本發(fā)明涉及飼料添加劑領(lǐng)域,尤其是涉及一種含不同來(lái)源脂肪酶的飼料添加劑及這種飼料添加劑在黃羽肉雞飼料中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：油脂飼料具有代謝能值高的特點(diǎn)，其能值是碳水化合物和蛋白質(zhì)的2.25倍，是養(yǎng)雞專業(yè)戶進(jìn)行肉雞標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)飼養(yǎng)時(shí)日糧中不可缺少的重要原料之一，因此，養(yǎng)殖戶都會(huì)在肉雞飼料中添加一定比例的油脂，以滿足肉雞的生長(zhǎng)需要，畜禽日糧中添加油脂已成為提高高能營(yíng)養(yǎng)的技術(shù)途徑之一。然而，近幾年來(lái)，能量飼料原料尤其是油脂的價(jià)格在不斷攀升，如何提高飼料中能量的利用率，減少油脂添加量，降低飼料成本，提高養(yǎng)殖效益，同時(shí)減少高油脂對(duì)畜禽帶來(lái)的一系列的影響和危害日益成為養(yǎng)殖企業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)。脂肪酶，作為代謝脂肪最基本的酶，若缺乏將會(huì)造成脂肪消化不良機(jī)體紊亂等現(xiàn)象危及機(jī)體健康。單胃動(dòng)物自身能夠分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等內(nèi)源性消化酶，但幼齡動(dòng)物消化機(jī)制尚未發(fā)育健全，內(nèi)源脂肪酶分泌不足。當(dāng)內(nèi)源胰脂肪酶和膽汁酸分泌量不足時(shí)，脂肪則不能被畜禽機(jī)體充分利用，從而導(dǎo)致脂肪的浪費(fèi)和損失，同時(shí)，脂肪的不完全利用也會(huì)帶來(lái)多種不良癥狀，如營(yíng)養(yǎng)性腹瀉和脂肪肝，影響肉雞的健康生長(zhǎng)及養(yǎng)殖綜合效益。為解決上述問(wèn)題，有學(xué)者嘗試將脂肪酶作為飼料添加劑添加到肉雞日糧中，補(bǔ)充幼齡動(dòng)物內(nèi)源脂肪酶分泌不足，以達(dá)到提高肉雞對(duì)油脂利用率的目的。但是，在反復(fù)試驗(yàn)過(guò)程中效果不甚理想，回腸內(nèi)微生物的種類并沒(méi)有明顯增加，肉禽營(yíng)養(yǎng)性腹瀉并沒(méi)有明顯改善，分析可能的原因之一是飼喂肉雞的脂肪酶來(lái)源單一，不能完全分解利用不同類型的油脂，導(dǎo)致無(wú)法滿足肉雞對(duì)脂肪酸的需求。如何添加不同來(lái)源脂肪酶以達(dá)到提高油脂利用率，降低養(yǎng)殖成本，提高養(yǎng)殖綜合效益的目的，成為人們普遍關(guān)注的熱點(diǎn)之一。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明向社會(huì)提供一種能夠明顯增加黃羽肉雞回腸內(nèi)微生物種類的多樣性，提高黃羽肉雞對(duì)油脂的消化率，從而達(dá)到減輕肉雞營(yíng)養(yǎng)性腹瀉的含不同來(lái)源脂肪酶的飼料添加劑。本發(fā)明還提供一種能夠明顯增加黃羽肉雞回腸內(nèi)微生物種類的多樣性的、增強(qiáng)黃羽肉雞對(duì)油脂的消化率、從而達(dá)到減輕肉雞營(yíng)養(yǎng)性腹瀉的肉雞飼料。本發(fā)明的技術(shù)方案是：提供一種含不同來(lái)源脂肪酶的飼料添加劑，由下述重量百分比的組分組成：雞胰脂肪酶40%-60%，黑曲霉脂肪酶40%-60%。作為對(duì)本發(fā)明的改進(jìn)，由下述重量百分比的組分組成：雞胰脂肪酶45%-55%，黑曲霉脂肪酶45%-55%。作為對(duì)本發(fā)明的改進(jìn)，所述雞胰脂肪酶是通過(guò)下述方法制備的：（1）粗雞胰脂肪酶的制備；（2）雞胰脂肪酶的分離純化；（21）硫酸銨沉淀；（22）超濾濃縮；（23）葡聚糖凝膠（SephadexG-100）分子過(guò)濾層析；（24）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)；作為對(duì)本發(fā)明的改進(jìn)，所述粗雞胰脂肪酶的制備包括下述步驟：（11）將雞胰腺搗成胰漿，加入緩沖液，4℃條件下磁力攪拌2h；（12）過(guò)濾，取溶液，1500rpm-2000rpm離心去除第一沉淀，溶液加入丙酮，繼續(xù)磁力攪拌25min-40min，然后在4℃條件下，1500rpm-2000rpm離心15min-30min，第二沉淀用75%丙酮溶解攪拌，再離心，得第三沉淀；（13）干燥第三沉淀，得固體粉末；（14）將所述固體粉末加入到4℃的氯仿-甲醇（氯仿與甲醇的體積比為2:1）中，磁力攪拌15min-30min，然后在4℃條件下、1500rpm-2000rpm離心，得第四沉淀，第四沉淀溶于乙醚中，再在4℃條件下、1500rpm-2000rpm離心，得第五沉淀，第五沉淀溶于丙酮中，再將第五沉淀干燥，得粗酶粉。作為對(duì)本發(fā)明的改進(jìn)，所述步驟（21）硫酸銨沉淀包括下述步驟：（211）、將上述粗酶粉溶于50mL去離子水中制成粗酶液，將裝有50mL粗酶液的小燒杯放在另一個(gè)裝有少量冰水的大燒杯內(nèi)，并置于磁力攪拌器上緩慢攪拌；（212）、一邊緩慢攪拌，一邊緩慢加入10.00g、15.00g、20.00g、25.00g、30.00g、35.00g硫酸銨至終濃度為20%、30%、40%、50%、60%、70%（w/v），該步驟應(yīng)在10min內(nèi)完成；然后繼續(xù)攪拌15min-20min；（214）、接著10000rpm離心8-12min；棄去上清液，將沉淀懸浮于1~2倍沉淀物體積的0.05mol/LpH為7.5磷酸緩沖液，10000rpm離心出去殘留的不溶性物質(zhì)；（216）、測(cè)定上清液中的酶活力與蛋白質(zhì)含量，計(jì)算濃縮酶液的比活力和純化倍數(shù)；其中，比活力=酶活力單位/毫克蛋白質(zhì)；純化倍數(shù)=每步比活力/第一步比活力。