本發(fā)明涉及醫(yī)療保健領(lǐng)域，具體地涉及一種增強(qiáng)免疫力的組合物、其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
從生物學(xué)上來講，免疫力是指抵御疾病發(fā)生、發(fā)展的能力。免疫力是人體自身的防御機(jī)制，是人體識(shí)別和消滅外來侵入的任何異物(病毒、細(xì)菌等)，處理衰老、損傷、死亡、變性的自身細(xì)胞以及識(shí)別和處理體內(nèi)突變細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的能力。我們時(shí)常說，如果免疫力低下，就容易罹患疾病，中醫(yī)則認(rèn)為“正氣存內(nèi)，邪不可干”，所謂“正氣”即為免疫能力。其實(shí)，中醫(yī)更注重平衡，現(xiàn)代免疫學(xué)研究中經(jīng)常引用“陰陽(yáng)”的概念，以說明免疫分子之間相互制約平衡關(guān)系；某一方或一種免疫因子表達(dá)過多或不足，則打亂免疫平衡，造成機(jī)體損害與疾病發(fā)生。而中醫(yī)認(rèn)為健康的狀態(tài)為“陰平陽(yáng)秘”，而一方過于亢進(jìn)，機(jī)體內(nèi)部各系統(tǒng)之間紊亂，則導(dǎo)致疾病，所謂“亢則害，承乃制”。因此，免疫重在調(diào)節(jié)，中醫(yī)重在調(diào)理，一個(gè)“調(diào)”字，均是強(qiáng)調(diào)使紊亂狀態(tài)歸于平衡。
免疫力低下的主要影響因素：1)年齡因素：人生有兩個(gè)免疫能力低下的階段，即兒童階段和老年階段。兒童的免疫系統(tǒng)尚未成熟，功能不健全，免疫力低下；而老年機(jī)體器官功能衰退、獲得營(yíng)養(yǎng)能力下降，再加之免疫器官逐漸萎縮衰退，導(dǎo)致免疫力下降，與此相對(duì)應(yīng)，兒童和老人也是疾病高發(fā)的兩個(gè)階段。2)不良的生活方式和習(xí)慣：精神緊張、營(yíng)養(yǎng)不良、缺乏運(yùn)動(dòng)或睡眠不足，濫用酒精和吸煙等，都可能抑制免疫系統(tǒng)，降低機(jī)體免疫力。3)其他因素：環(huán)境中的有毒物質(zhì)、某些藥物、放射治療以及過量的抗生素也會(huì)抑制免疫系統(tǒng)。通過對(duì)導(dǎo)致免疫力低下的主要原因的分析，不難看出老年人及受社會(huì)因素和不良的生活方式影響而處于亞健康狀態(tài)的人群是免疫力低下的主要易感人群。
免疫力低下是現(xiàn)代人普遍存在的一種亞健康狀態(tài)，是多數(shù)感染類疾病的誘因，嚴(yán)重影響著人們的身體健康。截至2004年底，中國(guó)60歲以上老人有1.4億，占全國(guó)總?cè)丝诘慕?1％；65歲以上的老人為9680萬(wàn)，占全國(guó)總?cè)丝诘?.6％。中國(guó)老年人口的數(shù)量比很多國(guó)家的總?cè)丝谶€要多得多。而且，從人口發(fā)展趨勢(shì)來看，中國(guó)老齡化最高峰還沒到來，大約在2030至2040年之間，那時(shí)老年人口將有可能占到全國(guó)總?cè)丝诘?5～28％。2012年國(guó)家人口計(jì)生委稱，到2050年我國(guó)65歲以上老人將達(dá)到3.6億，人口老齡化速度快、規(guī)模大，問題嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每年有600萬(wàn)人被懷疑處于亞健康狀態(tài)，年齡多在20～45歲之間，有14％的成年男性和20％的婦女表現(xiàn)有明顯的疲勞，其中1/8發(fā)展為cfs(慢性疲勞綜合征)。日本國(guó)立公共衛(wèi)生院做的一次調(diào)查研究顯示，在全國(guó)5000余名15～65歲人士中，表示真正感到“非常疲勞”的竟高達(dá)60％，其中因工作量大、家務(wù)重、精神緊張的占44％，還有36％說不出原因。據(jù)2002年4月8日“21世紀(jì)中國(guó)亞健康市場(chǎng)學(xué)術(shù)成果研討會(huì)”提供的有關(guān)統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國(guó)約有15％的人是健康的，15％的人非健康，70％的人呈亞健康狀態(tài)，亞健康人數(shù)超過9億。
綜上所述，免疫力低下人群的數(shù)量是相當(dāng)龐大的，因此開發(fā)具有增強(qiáng)免疫力保健功能的產(chǎn)品是非常有必要的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種增強(qiáng)免疫力的組合物，其中所述組合物由鐵皮石斛凍干粉、黃芪提取物、以及任選的藥學(xué)上可接受的輔料組成。
在本發(fā)明的組合物中，鐵皮石斛凍干粉與黃芪提取物的重量份數(shù)之比優(yōu)選為500∶50～100，更優(yōu)選為500∶60～90，進(jìn)一步優(yōu)選為500∶70～80，最優(yōu)選為500∶75。
