本發(fā)明涉及一種丁香酚組合液及制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
隨著食品安全的話題不斷受到關(guān)注，人們對(duì)食品的質(zhì)量有了更高的要求，不但要求營養(yǎng)，還要求綠色健康。為了方便食品運(yùn)輸貯藏，人們往往在食品中添加防腐劑，如苯甲酸、山梨酸及其鹽類、對(duì)羥基甲酸酯類、丙酸鹽、二氧化硫、亞硫酸及其鹽類、硝酸鹽及亞硝酸鹽類等，已經(jīng)被普遍應(yīng)用。長期使用化學(xué)防腐劑，導(dǎo)致致癌性、致突變性和致畸性等潛在安全問題時(shí)有發(fā)生，同時(shí)會(huì)對(duì)自然界的生態(tài)環(huán)境造成不利的影響。因此，尋找廣譜、高效、低毒、安全的食品防腐劑成為食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。
金黃色葡萄球菌是人類生活中最常接觸的一種細(xì)菌之一，它在自然界中可以說無處不在，是引起食品污染以及細(xì)菌性食物中毒的重要細(xì)菌之一，食品作坊以及食品加工工廠都希望對(duì)其避而遠(yuǎn)之，其所分泌的腸毒素(ses)是引起食物中毒的最主要因素。通過李彥媚等發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌對(duì)環(huán)境具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，其菌體細(xì)胞可耐受70℃的溫度1h，80℃下30min不能被殺死滅活，在溫度極低的環(huán)境下不被凍死照樣生存，其所分泌的腸毒素在100℃的高溫下煮沸30min還能夠保持其免疫活性和生物活性，所以，在日常的生活中，我們是比較難做到讓金黃色葡萄球菌遠(yuǎn)離我們的食物，儼然金黃色葡萄球菌已對(duì)人類健康與食品安全構(gòu)成威脅，據(jù)了解，近年來金黃色葡萄球菌造成的食品安全事例層出不窮，據(jù)美國疾控中心報(bào)告，在美國，金黃色葡萄球菌引起的食物中毒居第二位，僅次于大腸埃希菌，占細(xì)菌性食物中毒約33％，在加拿大約占45％，在一些歐洲國家如匈牙利、芬蘭則占食物中毒事件超過50％，特別是2000年發(fā)生的“雪印奶粉”事件，有14000多人受感染，所以我們更加期待一種更安全，天然的，無毒無害能夠克制金黃色葡萄球菌的食品添加劑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種能夠有效針對(duì)金黃色葡萄球菌的丁香酚組合液，可以使其更加廣泛地應(yīng)用到食品加工工藝、果蔬、糧油產(chǎn)品、奶制品、調(diào)味品等等領(lǐng)域當(dāng)中，讓其發(fā)揮更大作用，降低化學(xué)合成防腐劑的使用率，避免食品遭受細(xì)菌污染，保障食品安全衛(wèi)生和人類身體健康。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：1.一種丁香酚組合液，由以下體積份的原料組成：水99.8555％～99.9711％，吐溫80溶液0.01％～0.05％，丁香酚0.0189％～0.0945％。
制備上述丁香酚組合液的方法，包括步驟：向經(jīng)過高壓滅菌的、濃度為0.1％的吐溫80溶液中加入丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加水稀釋制得丁香酚組合液。
制得的丁香酚組合液可作為金黃色葡萄球菌的抑菌劑或殺菌劑；作為抑菌劑的丁香酚組合液優(yōu)選為吐溫80溶液含量為0.03％，丁香酚含量為0.0567％；作為殺菌劑的丁香酚組合液優(yōu)選為吐溫80溶液含量為0.035％，丁香酚含量為0.06615％。
本發(fā)明的有益效果是：
丁香酚組合液能抑制金黃色葡萄球菌生長，甚至丁香酚濃度更高時(shí)可作為殺菌劑使用。丁香酚組合液影響了金黃色葡萄球菌的sdh酶和mdh酶的分子結(jié)構(gòu)，使其發(fā)生了變化，從而改變了構(gòu)像，使酶活性降低。丁香酚組合液作用于金黃色葡萄球菌后，因?yàn)槠鸺?xì)胞透性的改變，使得與蛋白合成相關(guān)的核酸類物質(zhì)外泄，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成受到抑制，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
附圖說明
圖1是實(shí)施例10中空白對(duì)照樣與丁香酚組合液測定樣的對(duì)比圖；
圖2是實(shí)施例11中空白對(duì)照樣與丁香酚組合液測定樣的對(duì)比圖。
圖1中(a)對(duì)應(yīng)未經(jīng)丁香酚組合液處理的金黃色葡萄球菌；(b)-(f)分別對(duì)應(yīng)丁香酚組合液f、e、d、c、b；圖2中(a)對(duì)應(yīng)未經(jīng)丁香酚處理的金黃色葡萄球菌；(b)-(f)分別為丁香酚組合液f、e、d、c、b。