本發(fā)明還提供一種肉雞飼料，該肉雞飼料含有上述的任意一種含不同來(lái)源脂肪酶的飼料添加劑，飼料添加劑為0.01%-0.02%，基料為99.8%-99.9%。作為對(duì)本發(fā)明的改進(jìn)，所述基料是基礎(chǔ)日糧或低能日糧。作為對(duì)本發(fā)明的改進(jìn)，其中，所述基礎(chǔ)日糧由下述重量百分比的組分組成：玉米50%-65%，豆粕15%-30%，玉米蛋白粉3%-6%，酒糟蛋白飼料(DDGS)4%-6%,四級(jí)大豆油2%-6%，次粉0.1%-5%，石粉1.3%-1.6%，磷酸氫鈣0.6%-1.5%，食鹽0.3%-0.4%，賴氨酸0.3%-0.5%，固體蛋氨酸0.4%-1.2%，蘇氨酸0.2%-0.8%，第一預(yù)混料1%。本發(fā)明還提供含不同來(lái)源脂肪酶的飼料添加劑在黃羽肉雞飼料中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供含有不同來(lái)源脂肪酶的飼料對(duì)黃羽肉雞回腸微生物多樣性方面影響的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種含不同來(lái)源脂肪酶的飼料添加劑，所述飼料添加劑中不同來(lái)源脂肪酶由下述重量百分比的組分組成：雞胰脂肪酶40%-60%，黑曲霉脂肪酶40%-60%。當(dāng)將由所述雞胰脂肪酶和黑曲霉脂肪酶按照上述比例配制后作為飼料添加劑添加到黃羽肉雞日糧中，可達(dá)到補(bǔ)充肉雞體內(nèi)內(nèi)源脂肪酶分泌不足，提高粗脂肪利用率，且相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，由于飼料添加劑中新添加了雞脂肪酶是雞胰脂肪酶和黑曲霉脂肪酶的組合，雞胰組合脂肪酶在黃羽肉雞體內(nèi)發(fā)揮的作用更穩(wěn)定、持久，活性更高；同時(shí)，不同來(lái)源的雞胰脂肪酶和黑曲霉脂肪酶可協(xié)同作用由于雞胰脂肪酶和黑曲霉脂肪酶來(lái)源不一樣，兩者可協(xié)同作用，可分解利用肉雞日糧中不同類型的油脂，提高不同類型脂肪利用率，明顯增加黃羽肉雞回腸內(nèi)微生物種類的多樣性，減少黃羽肉雞的脂肪肝和營(yíng)養(yǎng)性腹瀉。因此，本發(fā)明具有能夠明顯增加黃羽肉雞回腸內(nèi)微生物種類的多樣性，提高黃羽肉雞日糧中脂肪利用率，從而達(dá)到減輕肉雞營(yíng)養(yǎng)性腹瀉的目的。附圖說(shuō)明圖1是葡聚糖凝膠（SephadexG-100）過(guò)濾層析洗脫曲線圖。圖2是純化步驟的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)圖。圖3是微生物16SrDNA基因V3區(qū)基因片段的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）圖。圖4是微生物16SrDNA基因V3區(qū)基因片段的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）圖。圖5是微生物16SrDNA基因V3區(qū)基因片段變性梯度凝膠電泳（DGGE）指紋圖譜。具體實(shí)施方式本發(fā)明中，特別說(shuō)明的是，所述“不同來(lái)源”指的是脂肪酶的來(lái)源不同，其中，雞胰脂肪酶來(lái)自雞胰腺，黑曲霉脂肪酶來(lái)自黑曲霉。本發(fā)明中，飼料中的基礎(chǔ)日糧由下述重量百分比的組分組成，具體實(shí)施例如下：實(shí)施例1玉米50%，豆粕20%，玉米蛋白粉6%，酒糟蛋白飼料(DDGS)6%,四級(jí)大豆油6%，次粉5%，石粉1.6%，磷酸氫鈣1.5%，食鹽0.4%，賴氨酸0.5%，固體蛋氨酸1.2%，蘇氨酸0.8%，第一預(yù)混料1%。實(shí)施例2玉米50%，豆粕30%，玉米蛋白粉5%，酒糟蛋白飼料(DDGS)4%,四級(jí)大豆油6%，次粉0.1%，石粉1.3%，磷酸氫鈣0.6%，食鹽0.3%，賴氨酸0.3%，固體蛋氨酸1%，蘇氨酸0.4%，第一預(yù)混料1%。實(shí)施例3玉米65%，豆粕15%，玉米蛋白粉3%，酒糟蛋白飼料(DDGS)6%,四級(jí)大豆油2%，次粉4.9%，石粉1.3%，磷酸氫鈣0.6%，食鹽0.3%，賴氨酸0.3%，固體蛋氨酸0.4%，蘇氨酸0.2%，第一預(yù)混料1%。本發(fā)明中，飼料中的低能日糧包括下述重量百分比的組分，具體實(shí)施例如下：實(shí)施例4玉米58.95%，豆粕28%，玉米蛋白粉4%，酒糟蛋白飼料(DDGS)5%,四級(jí)大豆油0.4%，次粉0.1%，石粉1.3%，磷酸氫鈣0.6%，食鹽0.3%，賴氨酸0.3%，固體蛋氨酸0.03%，蘇氨酸0.02%，第二預(yù)混料1%。實(shí)施例5玉米59.82%，豆粕14%，玉米蛋白粉5%，酒糟蛋白飼料(DDGS)6%,四級(jí)大豆油4%，次粉5%，石粉1.5%，磷酸氫鈣1.5%，食鹽0.4%，賴氨酸0.5%，固體蛋氨酸1.2%，蘇氨酸0.08%，第二預(yù)混料1%。