酵面包酵母菌株，其特征在于，所述出發(fā)菌株為面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616。
3.如權(quán)利要求1所述的一株快速發(fā)酵面包酵母菌株，其特征在于，所述PGM2基因其Gene ID為:855131，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ N0:1所示；所述SNR84基因其GeneID為:9164879，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ NO: 2所示。
4.一株快速發(fā)酵面包酵母菌株的制備方法，包括以下步驟: (1)PGM2基因的敲除 ①以質(zhì)粒pUC6為模板，PCR擴(kuò)增KanMX基因； ②將步驟(1)-①得到的PCR產(chǎn)物導(dǎo)入酵母出發(fā)菌株中，獲得KanMX替代敲除PGM2的重組菌株I ; ③用PGAP質(zhì)粒去除步驟(1)-②獲得菌株中的KanMX，獲得完全敲除PGM2的重組菌株2； (2)SNR84基因的過 表達(dá) ①以面包酵母CICC31616總DNA為模板，PCR擴(kuò)增SNR84基因； ②將步驟(2)-①得到的PCR產(chǎn)物連接到含有PGKl強(qiáng)啟動子的質(zhì)粒上，獲得表達(dá)質(zhì)粒I ; ③以表達(dá)質(zhì)粒I為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得SNR84基因和強(qiáng)啟動子的連接片段； ④將步驟(2)-③獲得的片段連接到帶有KanMX抗性的載體上，得到表達(dá)質(zhì)粒2； ⑤將步驟(2)-④獲得的表達(dá)質(zhì)粒2導(dǎo)入步驟(1)-③的重組菌株2中，獲得完全敲除PGM2同時過表達(dá)SNR84的重組菌株。
5.如權(quán)利要求4所述的一株快速發(fā)酵面包酵母菌株的制備方法，其特征在于，所述出發(fā)菌株為面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC31616。
6.如權(quán)利要求4所述的一株快速發(fā)酵面包酵母菌株的制備方法，其特征在于，所述含有PGKl強(qiáng)啟動子的質(zhì)粒為pUC質(zhì)粒。
7.如權(quán)利要求4所述的一株快速發(fā)酵面包酵母菌株的制備方法，其特征在于，所述帶有KanMX抗性的載體為Y印352載體。
8.如權(quán)利要求4所述的一株快速發(fā)酵面包酵母菌株的制備方法，其特征在于，所述基因片段和表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入酵母菌株的方法為醋酸鋰轉(zhuǎn)化法。
9.如權(quán)利要求1所述的快速發(fā)酵面包酵母菌株在快速發(fā)酵面包生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N1/19GK104073449SQ201410333534
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】張翠英, 肖冬光, 林雪, 董健, 柏曉雯, 宋海巖 申請人:天津科技大學(xué)