根據(jù)本發(fā)明組合物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述組合物由重量份數(shù)之比為500∶75∶425的鐵皮石斛凍干粉、黃芪提取物、藥學(xué)上可接受的輔料，再添加適量的潤(rùn)濕劑制成。
在本發(fā)明的組合物中，所述藥學(xué)上可接受的輔料選自固體分散載體、異麥芽酮糖醇、三氯蔗糖、硬脂酸鎂、微晶纖維素、預(yù)膠化淀粉或羧甲基纖維素鈉中的一種或幾種。
優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物通過將鐵皮石斛凍干粉、黃芪提取物、固體分散載體混合，經(jīng)固體分散工藝制備而得。更優(yōu)選地，所述固體分散載體選自pvpk30、peg-6000、泊洛沙姆-188、右旋糖酐、山梨醇、去氧膽酸或乙基纖維素中的一種或多種。
進(jìn)一步優(yōu)選，鐵皮石斛凍干粉和黃芪提取物的總質(zhì)量與固體分散載體的質(zhì)量百分比為80～99％∶1～20％，優(yōu)選為85～95％∶5～15％，進(jìn)一步優(yōu)選為90％∶10％。
可以在本發(fā)明的組合物中添加藥學(xué)上可接受的輔料，制成膠囊劑、片劑、顆粒劑、微丸劑等固體口服制劑。
在本發(fā)明所述的藥學(xué)上可接受的輔料中，為了改善口感，可以選擇異麥芽糖醇和三氯蔗糖作為甜味劑。異麥芽酮糖醇為無氣味、白色、結(jié)晶狀糖醇，不吸濕，甜味純正，甜度為蔗糖的50～60％，有遮蔽苦味的作用，低熱卡，熱值僅為蔗糖的50％，熱穩(wěn)定性好，對(duì)酸、堿穩(wěn)定，各種微生物很難利用，不致齲齒。異麥芽酮糖醇又稱帕拉金糖醇，國(guó)外稱益壽糖，是近年來國(guó)際上新興的功能性食用糖醇，是一種理想的代糖品。三氯蔗糖是我國(guó)批準(zhǔn)使用的甜味劑。其甜度約為蔗糖的600倍，甜味純正，甜味特性與甜味質(zhì)量和蔗糖十分相似。在一般食品加工和儲(chǔ)存過程中都非常穩(wěn)定，水溶性很好。gb2760規(guī)定三氯蔗糖的最大使用劑量為1.5g/kg。因此，選擇異麥芽酮糖醇和三氯蔗糖為甜味劑。
本發(fā)明還提供一種如上所述的組合物在制備增強(qiáng)免疫力的產(chǎn)品例如具有提高免疫力功能的保健食品、功能性普通食品或特殊醫(yī)學(xué)食品或特殊膳食食品中的用途。
本發(fā)明還提供一種增強(qiáng)免疫力的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括如本發(fā)明所述的組合物。
鐵皮石斛、黃芪均為傳統(tǒng)提高免疫力的藥食同源物質(zhì)，本發(fā)明采用鐵皮石斛凍干粉和黃芪提取物，按特定比例配伍，保留了全營(yíng)養(yǎng)及功能成分，使生物利用度得以提高，保健功能協(xié)同，從而達(dá)到提高免疫力技術(shù)效果。
本發(fā)明還提供一種制備本發(fā)明所述的組合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
(1)將干凈新鮮的鐵皮石斛切成小段，然后在-80℃～-70℃的溫度下冷凍干燥至水分含量≤10％，得到凍干品；將凍干品超微粉碎至800～1000目，即得鐵皮石斛凍干粉；
(2)將干黃芪粉碎，然后將得到的黃芪粉用體積百分比濃度為70～80％的乙醇水溶液滲漉，得到乙醇提取液；藥渣用80℃～95℃的水提取，得到水提取液；將乙醇提取液和水提取液合并，濃縮、干燥得到黃芪提取物；
(3)將鐵皮石斛凍干粉、黃芪提取物以及任選的藥學(xué)上可接受的輔料混合，得到所述組合物。
優(yōu)選地，在本發(fā)明方法的步驟(2)中，所述水提取的條件為：料液比為按質(zhì)量體積(kg/l)計(jì)1∶10，共提取三次，每次提取1.5～2小時(shí)。
優(yōu)選地，在本發(fā)明方法的步驟(3)中，所述藥學(xué)上可接受的輔料選自固體分散載體、異麥芽酮糖醇、三氯蔗糖、硬脂酸鎂、微晶纖維素、預(yù)膠化淀粉或羧甲基纖維素鈉中的一種或幾種；更優(yōu)選地，所述固體分散載體選自pvpk30、peg-6000、泊洛沙姆-188、右旋糖酐、山梨醇、去氧膽酸、乙基纖維素中的一種或多種。
根據(jù)本發(fā)明的方法，步驟(3)的操作過程如下：用體積百分比濃度為70％的乙醇水溶液溶解固體分散載體，然后加入鐵皮石斛凍干粉和黃芪提取物，充分研磨后蒸去溶劑，干燥即得。
根據(jù)本發(fā)明的方法，所述方法還包括將所述組合物制成片劑、顆粒劑、膠囊劑或微丸劑的步驟。