實(shí)施例6玉米55%，豆粕25%，玉米蛋白粉4%，酒糟蛋白飼料(DDGS)5%,四級(jí)大豆油1%，次粉5%，石粉1.5%，磷酸氫鈣1.5%，食鹽0.4%，賴氨酸0.5%，固體蛋氨酸0.05%，蘇氨酸0.05%，第二預(yù)混料1%。實(shí)施例7玉米65%，豆粕15%，玉米蛋白粉4%，酒糟蛋白飼料(DDGS)5%,四級(jí)大豆油1%，次粉5%，石粉1.5%，磷酸氫鈣1.5%，食鹽0.4%，賴氨酸0.5%，固體蛋氨酸0.05%，蘇氨酸0.05%，第二預(yù)混料1%。本發(fā)明中，飼料添加劑的實(shí)施例具體如下：實(shí)施例8雞胰脂肪酶40%，黑曲霉脂肪酶60%。實(shí)施例9雞胰脂肪酶60%，黑曲霉脂肪酶40%。實(shí)施例10雞胰脂肪酶50%，黑曲霉脂肪酶50%。實(shí)施例11雞胰脂肪酶45%，黑曲霉脂肪酶55%。實(shí)施例12雞胰脂肪酶55%，黑曲霉脂肪酶45%。本發(fā)明中，所述雞胰脂肪酶是通過(guò)下述“雞胰脂肪酶的分離純化”工藝制得的，所述黑曲霉脂肪酶是粉末狀的，目數(shù)范圍為30目-50目。一、雞胰脂肪酶的分離純化1.1粗雞胰脂肪酶的制備（111）、取用液氮保存好的雞胰腺，用組織搗碎機(jī)攪成胰漿，加入緩沖液（本實(shí)施例中用的是磷酸緩沖液，當(dāng)然也可以是起相同作用的其他緩沖液，其他緩沖液屬于現(xiàn)有技術(shù)，此處不再一一贅述），4℃磁力攪拌2h；（112）、用雙層紗布過(guò)濾，取溶液，1500rpm-2000rpm離心去除第一沉淀物，本實(shí)施例為用1500rpm，溶液加入冷卻到4℃的丙酮，用磁力攪拌器繼續(xù)攪拌25min-40min，本實(shí)施例為30min，然后在4℃條件下，2000rpm離心20min，第二沉淀物用75%丙酮溶解攪拌，再離心，得第三沉淀物；（113）、第三沉淀物放在低溫真空中冷凍干燥，得固定粉末；（114）、凍干的固體粉末加入到4℃的氯仿-甲醇（氯仿與甲醇的體積比為2:1）中，磁力攪拌20min，然后在4℃條件下、2000rpm離心，得第四沉淀物，第四沉淀物溶于乙醚中，再在4℃條件下、2000rpm離心，得第五沉淀物，第五沉淀物溶于丙酮中，再將第五沉淀物放在低溫真空中冷凍干燥，得粗酶粉。1.2雞胰脂肪酶的分離純化1.2.1硫酸銨沉淀（1211）、將上述粗酶粉溶于50mL去離子水中制成粗酶液，將裝有50mL粗酶液的小燒杯放在另一個(gè)裝有少量冰水的大燒杯內(nèi)，并置于磁力攪拌器上緩慢攪拌；（1212）、一邊緩慢攪拌，一邊緩慢加入10.00g、15.00g、20.00g、25.00g、30.00g、35.00g硫酸銨至終濃度為20%、30%、40%、50%、60%、70%（w/v），該步驟應(yīng)在10min內(nèi)完成；然后繼續(xù)攪拌15min；（1213）、接著10000rpm離心10min；棄去上清液，將沉淀懸浮于1~2倍沉淀物體積的0.05mol/LpH為7.5磷酸緩沖液中，10000rpm離心出去殘留的不溶性物質(zhì)；（1214）、測(cè)定上清液中的酶活力與蛋白質(zhì)含量，計(jì)算濃縮酶液的比活力和純化倍數(shù)；其中，比活力=酶活力單位/毫克蛋白質(zhì)；純化倍數(shù)=每步比活力/第一步比活力1.2.2超濾濃縮（1221）、使用前將15mL截留分子量為10kDa的超濾管（Millipore，美國(guó)），用水加滿，在-20℃冰箱中預(yù)冷10min，將水倒出；（1222）、將酶液加入超濾管內(nèi)管，在4℃條件下、6000rpm離心20min；（1223）、去掉外管的廢液，將內(nèi)管倒扣在外管內(nèi)；（1224）、在4℃條件下、3000rpm離心10min；（1225）、外管液體即為超濾后酶液，轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中；（1226）、測(cè)定超濾后酶液的酶活力與蛋白質(zhì)含量，計(jì)算比活力值和純化倍數(shù)。1.2.3葡聚糖凝膠（SephadexG-100）分子過(guò)濾層析1.2.3.1葡聚糖凝膠（SephadexG-100）的預(yù)處理（12311）、稱取20克葡聚糖凝膠（SephadexG-100）顆粒于燒杯中，加入500mL去離子水，浸泡溶脹48h；（12312）、將葡聚糖凝膠（SephadexG-100）水溶液盛放于抽濾瓶中，用洗耳球塞住杯口，減壓抽氣30min，除去凝膠溶液內(nèi)的氣泡，將脫氣后的凝膠溶液輕輕倒入燒杯中；1.2.3.2裝柱（12321）、層析柱（1.2×90cm）用去離子水清洗干凈，將兩端擰緊，垂直固定于固定架上。打開柱上端口注入水，使柱內(nèi)留存有1/4-1/5的水；（12322）、緩慢攪動(dòng)凝膠溶液，并立即沿玻棒倒入層析管內(nèi)，讓加入的凝膠在柱內(nèi)自然沉降，待柱底面上積起約1-2cm的凝膠床后，打開柱出口水流。隨著柱內(nèi)水的流出，上面不斷加入凝膠液，使形成的凝膠床面上有凝膠連續(xù)下降；（12323）、凝膠沉積到柱的頂端約3cm處，停止裝柱，讓柱內(nèi)水面高于凝膠床界面1cm左右；（12324）、觀察柱內(nèi)凝膠是否均勻，有否“紋路”或氣泡。若層析柱不均一，必須重新裝柱；（12325）、層析柱裝好后，使凝膠床穩(wěn)定30min，然后連接洗脫瓶出口和層析柱頂端，用3-5倍體積的0.05mol/LpH7.5磷酸緩沖液平衡層析柱。控制上柱緩沖液的壓力保持恒定，保持流速0.3mL/min，直至流出液的pH與上柱緩沖液相同。1.2.3.3樣品洗脫（12331）、樣品洗脫上樣前打開層析柱上端，先檢查凝膠床界面是否平整，如果傾斜不平整，可用玻棒將凝膠床界面輕輕攪起后，再使凝膠自然沉降，形成平整狀態(tài)的凝膠床界面。