具體實(shí)施方式
下面通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例1：制備丁香酚組合液a
向50份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入94.5份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99855.5份水稀釋。
實(shí)施例2：制備丁香酚組合液b
向45份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入85.05份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99868.95份水稀釋。
實(shí)施例3：制備丁香酚組合液c
向40份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入75.6份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99884.4份水稀釋。
實(shí)施例4：制備丁香酚組合液d
向35份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入66.15份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99898.85份水稀釋。
實(shí)施例5：制備丁香酚組合液e
向30份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入56.7份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99913.3份水稀釋。
實(shí)施例6：制備丁香酚組合液f
向25份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入47.25份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99927.75份水稀釋。
實(shí)施例7：制備丁香酚組合液g
向20份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入37.8份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99942.2份水稀釋。
實(shí)施例8：制備丁香酚組合液h
向15份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入30.24份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加9954.76份水稀釋。
實(shí)施例9：制備丁香酚組合液i
向10份經(jīng)過高壓滅菌的吐溫80溶液中加入18.9份丁香酚，經(jīng)超聲波震蕩使丁香酚溶解，隨后將溶液通過0.22μl的一次性濾頭過濾滅菌，最后加99971.1份水稀釋。
實(shí)施例10：對(duì)金黃色葡萄球菌的mic測定
采用96孔板微量稀釋法和瓊脂平板稀釋法。取96孔板，第一列為空白對(duì)照樣，僅加入mh肉湯200μl。第2～10列為丁香酚組合液測定樣，首先，每列的第一個(gè)孔加入mh肉湯100μl，第2～5個(gè)孔加入100μl金黃色葡萄球菌懸液；然后在第2～10列的第1～5個(gè)孔分別加入丁香酚組合液,使每個(gè)孔最終比例分別符合丁香酚組合液a～i的配比，同時(shí)每個(gè)孔的菌濃度為5*105cfu/ml。同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照。37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。以陽性對(duì)照中細(xì)菌生長呈渾濁和空白對(duì)照透明為前提，觀察其他孔內(nèi)渾濁情況。按下列標(biāo)準(zhǔn)比較：0.無可見生長；1.輕微模糊；2.濁度明顯減少(約50％)；3.濁度輕微減少；4.濁度無明顯改變。本試驗(yàn)藥物取1.(輕微模糊)或2.(濁度明顯減少)為判定終點(diǎn)。同時(shí)，以620nm的波長在酶標(biāo)儀上讀取吸光度，以備計(jì)算。
以抑菌率為90％的濃度為mic，采用瓊脂平板稀釋法，取10μl菌懸液分別置于含丁香酚組合b、丁香酚組合c、丁香酚組合d，丁香酚組合e，丁香酚組合f的平板中，瓊脂未凝固前搖勻，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以平板未見菌落的最低藥物濃度為mic，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
實(shí)施例11：對(duì)金黃色葡萄球菌的mbc測定