本發(fā)明采用了冷凍干燥技術(shù)，確保鐵皮石斛的營(yíng)養(yǎng)、功能成分的最大限度地保留，采用超微破壁粉碎至800～1200目，可以改善營(yíng)養(yǎng)及功能成分溶解性能，提高溶出速率，確保營(yíng)養(yǎng)及功能成分充分暴露，從而達(dá)到提高生物利用度的目的。黃芪采用不同溶劑分層提取，可以針對(duì)黃芪中的氨基酸、皂苷、黃酮、多糖等成分的理化性質(zhì)，確保全營(yíng)養(yǎng)及功能成分的全面轉(zhuǎn)移、保留；黃芪提取物可以發(fā)揮多組分、多靶點(diǎn)的協(xié)同作用，達(dá)到全面提高人體免疫力的目的。本發(fā)明通過將特定的鐵皮石斛凍干粉與黃芪提取物按特定的比例制備成相應(yīng)的組合物，可以顯著增強(qiáng)人體免疫力。
本發(fā)明還使用了固體分散技術(shù)，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)勢(shì)：(1)混合均勻、計(jì)量準(zhǔn)確；(2)顯著提高石斛、黃芪營(yíng)養(yǎng)及功能成分穩(wěn)定性和生物利用度；(3)掩蓋黃芪提取物不良口感；(4)利于制劑成型。
本發(fā)明的保健食品以鐵皮石斛和黃芪提取物為主要原料，這兩種原料不在“十八反”、“十九畏”之列，無配伍禁忌。鐵皮石斛自古以來就有“藥中黃金”之美譽(yù)，民間稱其為“救命仙草”。其味甘，性微寒。歸胃、腎經(jīng)。具有益胃生津，滋陰清熱的功效。黃芪古代寫作黃耆，李時(shí)珍在《本草綱目》中釋其名曰：“耆，長(zhǎng)也。黃耆色黃，為補(bǔ)藥之長(zhǎng)，故名?！逼湮陡?，性微溫。歸肺、脾經(jīng)。具有補(bǔ)氣升陽(yáng)，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血，形滯痛痹，托毒排膿，斂瘡生肌的功效。兩者配伍，相輔相成，達(dá)到扶正祛邪、增強(qiáng)免疫力之功效。
經(jīng)保健食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的組合物安全、無毒，可長(zhǎng)期服用。經(jīng)動(dòng)物功能試驗(yàn)證明，本發(fā)明的組合物具有增強(qiáng)免疫力的保健功能；經(jīng)衛(wèi)生學(xué)、穩(wěn)定性、功效成分試驗(yàn)證實(shí)，本發(fā)明的組合物質(zhì)量穩(wěn)定、可控，劑型合理。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)的說明。
實(shí)施例1
鐵皮石斛凍干粉的制備
(1)選取新鮮鐵皮石斛，除雜，切成小段，然后在冷凍器中、-80℃～-70℃的溫度下冷凍干燥8～15小時(shí)，水分含量降至≦10％，得到凍干品；將凍干品超微粉碎，過800目篩，即得鐵皮石斛凍干粉，備用。
實(shí)施例2
黃芪提取物的制備
將干黃芪粉碎，然后將黃芪粉用體積百分比濃度為70％的乙醇水溶液滲漉，得到乙醇提取液；藥渣用80℃的水提取，料液比(質(zhì)量體積比，kg/l)為1∶10，共提取三次，每次提取1.5～2小時(shí)，得水提取液；將乙醇提取液和水提取液混合，在85℃～95℃的溫度下減壓濃縮、干燥得到黃芪提取物。
實(shí)施例3
鐵皮石斛凍干粉、黃芪提取物組合物的制備
(1)配料：按質(zhì)量份數(shù)比500∶75分別稱取鐵皮石斛凍干粉和黃芪提取物；按鐵皮石斛凍干粉和黃芪提取物總重量的10％稱取固體分散載體pvpk30。
(2)混合：將鐵皮石斛凍干粉、黃芪提取物和固體分散載體混合均勻。
(3)固體分散：向步驟(2)所得的混合物中加入適量的潤(rùn)濕劑，使其分散完全，即得組合物。
實(shí)施例4
鐵皮石斛咀嚼片的制備
片劑選擇濕法制粒的工藝路線，主要工序包括粉碎、過篩、稱量、混合、制軟材、制粒、干燥、整粒、壓片、內(nèi)包裝、外包裝、檢驗(yàn)入庫(kù)等。
輔料種類及用量篩選
由于是咀嚼片，口感是篩選輔料時(shí)的一個(gè)重要因素。在本實(shí)施例中，選擇異麥芽酮糖醇和三氯蔗糖為甜味劑。
在原料種類及用量已確定的基礎(chǔ)上，鐵皮石斛日服用2g，黃芪提取物日服用0.3g，通過對(duì)原料口感的判斷及工藝的要求，設(shè)計(jì)片的規(guī)格的為1.0g/片，每天服用4片，則活性原料占配方總質(zhì)量的比例為57.5％(其中鐵皮石斛占50％，黃芪占7.5％)，輔料占42.5％(其中異麥芽酮糖醇：38.44％，三氯蔗糖：0.06％，聚維酮k30：3.0％，硬脂酸鎂：1.0％)。本實(shí)施例以體積百分比濃度為50％的乙醇水溶液為潤(rùn)濕劑進(jìn)行制粒，考察顆粒的成型性等指標(biāo)，結(jié)果如下表1所示。
表1
結(jié)果顯示，顆粒成型性較好，口感適宜，休止角符合要求，因此輔料用量定為異麥芽酮糖醇38.44％、三氯蔗糖0.06％，聚維酮k303.0％，硬脂酸鎂1.0％，并以體積百分比濃度為50％的乙醇水溶液為潤(rùn)濕劑，制粒時(shí)將聚維酮k30、三氯蔗糖溶解于乙醇中，每100g混合粉加入體積百分比濃度為50％乙醇水溶液30ml。
三批中試數(shù)據(jù)見下表2。
表2
由中試數(shù)據(jù)可以看出，工藝切實(shí)可行；從成品率來看，工藝重現(xiàn)性較好。證明了工藝的穩(wěn)定性，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