然后讓液面自然下降，露出凝膠床界面；（12332）、用移液器將酶液滴加到凝膠床面上，打開恒流泵，控制流速0.3mL/min，待酶液全部流入凝膠床后，加緩沖液至比床面高2cm；（12333）、用0.05mol/LpH7.5磷酸緩沖液洗脫，控制洗脫流速0.3mL/min，用部份收集器收集，每2min收集一管；（12334）、采用核酸蛋白測(cè)定儀實(shí)時(shí)測(cè)定每管收集液的光密度A值，以試管編號(hào)為橫坐標(biāo)，光密度A值為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線；選擇每個(gè)波峰附近的試管，測(cè)定酶活力，并SDS-聚丙烯酰胺凝（SDS-PAGE）檢測(cè)酶的純度。1.2.4SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)1.2.4.1制備積層膠按表1加入各種試劑配制10%分離膠，混勻，灌入密封性良好的玻璃板間隙中，然后加入一定量的水壓膠，靜置30min。倒掉水，用濾紙吸干制膠板上殘留的液體，按照表2加入各種試劑配制5%濃縮膠，混勻，迅速灌入膠模中凝固的分離膠上面，立即插上梳子，靜置30min。1.2.4.2樣品準(zhǔn)備每個(gè)樣品取20.0μL，加入5.0μL5×上樣緩沖液，渦旋混勻，90℃金屬浴10.0min，冰上冷卻，震蕩渦旋，短暫離心，用上樣槍頭將15.0μL樣品加入梳孔，最后一孔加入5.0μL蛋白質(zhì)標(biāo)記物（蛋白質(zhì)Marker）。表110%聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離膠配方表25%聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）濃縮膠配方成分加入量水（H2O）1.13mL30%聚丙烯酰胺0.33mL1.5mol/L三(羥甲基)氨基甲烷（Tris-HCl）（pH8.8）0.5mL10%陰離子去污劑（SDS）20.0μL10%過(guò)硫酸銨20.0μL四甲基乙二胺（TEMED）4.0μL1.2.4.3電泳在電泳槽中加滿1×電泳緩沖液。先以60V電壓跑約20~30min，直至蛋白條帶被濃縮成一條線；然后調(diào)整電壓至100V，跑約90min，直到藍(lán)色的溴酚藍(lán)跑到膠塊最底部。1.2.4.4染色脫色電泳完后，將膠塊小心取下，放入裝有考馬斯亮藍(lán)染色液的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿放在搖床上不斷振蕩，染色40min；倒掉染色液，換成脫色液，脫色4~5次，脫色液每30~60min更換一次。1.2.4.5拍照分析脫色完成后，用數(shù)碼相機(jī)拍照。1.3硫酸銨沉淀法對(duì)雞胰脂肪酶提取效果表3硫酸銨沉淀法在酶蛋白質(zhì)初提取中的效果硫酸銨沉淀法在酶蛋白質(zhì)初提取中的效果見表3，由表3可知，在30%的硫酸銨飽和度時(shí)，脂肪酶蛋白開始析出，至50%飽和度時(shí)，粗酶液中的酶蛋白基本提取完全，此時(shí)酶活力回收率達(dá)到53.76%，比活力為6.14U/mgrot，純化倍數(shù)最大，達(dá)到43.89，隨著硫酸銨飽和度的繼續(xù)增加，雜蛋白增多，反而出現(xiàn)比活力及純化倍數(shù)降低，因此，本試驗(yàn)選取50%的硫酸銨飽和度作為粗酶液中酶蛋白的初步濃縮提取方法。1.4葡聚糖凝膠（SephadexG-100）過(guò)濾層析分離純化雞胰脂肪酶試驗(yàn)結(jié)果圖1葡聚糖凝膠（SephadexG-100）過(guò)濾層析洗脫曲線將50%硫酸銨飽和度層析出來(lái)的酶蛋白復(fù)溶至緩沖液中，10kDa超濾管超濾，超濾后的溶液進(jìn)行葡聚糖凝膠（SephadexG-100）過(guò)濾層析，洗脫曲線如圖1，進(jìn)行酶活力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在100~110管時(shí)出現(xiàn)的洗脫峰具有較強(qiáng)的脂肪酶酶活。各洗脫峰分離條件較好，適合作為雞胰脂肪酶蛋白的分離純化。1.5雞胰脂肪酶的純度檢測(cè)結(jié)果雞胰脂肪酶的純度檢測(cè)見圖2圖2純化步驟的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)注：從左至右依次為1、蛋白質(zhì)標(biāo)記物（蛋白質(zhì)Marker）2、葡聚糖凝膠（SephadexG-100）純化脂肪酶3、凍干酶粉4、硫酸銨沉淀酶液5、超濾酶液從圖2可知，本實(shí)驗(yàn)最終得到了具有單一蛋白條帶的來(lái)源于雞胰腺的脂肪酶，分子量為32kDa，經(jīng)酶活檢測(cè)具有脂肪水解活性，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。1.6雞胰脂肪酶的純化結(jié)果表4雞胰脂肪酶的分離純化結(jié)果雞胰脂肪酶粉復(fù)溶于緩沖液中，經(jīng)硫酸銨沉淀、超濾和葡聚糖凝膠（SephadexG-100）過(guò)濾層析，得到的結(jié)果如表4所示，最終得到的胰脂肪酶比活力為8.70U/mgprot，純化倍數(shù)為61.93，回收率為4%。1.7雞胰脂肪酶對(duì)不同長(zhǎng)度碳鏈的水解專一性表5雞胰脂肪酶對(duì)不同長(zhǎng)度碳鏈水解專一性pNPB（C4）pNPO（C8)pNPL（C12）pNPP（C16）相對(duì)酶活（%）10.86100.0090.8062.55雞胰脂肪酶對(duì)不同長(zhǎng)度碳鏈水解專一性見表5，純化后的雞胰脂肪酶對(duì)pNPO（C8）具有最高的水解活性，酶水解鏈長(zhǎng)專一性為pNPO（C8）>pNPL(C12)>pNPP(C16)>pNPB(C4)，對(duì)pNPB（C4）的相對(duì)酶活最低，僅10.86%。