以抑菌率為99％的濃度為mbc，從96孔板微量稀釋法未見細(xì)菌生長各孔,接種至無菌瓊脂，搖勻，37℃培養(yǎng)24h，未見菌落生長的為mbc，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
實(shí)施例12：丁香酚組合液對(duì)金黃色葡萄球菌體內(nèi)mdh和sdh酶活性的影響
將金黃色葡萄球菌接分別接入lb培養(yǎng)基和含丁香酚組合液e的lb培養(yǎng)基，150rpm震蕩培養(yǎng)24h，4000r/min離心培養(yǎng)液10min收集菌體，并用ph7.3的pbs緩沖液洗滌菌體3次，每組設(shè)置3個(gè)平行樣。加入與菌體等體積的2mg/ml的溶菌酶溶液，攪拌后置于37℃水浴鍋中，當(dāng)菌體開始發(fā)粘時(shí)取出，按照1ml菌體加6mlpbs緩沖液，10000r/min低溫離心10min,取出上清液備用。按照考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量，以小牛血清蛋白對(duì)照。按照試劑盒說明書方法進(jìn)行檢測。
測定mdh：340nm處進(jìn)行比色，雙蒸水調(diào)零后，加入50μl上清液，取已預(yù)溫好的1ml工作液迅速?zèng)_入0.5cm的石英比色皿中，于20s時(shí)讀吸光度od1值，反應(yīng)1min后，即80s讀取吸光度od2值，記錄δod＝od1值-od2值，空白對(duì)照取50μl雙蒸水，加入1ml工作液，其他操作與測定相同，于20s時(shí)讀吸光度a1值，反應(yīng)1min后，即80s讀取吸光度a2值，記錄記δa＝a1值-a2值以備計(jì)。
測定sdh：600nm處進(jìn)行比色，蒸餾水調(diào)零后，加入100μl上清液，取已預(yù)溫好的2.6ml工作液迅速?zèng)_入1cm的比色皿中，于5s時(shí)讀吸光度od1′值，反應(yīng)1min后，即65s,讀取吸光度od2′值，記錄δοd′＝od1′值-od2′值，以備計(jì)算。
結(jié)果：1)如圖1所示，與陽性對(duì)照相比，丁香酚組合液b、c、d、e、f對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用，其中最合適的比例為e，與瓊脂平板稀釋法一致，同時(shí)用96孔板法計(jì)算出來的抑菌率為90％；如圖2所示，在丁香酚組合b、c、d對(duì)金黃色葡萄球菌有殺菌作用，其中最適比例為丁香酚d，同時(shí)用96孔板法計(jì)算出來的抑菌率為99％。不同成分比例的丁香酚組合液作對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用存在依賴；
2)丁香酚組合液對(duì)金葡菌體內(nèi)mdh酶活力的影響：對(duì)照組培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的mdh酶活力17.151u/mgprot，丁香酚組培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的mdh為8.214u/mgprot，通過配對(duì)樣品t檢驗(yàn)分析，p＜0.01，說明丁香酚組合對(duì)照組的mdh酶活性具有極顯著差異；丁香酚組與對(duì)照組相比，細(xì)菌體內(nèi)mdh酶活性降低；
3)丁香酚組合液對(duì)金葡菌體內(nèi)sdh酶活力的影響：對(duì)照組培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的sdh酶活力為4.00u/ml，丁香酚組培養(yǎng)基中金黃色葡萄球菌的sdh為2.400u/ml，通過配對(duì)樣品t檢驗(yàn)分析，p<0.05，說明丁香酚組合對(duì)照組的sdh酶活性差異顯著；丁香酚組與對(duì)照組相比，細(xì)菌體內(nèi)sdh酶活性降低。
丁香酚組合液e能抑制金黃色葡萄球菌生長，能對(duì)金黃色葡萄球菌具有殺菌作用為丁香酚組合液d。從酶活力的角度分析，可能的作用機(jī)理是丁香酚組合液影響了這兩個(gè)酶的分子結(jié)構(gòu)，使其發(fā)生了變化，從而改變了構(gòu)像，使酶活性降低。最后，從丁香酚組合液對(duì)金葡菌蛋白濃度的影響結(jié)果表現(xiàn)，丁香酚組合液能夠抑制部分蛋白質(zhì)的合成。從蛋白質(zhì)合成的角度來分析作用機(jī)理，可能的作用機(jī)理是丁香酚組合液對(duì)蛋白質(zhì)作用于金黃色葡萄球菌后，因?yàn)槠鸺?xì)胞透性的改變，使得與蛋白合成相關(guān)的核酸類物質(zhì)外泄，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的合成受到抑制，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。