實(shí)施例5
鐵皮石斛咀嚼片的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)
1.材料與方法
1.1樣品
本實(shí)驗(yàn)設(shè)以實(shí)例1至4制備得到的鐵皮石斛凍干粉，黃芪提取物，鐵皮石斛黃芪組合物及鐵皮石斛咀嚼片分設(shè)以下試驗(yàn)樣品。
試驗(yàn)樣品1：鐵皮石斛、黃芪組合物
試驗(yàn)樣品2：鐵皮石斛咀嚼片
對(duì)照樣品1：鐵皮石斛凍干粉
對(duì)照樣品2：黃芪提取物
本試驗(yàn)樣品依據(jù)受試樣品的人體推薦劑量為4.0g/人/日(以60kg體重計(jì))，按人體推薦劑量的10倍每天給予小鼠0.67g/kg·bw/d的上述四個(gè)試驗(yàn)樣品持續(xù)一個(gè)月，進(jìn)行小鼠細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能及nk細(xì)胞活性測(cè)定。
1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
選用spf級(jí)ci/f1代健康雌性小鼠200只，體重為18.0～21.9g。
小鼠按體重隨機(jī)分為i、ii、iii、iv、v五個(gè)大組，每大組40只小鼠，分成4個(gè)樣品組，每個(gè)樣品組10只。其中i組小鼠進(jìn)行cona誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、nk細(xì)胞活性試驗(yàn)；ii組小鼠進(jìn)行耳廓腫脹試驗(yàn)；iii組小鼠進(jìn)行抗體生成細(xì)胞檢測(cè)和半數(shù)溶血值hc50的測(cè)定；iv組小鼠進(jìn)行小鼠碳廓清試驗(yàn)；v組小鼠進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)。
試驗(yàn)動(dòng)物在溫度為20～25℃、相對(duì)濕度為40％～70％的屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)。
1.3受試物給予方式
受試樣品用無菌水配制，每組樣品的配制濃度都為67mg/ml，經(jīng)口每日一次給予小鼠相應(yīng)受試物，小鼠灌胃量為0.1ml/10g·bw。連續(xù)灌胃一個(gè)月后測(cè)定各項(xiàng)增強(qiáng)免疫力功能指標(biāo)。
2.試驗(yàn)方法
2.1cona誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)——mtt法
各劑量組動(dòng)物連續(xù)灌胃一個(gè)月后，頸推脫臼法處死動(dòng)物，無菌取脾，置于盛有適量無菌hank's液的小平皿中，研磨脾臟，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用hank's液洗2次，每次離心10min(1000r/min)，然后將細(xì)胞懸浮于1mlrpmi1640完全培養(yǎng)液中，臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(均在95％以上)，用rpmi1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×l06個(gè)/ml。將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，一孔加75μlcona液(100μg/ml)，另一孔作為對(duì)照，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔輕輕吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的rpmi1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入mtt(5mg/ml)50μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。將溶解液移入96孔培養(yǎng)板中，每孔做三個(gè)平行孔，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)570nm下測(cè)定各孔吸光度值。
淋巴細(xì)胞增殖能力＝加cona的光密度值－不加cona的光密度值
用加cona孔的光密度值減去不加cona孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力，如受試樣品組的光密度差值顯著高于對(duì)照組的光密度差值，則可判定該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。反之則反。