二、不同來(lái)源脂肪酶水解魚油反應(yīng)及其產(chǎn)物分析2.1水解魚油反應(yīng)貝塞瓶中加入1.0000g魚油，2mL磷酸緩沖溶液（0.05mol/L，pH7.5），1mL脂肪酶溶液，在40℃條件下氣浴震蕩反應(yīng)12h。2.2脂肪酸萃取在魚油酶解混合反應(yīng)液中加入5.0mL石油醚，充分振蕩后靜置10min，然后轉(zhuǎn)入50.0mL離心管5000rpm離心10min。2.3脂肪酸甲酯化吸取脂肪酸萃取離心上清溶液1.0mL，加入5.0mL1%硫酸（H2SO4）-甲醇溶液，70℃水浴反應(yīng)60min，待溶液反應(yīng)結(jié)束，冷卻后加入2.5mL異辛烷和0.5mL內(nèi)標(biāo)溶液混勻，隨后加入7.0mL飽和氯化鈉溶液振蕩3min，5000rpm離心10min后吸取上層溶液備用。2.4氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用按照國(guó)標(biāo)《GBT17377-2008動(dòng)植物油脂脂肪酸甲酯的氣相色譜分析》步驟操作，色譜柱：DB-5彈性石英毛細(xì)管柱（30m*0.32mm*0.25um）；柱溫：程序升溫，初始溫度150℃保持5min，以5℃/min速率升溫至220℃，保持1min，再以10℃/min速率升溫至260℃，保持5min；進(jìn)樣口溫度：260℃；檢測(cè)器溫度：280℃；載氣為高純氮?dú)?；質(zhì)譜條件：離子源為230℃，電子能量70eV，MS四級(jí)桿溫度為150℃。2.5不同來(lái)源脂肪酶水解產(chǎn)物對(duì)微生物增殖的影響2.5.1不同來(lái)源脂肪酶水解魚油產(chǎn)物成分表6不同來(lái)源脂肪酶水解魚油產(chǎn)物組成成分分析雞胰脂肪酶黑曲霉脂肪酶實(shí)施例10（雞胰脂肪酶：黑曲霉脂肪酶=1:1）C6---C8---C10---C120.030.040.03C140.320.540.39C16：10.830.110.08C1610.519.9318.31C18：24.015.524.03C18：17.329.649.18C181.172.371.85C20：10.110.160.12C200.060.160.12總計(jì)24.3538.4734.11雞胰脂肪酶、黑曲霉脂肪酶，及其組合水解魚油產(chǎn)物成分分析見表6，由表6可知，雞胰脂肪酶和黑曲霉脂肪酶水解產(chǎn)物均以十六碳和十八碳為主，黑曲霉脂肪酶和組合脂肪酶（本發(fā)明中，組合脂肪酶即指雞胰脂肪酶和黑曲霉脂肪酶按照1:1組合后的混合物）對(duì)十六碳、十八碳及總水解率明顯高于僅添加雞胰脂肪酶水解時(shí)的水解率，可見，雞胰脂肪酶和黑曲霉脂肪酶按照1:1比例組合后，對(duì)脂肪的水解效果更佳。2.5.2不同來(lái)源脂肪酶水解魚油產(chǎn)物調(diào)控乳酸桿菌增殖表7不同來(lái)源脂肪酶對(duì)乳酸桿菌增殖的影響空白雞胰脂肪酶黑曲霉脂肪酶實(shí)施例10（雞胰脂肪酶：黑曲霉脂肪酶=1:1）3h0.020±0.005b0.116±0.018a0.024±0.001b0.135±0.017a6h0.103±0.006b0.177±0.019a0.094±0.007b0.171±0.012a12h1.951±0.0321.929±0.0111.905±0.0031.928±0.013注：n=5，表中數(shù)字表示平均數(shù)（M）±標(biāo)準(zhǔn)誤（SE），同行肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05），肩標(biāo)無(wú)字母或有相同字母表示差異不顯著（P>0.05），下同。雞胰脂肪酶、黑曲霉脂肪酶，及其組合水解魚油產(chǎn)物對(duì)乳酸桿菌增殖的影響見表7，由表7可知，雞胰脂肪酶及組合脂肪酶水解魚油產(chǎn)物能顯著提高3h、6h乳酸桿菌的增殖（P<0.05），可見，相對(duì)于只添加黑曲霉脂肪酶而言，組合脂肪酶的水解魚油的產(chǎn)物能夠顯著提高3h、6h乳酸桿菌的增殖，但所有脂肪酶水解魚油產(chǎn)物對(duì)乳酸桿菌12h增殖影響均不顯著（P>0.05），因?yàn)榇藭r(shí)乳酸桿菌已達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。2.5.3不同來(lái)源脂肪酶水解魚油產(chǎn)物調(diào)控大腸桿菌增殖表8不同來(lái)源脂肪酶水解魚油產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌增殖的影響空白雞胰脂肪酶黑曲霉脂肪酶實(shí)施例10（雞胰脂肪酶：黑曲霉脂肪酶=1:1）3h0.058±0.042b0.393±0.088a0.084±0.000b0.529±0.081a6h0.112±0.042c0.832±0.032a0.773±0.020ab0.676±0.034a9h1.578±0.0031.438±0.0741.613±0.1021.393±0.066雞胰脂肪酶、黑曲霉脂肪酶，及其組合水解魚油產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌增殖的影響見表8，試驗(yàn)表明，雞胰脂肪酶及組合脂肪酶水解魚油產(chǎn)物能顯著提高3h、6h大腸桿菌的增殖（P<0.05），三種脂肪酶水解魚油產(chǎn)物能顯著提高大腸桿菌6h增殖（P<0.05），但所有脂肪酶水解魚油產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌9h增殖影響均差異不顯著（P>0.05），因?yàn)榇藭r(shí)大腸桿菌已達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。