2.2dnfb誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(dth)——耳腫脹法
各劑量組動(dòng)物連續(xù)灌胃一個(gè)月后，每鼠用剃毛機(jī)將腹部毛剃去，范圍約3cm×3cm，用10mg/mldnfb溶液50μl均勻涂抹致敏。5日后用10mg/mldnfb溶液l0μl均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)進(jìn)行攻擊，攻擊后24h頸推脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼，用打孔器取下直徑8mm耳片，稱重。
耳重差(mg)＝右耳重(mg)－左耳重(mg)
用左右耳重量之差表示dth的程度。若受試樣品組的重量差值顯著高于對(duì)照組的重量差值，則可判定該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。反之則反。
2.3抗體生成細(xì)胞檢測(cè)——jerne改良玻片法
各劑量組動(dòng)物連續(xù)灌胃一個(gè)月后，每只鼠腹腔注射2％(v/v)的srbc懸液0.2ml進(jìn)行免疫，4d后小鼠頸推脫臼處死，取出脾臟，放在盛有適量無菌hank's液的小平皿中，研磨脾臟，制成細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，離心(1000r/min)10min，用hank's液洗2遍，最后將細(xì)胞懸浮于5mlrpmi1640培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，用rpmi1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為5×l06個(gè)/ml。將表層培養(yǎng)基加熱溶解后，放45℃水浴保溫，與等量ph7.2～7.4兩倍濃度的hank's液混合，分裝小試管，每管0.5ml，再向管內(nèi)加10％srbc(v/v，用sa緩沖液配制)50μl，20μl脾細(xì)胞懸液(5×l06個(gè)/ml)，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做兩個(gè)平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入37℃、5％co2培養(yǎng)箱中孵育1.5h，然后將制備好的補(bǔ)體1∶8稀釋后加入到玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)孵育1.5h后，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。
溶血空斑數(shù)＝溶血空斑計(jì)數(shù)×10
用空斑數(shù)/106脾細(xì)胞來表示，如果受試樣品組的空斑數(shù)顯著高于對(duì)照組的空斑數(shù)，則可判定該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。反之則反。
2.4血清溶血素測(cè)定——半數(shù)溶血值(hc50)
各劑量組動(dòng)物連續(xù)灌胃一個(gè)月后，制備2％(v/v)的srbc懸液，每只鼠腹腔注射0.2ml進(jìn)行免疫，4d后小鼠眼底靜脈叢取血于離心管內(nèi)，放置lh，2000r/min離心l0min，分離并收集血清。血清200倍稀釋后，按檢驗(yàn)方法測(cè)定樣品管及srbc半數(shù)溶血時(shí)的光密度值。溶血素的量以半數(shù)溶血值(hc50)表示。
溶血素的量以半數(shù)溶血值(hc50)表示，如果受試樣品組的hc50顯著高于對(duì)照組的hc50，則可判定該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。反之則反。
2.5小鼠碳廓清試驗(yàn)
各劑量組動(dòng)物連續(xù)灌胃一個(gè)月后，每鼠尾靜脈注入4倍稀釋的印度墨汁(0.1ml/10g·bw)，待墨汁注入，立即計(jì)時(shí)。注入墨汁后2min及10min分別從眼內(nèi)眥靜脈叢取血20μl，并將其加到2ml0.1％na2co3溶液中，用酶標(biāo)儀在600nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值，并取胸腺、肝、脾稱重，利用光密度值、肝重和脾重計(jì)算吞噬指數(shù)a。另計(jì)算胸腺/體比、脾/體比。
以吞噬指數(shù)a表示小鼠碳廓清的能力。如果受試樣品組的吞噬指數(shù)a顯著高于對(duì)照組的吞噬指數(shù)a，則可判定該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。反之則反。
2.6小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)——半體內(nèi)法