三、飼養(yǎng)試驗(yàn)3.1試驗(yàn)動(dòng)物及分組選取1日齡新興黃Ⅱ肉雞（公雞）2100羽平均分成第一組、第二組、第三組、第四組、第五組共5個(gè)處理組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)70只雞。處理組第一組飼喂基礎(chǔ)日糧，處理組第二組飼喂低能日糧（基礎(chǔ)日糧水平降低0.29MJ/kg代謝能），處理組第三組、第四組、第五組分別在低能日糧基礎(chǔ)上添加200g/T雞胰脂肪酶、200g/T黑曲霉脂肪酶和200g/T實(shí)施例10。試驗(yàn)分組情況見表9：表9試驗(yàn)分組情況處理組分組第一組基礎(chǔ)日糧第二組低能日糧（降低0.29MJ/kg代謝能）第三組低能日糧+200g/T雞胰脂肪酶第四組低能日糧+200g/T黑曲霉脂肪酶第五組低能日糧+200g/T的實(shí)施例103.2代謝試驗(yàn)3.2.1代謝試驗(yàn)分組表9分為5個(gè)處理組（同生產(chǎn)試驗(yàn)分組），每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4只雞，同養(yǎng)在一個(gè)代謝籠中，自由飲水。3.2.2代謝試驗(yàn)方法用內(nèi)源指示劑法，各處理組飼喂基礎(chǔ)日糧4d，自由采食；然后禁飼17h，自由飲水；禁飼結(jié)束后，各組雞飼喂對(duì)應(yīng)處理組試驗(yàn)飼糧55h，然后立即斷料，4h后頸部脫臼處死，收集回腸末端糞便，按重量比體積添加10%鹽酸固氮。3.2.3測(cè)定指標(biāo)和方法代謝試驗(yàn)完成后，測(cè)定飼料及糞樣中的能量、干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪及鹽酸不溶灰分含量。計(jì)算有效代謝能值。干物質(zhì)：測(cè)定參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T6435-2006。能量：用長(zhǎng)沙儀器廠生產(chǎn)的WGR-1A微電腦熱量計(jì)測(cè)定。粗蛋白：采用凱氏微量定氮法，用全自動(dòng)定氮儀FOSS2300KJELTECANALYZERUNIT測(cè)定。粗脂肪：采用索氏浸提法，測(cè)定參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T6433-2006。鹽酸不溶灰分：測(cè)定參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T23742-2009。3.3屠宰試驗(yàn)每個(gè)飼養(yǎng)試驗(yàn)階段結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)選取接近平均體重的2只雞，進(jìn)行屠宰。雞只屠宰后，采集胸肌和腿肌，并稱屠體前活重、屠體重、半凈膛重、全凈膛重、胸肌重、腿肌重、腹脂重，計(jì)算屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率、腿肌率和腹脂率。屠體前活重：屠宰前停飼12h后的重量。屠體重：放血脫羽毛后的重量（濕法拔毛需瀝干后稱重）。半凈膛重：屠體重除去氣管、食道、嗉囊、腸、脾、胰、生殖器官；保留心、肺、膽（去膽囊）、腎、肌胃、腺胃（去除內(nèi)容物及角質(zhì)膜）和腹脂（腹部板油及肌胃周圍脂肪）的重量。全凈膛重：半凈膛重除去心、肺、肝、腎、腺胃、肌胃、腹脂及頭（第一頸椎前）、腳的重量。胸肌重：屠體胸肌剝離下來(lái)的重量。腿肌重：將雞腿部去皮、去骨的肌肉重量。腹脂重：包括腹脂（腹部板油）及肌胃脂肪。3.4試驗(yàn)結(jié)果3.4.1含不同來(lái)源脂肪酶的日糧對(duì)黃羽肉雞屠宰性能的影響表11含不同來(lái)源脂肪酶的日糧對(duì)黃羽肉雞屠宰性能的影響(%)第一組（基礎(chǔ)日糧）第二組（低能日糧）第三組（低能日糧+200g雞胰脂肪酶）第四組（低能日糧+200g黑曲霉脂肪酶）第五組（低能日糧+200g/T的實(shí)施例10）屠宰率0.930±0.0090.920±0.0050.920±0.0030.926±0.0040.939±0.002半凈膛率0.842±0.0070.820±0.0080.838±0.0140.840±0.0060.841±0.005全凈膛率0.692±0.0090.686±0.0140.693±0.0170.690±0.0050.690±0.006胸肌率0.075±0.0010.072±0.0020.072±0.0020.079±0.0030.073±0.001腿肌率0.109±0.0020.107±0.0010.106±0.0030.105±0.0020.108±0.002腹脂率0.039±0.0030.036±0.0050.036±0.0060.032±0.0040.030±0.003屠宰率方面，與基礎(chǔ)日糧組第一組比較，試驗(yàn)組第三組、第四組變化不大，試驗(yàn)第五組提高0.97%，差異均不顯著（P>0.05）。與低能日糧組第二組比較，各個(gè)試驗(yàn)組變化不大。