各劑量組動(dòng)物連續(xù)灌胃一個(gè)月后，制備20％(v/v)的雞紅細(xì)胞懸液，每只鼠腹腔注射1ml，間隔30min，頸推脫臼處死小鼠，將其仰位固定于鼠板上，正中剪開腹壁皮膚，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2ml，轉(zhuǎn)動(dòng)鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，移置37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30min，然后，于生理鹽水中漂洗，晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定，4％(v/v)giemsa-磷酸緩沖液染色3min，再用蒸餾水漂洗晾干，封片，光鏡下觀察。
如果受試樣品組的吞噬百分率或吞噬指數(shù)與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則可判定該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。反之則反。
2.7nk細(xì)胞活性測(cè)定——乳酸脫氫酶測(cè)定法
各劑量組動(dòng)物連續(xù)灌胃一個(gè)月后，頸推脫白處死小鼠，無菌取脾，置于盛有適量無菌hank's液的小平皿中，研磨脾臟，制成單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用hank's液洗2次，每次離心10min(1000r/min)，棄上清將細(xì)胞漿彈起，加入0.5ml滅菌水20秒，裂解紅細(xì)胞后再加入0.5ml2倍hank's液及8mlhank's液，離心10min(1000r/min)，用含10％小牛血清rpmi1640完全培養(yǎng)液重懸，1％冰乙酸稀釋后計(jì)數(shù)，臺(tái)酚蘭染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)(均在95％以上)，用rpmi1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×l07個(gè)/ml。
試驗(yàn)前24h將靶細(xì)胞(yac-1細(xì)胞)傳代培養(yǎng)，應(yīng)用前以hank's液洗3次，用rpmi1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×l05個(gè)/ml。取yac-1細(xì)胞和脾細(xì)胞各100μl(效靶比50∶1)加入u型96孔培養(yǎng)板中，yac-1細(xì)胞自然釋放孔加yac-1細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μl，yac-1細(xì)胞最大釋放孔加yac-1細(xì)胞和2.5％triton各100μl，上述各項(xiàng)均設(shè)三個(gè)平行孔，于37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min，每孔吸取上清液100μl置平底96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入ldh基質(zhì)液100μl，反應(yīng)10min，每孔加入1mol/l的hcl30μl，在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定光密度值。
如果受試樣品組的nk細(xì)胞活性顯著高于對(duì)照組的nk細(xì)胞活性，則可判定該項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。反之則反。
2.8試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)：用spss10.0軟件對(duì)各試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊要求的數(shù)據(jù)資料，用單因素方差分析方法中多個(gè)試驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理；對(duì)非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。
2.9結(jié)果判定：在細(xì)胞免疫功能(cona誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，dnfb誘導(dǎo)小鼠dth)、體液免疫功能(抗體生成細(xì)胞檢測(cè)，血清溶血素測(cè)定)、單核-巨噬細(xì)胞功能(小鼠碳廓清，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞)、nk細(xì)胞活性四個(gè)方面只需任兩個(gè)方面結(jié)果陽(yáng)性，可判定該受試樣品具有增強(qiáng)免疫力功能作用。