半凈膛率方面，基礎(chǔ)日糧組第一組、低能日糧組第二組、試驗(yàn)組第三組、第四組、第五組這5個(gè)組保持在0.820-0.850之間，變化不大。全凈膛率方面，5個(gè)組間保持在0.680-0.700之間，變化不大。胸肌率方面，基礎(chǔ)日糧組第一組、低能日糧組第二組、試驗(yàn)組第三組、第四組、第五組這5個(gè)組的數(shù)據(jù)保持在0.070-0.080之間，變化不大。腿肌率方面，基礎(chǔ)日糧組第一組、低能日糧組第二組、試驗(yàn)組第三組、第四組、第五組這5個(gè)組的數(shù)據(jù)保持在0.100-0.110之間，變化不大。腹脂率方面，與基礎(chǔ)日糧組第一組比較，試驗(yàn)組第三組、第四組、第五組分別降低7.69%、17.95%、23.08%，其中第五組最高，第五組與第一組差異顯著（P<0.05）。與低能日糧組第二組比較，試驗(yàn)組第三組持平，試驗(yàn)第四組、第五組分別降低11.11%、16.67%，分別與第一組差異顯著（P<0.05）?？傮w來(lái)說(shuō)，日糧中添加不同來(lái)源脂肪酶后，對(duì)屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率、腿肌率影響不明顯，沒(méi)有規(guī)律。腹脂率方面，添加不同來(lái)源脂肪酶后降低明顯且差異顯著（P<0.05），這說(shuō)明日糧中添加不同來(lái)源脂肪酶后均可明顯降低腹脂率。3.5血清生化指標(biāo)3.5.1血清樣品采集飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)重復(fù)選取接近平均體重的2只雞進(jìn)行翅靜脈采血，靜置，3000rpm離心10min，離心后血清分裝于離心管中，-30℃保存待測(cè)。3.5.2血清指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果靜脈采血，測(cè)定總膽固醇、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）和葡萄糖含量。所有指標(biāo)均采用南京建成生物工程試劑盒測(cè)定。表12含不同來(lái)源脂肪酶的日糧對(duì)黃羽肉雞血清生化指標(biāo)的影響第一組（基礎(chǔ)日糧）第二組（低能日糧）第三組（低能日糧+200g雞胰脂肪酶）第四組（低能日糧+200g黑曲霉脂肪酶）第五組（低能日糧+200g/T的實(shí)施例10）葡萄糖10.94±0.42a8.78±0.41b10.60±0.29a10.27±0.25a9.82±0.47ab膽固醇3.82±0.27ab4.27±0.32b3.51±0.28a3.66±0.38a3.50±0.30a高密度脂蛋白（HDL）1.83±0.20a1.75±0.12a1.83±0.05a1.97±0.09b1.92±0.06b低密度脂蛋白（LDL）1.78±0.34a1.86±0.40a1.71±0.39ab1.67±0.45ab1.56±0.43b高密度脂蛋白（HDL）/低密度脂蛋白（LDL）1.03±0.33a0.94±0.96a1.07±0.28a1.18±0.42b1.23±0.51b葡萄糖方面，與基礎(chǔ)日糧組第一組比較，試驗(yàn)組第三組、第四組、第五組變化不大，沒(méi)有規(guī)律性；與低能日糧組第二組比較，試驗(yàn)組第三組、第四組、第五組分別升高20.73%、16.97%、11.85%，其中第三組、第四組與低能日糧組第二組差異顯著（P<0.05），各組間差異不顯著（P>0.05）。膽固醇方面，與基礎(chǔ)日糧組第一組比較，試驗(yàn)組第三組、第四組、第五組分別降低8.12%、4.19%、8.38%，差異不顯著（P>0.05）；與低能日糧組第二組比較，試驗(yàn)組第三組、第四組、第五組分別降低17.80%、14.29%、18.03%，差異均顯著（P>0.05），這說(shuō)明添加脂肪酶后對(duì)降低膽固醇明顯，其中，以第五組降低最明顯。高密度脂蛋白（HDL），與基礎(chǔ)日糧組第一組比較，試驗(yàn)組第三組、第四組、第五組變化不大，有升高的趨勢(shì)，但差異不明顯（P>0.05）；與低能日糧組第二組比較，試驗(yàn)組第三組、第四組、第五組分別升高4.57%、12.57%、9.71%，第四組、第五組和第二組比較差異顯著（P<0.05），各組間差異不顯著（P>0.05）。低密度脂蛋白（LDL），與基礎(chǔ)日糧組第一組比較，試驗(yàn)組第三組、第四組、第五組分別降低3.93%、6.18%、12.36%，試驗(yàn)組第五組與第一組差異顯著（P<0.05），組間差異不顯著（P>0.05）；與低能日糧組第二組比較，試驗(yàn)組第三組、第四組、第五組分別降低8.06%、10.22%、16.13%，試驗(yàn)組第五組與第二組差異顯著（P<0.05），各組間差異不顯著（P>0.05）。高密度脂蛋白（HDL）/低密度脂蛋白（LDL）方面，與基礎(chǔ)日糧組第一組比較，試驗(yàn)組第三組、第四組、第五組分別提高3.88%、14.56%、19.42%；第四組、第五組和第一組比較，差異顯著（P<0.05），其它各組間差異不顯著（P>0.05）；與低能日糧組第二組比較，試驗(yàn)組第三組提高13.83%，試驗(yàn)組第四組、第五組分別提高25.53%、30.85%，差異均顯著（P<0.05），各組間差異不顯著（P>0.05）?？