3.結(jié)果
試驗(yàn)過程中動(dòng)物飲水?dāng)z食正常，外觀無異常。各試驗(yàn)樣品小鼠的初始體重之間無顯著差異。經(jīng)灌胃飼養(yǎng)一月后，各個(gè)試驗(yàn)樣品組小鼠的終末體重也無明顯差異。
3.1受試品對(duì)cona誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響
經(jīng)口給予小鼠相同劑量的不同受試樣品一個(gè)月后，用mtt法進(jìn)行cona誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，計(jì)算加cona孔與不加cona孔吸光度的差值，并對(duì)其進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法中多個(gè)試驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。由表3結(jié)果可見，試驗(yàn)品與對(duì)照品比較，試驗(yàn)品加cona孔與不加cona孔吸光度的差值明顯高于對(duì)照品，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)樣品1與試驗(yàn)樣品2之間比較，加cona孔與不加cona孔吸光度的差值無明顯差異。
表3
3.2受試品對(duì)dnfb誘導(dǎo)小鼠dth的影響
經(jīng)口給予小鼠同劑量的不同受試樣品一個(gè)月后，用耳腫脹法進(jìn)行dnfb誘導(dǎo)小鼠dth實(shí)驗(yàn)，計(jì)算耳殼增重，并對(duì)其進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，不滿足方差齊性要求，用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。由表4結(jié)果可見，試驗(yàn)品耳殼增重高于對(duì)照品，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)樣品1與試驗(yàn)樣品2之間比較，耳殼增重?zé)o顯著差異。
表4
3.3受試品對(duì)小鼠抗體生成細(xì)胞(溶血空斑數(shù))的影響
經(jīng)口給予小鼠同劑量的不同受試樣品一個(gè)月后，用jerne改良玻片法進(jìn)行小鼠抗體生成細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，計(jì)算溶血空斑數(shù)，并對(duì)其進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法中多個(gè)試驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。由表5結(jié)果可見，試驗(yàn)品小鼠溶血空斑數(shù)高于對(duì)照品，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)品1與試驗(yàn)品2比較，小鼠溶血空斑數(shù)無顯著差異。
表5
3.4受試品對(duì)小鼠血清半數(shù)溶血值(hc50)的影響
經(jīng)口給予小鼠同劑量的不同受試樣品一個(gè)月后，用半數(shù)溶血值法測(cè)定小鼠的血清半數(shù)溶血值(hc50)，并對(duì)其進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法中多個(gè)試驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。由表6結(jié)果可見，試驗(yàn)品小鼠血清半數(shù)溶血值(hc50)明顯高于對(duì)照品，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。試驗(yàn)品1與試驗(yàn)品2比較，小鼠血清半數(shù)溶血值無顯著差異。
表6
3.5受試品對(duì)小鼠碳廓清能力的影響
經(jīng)口給予小鼠同劑量的不同受試樣品一個(gè)月后，進(jìn)行小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)，計(jì)算吞噬指數(shù)a，并對(duì)其進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法中多個(gè)試驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。由表7結(jié)果可見，試驗(yàn)品小鼠吞噬指數(shù)a與對(duì)照品比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)樣品1與試驗(yàn)樣品2比較，小鼠吞噬指數(shù)a無顯著差異。
表7
3.6受試品對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬百分率及吞噬指數(shù)的影響
經(jīng)口給予小鼠同劑量的不同受試樣品一個(gè)月后，用半體內(nèi)法進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，計(jì)算吞噬指數(shù)及吞噬百分率，并將吞噬百分率經(jīng)sin-1p1/2(p為吞噬百分率，用小數(shù)表示)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，吞噬百分率和吞噬指數(shù)滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法中多個(gè)試驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。由表8結(jié)果可見，試驗(yàn)品吞噬百分率及吞噬指數(shù)與對(duì)照品比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)品1與試驗(yàn)品2比較吞噬百分率及吞噬指數(shù)無顯著差異。
表8
3.7受試品對(duì)小鼠nk細(xì)胞活性的影響
經(jīng)口給予小鼠同劑量的不同受試品一個(gè)月后，用乳酸脫氫酶測(cè)定法進(jìn)行小鼠nk細(xì)胞活性測(cè)定，將nk細(xì)胞活性經(jīng)sin-1p1/2(p為nk細(xì)胞活性，用小數(shù)表示)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性要求，用單因素方差分析方法中多個(gè)試驗(yàn)組與一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。由表9結(jié)果可見，試驗(yàn)品nk細(xì)胞活性高于對(duì)照品，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)品1與試驗(yàn)品2比較無顯著差異。
表9
通過以上試驗(yàn)研究，結(jié)果顯示鐵皮石斛咀嚼片及鐵皮石斛、黃芪組合物具有以下功能優(yōu)越性：
(1)細(xì)胞免疫功能：cona誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，試驗(yàn)品加cona孔與不加cona孔吸光度的差值高于對(duì)照品，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；dnfb誘導(dǎo)小鼠dth試驗(yàn)中，試驗(yàn)品耳殼增重高于對(duì)照品，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。此項(xiàng)為陽(yáng)性。
(2)體液免疫功能：抗體生成細(xì)胞檢測(cè)試驗(yàn)中，試驗(yàn)品小鼠溶血空斑數(shù)高于對(duì)照品，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；小鼠血清半數(shù)溶血值試驗(yàn)中，試驗(yàn)品小鼠血清半數(shù)溶血值(hc50)高于對(duì)照品，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。此項(xiàng)為陽(yáng)性。
(3)單核-巨噬細(xì)胞功能：碳廓清試驗(yàn)中，試驗(yàn)品小鼠吞噬指數(shù)a與對(duì)照品比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；雞紅細(xì)胞吞噬試驗(yàn)中，試驗(yàn)品吞噬百分率及吞噬指數(shù)與對(duì)照品比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。此項(xiàng)為陰性。
(4)nk細(xì)胞活性：小鼠nk細(xì)胞活性測(cè)定試驗(yàn)中，試驗(yàn)品nk細(xì)胞活性高于對(duì)照品，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。此項(xiàng)為陽(yáng)性。
根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》之增強(qiáng)免疫力功能試驗(yàn)的結(jié)果判定，在本試驗(yàn)條件下鐵皮石斛、黃芪組合物及鐵皮石斛咀嚼片具有比單純的鐵皮石斛凍干粉或黃芪提取物更好的增強(qiáng)免疫力功能。
(5)通過兩個(gè)試驗(yàn)樣品的數(shù)據(jù)對(duì)比可知，鐵皮石斛、黃芪組合物與其制劑鐵皮石斛咀嚼片在增強(qiáng)免疫力功能的作用上無明顯差異。