傮w來(lái)說(shuō)，添加不同來(lái)源脂肪酶后，葡萄糖含量變化無(wú)明顯規(guī)律，膽固醇降低明顯，差異顯著；高密度脂蛋白（HDL）提高顯著；低密度脂蛋白（LDL）降低明顯；高密度脂蛋白（HDL）/低密度脂蛋白（LDL）提高顯著（P<0.05），尤其是第五組中，添加雞胰脂肪酶與黑曲霉脂肪酶的組合后，由于雞胰脂肪酶與黑曲霉脂肪酶的協(xié)同作用，膽固醇降低明顯，差異顯著（P<0.05）；高密度脂蛋白（HDL）比第二組提高顯著；低密度脂蛋白（LDL）與第一組和第二組相比，降低明顯；與第一組和第二組相比，高密度脂蛋白（HDL）/低密度脂蛋白（LDL）提高顯著（P<0.05）。3.6腸道微生物多樣性檢測(cè)方法3.6.1微生物DNA提取采用天根公司TIANampStoolDNAKit試劑盒，主要操作步驟如下：（1）稱取糞便樣本200mg至2mL離心管中，并將管子置于冰上；（2）向樣本中加入1.4mL緩沖液GSL，間歇振蕩1min至樣本混勻；（3）70℃孵育5min；（4）渦旋15s、12,000rpm離心1min；轉(zhuǎn)移上清液1.2mL至新的2mL離心管；（5）加入一個(gè)抑制劑吸附片InhibitEX，振蕩至吸附片徹底打開重懸。室溫孵育1min，使吸附片能充分作用；（6）12,000rpm離心3min；（7）將上一步所得上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5mL離心管，重復(fù)步驟6；（8）轉(zhuǎn)移所得上清液200μL至新的1.5mL離心管，加入15μL蛋白酶k（ProteinaseK）。（9）加入200μL緩沖液GB，渦旋15s；（10）70℃孵育10min。簡(jiǎn)短離心以收集管壁及管蓋上的液滴；（11）加入200μL無(wú)水乙醇，渦旋混勻。簡(jiǎn)短離心以收集管壁及管蓋上的液滴；（12）將上一步所得溶液加入到一個(gè)吸附柱CR2中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CR2放入收集管中；（13）向吸附柱CR2中加入500μL緩沖液GD（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12,000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱CR2放入收集管中；（14）向吸附柱CR2中加入600μL漂洗液PW（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12,000rpm離心30s，倒掉廢液，吸附柱CR2放入收集管中。（15）重復(fù)操作步驟14；（16）將吸附柱CR2放回收集管中，12,000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CR2置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；（17）將吸附柱CR2轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50μL洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5min，12,000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中；（18）將離心得到的溶液再加入吸附柱CR2中，室溫放置2min，12,000rpm離心2min；DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防降解。3.6.2微生物16SrDNA基因V3區(qū)基因片段的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增采用細(xì)菌的通用引物對(duì)樣品微生物的DNA溶液進(jìn)行目標(biāo)片段的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增，所用的引物序列如表13所示，該引物由上海生工生物科技有限公司合成。采用25μL聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增反應(yīng)體系，包括2.5μLDNA模板，12.5μL耐熱DNA聚合酶（Taq酶），0.6μL上游引物（10μM），0.6μL下游引物（10μM），加ddH2O到25μL。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性300s；94℃變性30s；60℃退火60s；72℃延伸120s；30個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸600s。所得的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物在120V電壓下采用1%的瓊脂糖凝膠電泳20min，然后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物，并拍照記錄。表13細(xì)菌的通用引物注：F357引物的5′增加一個(gè)40bpGC發(fā)夾，以利于后續(xù)變性梯度凝膠電泳（DGGE）的分析，GC發(fā)夾序列為CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC。3.6.3聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳（DGGE）分析采用基因突變檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-RadDCodeTMUniversalMutationDetectionSystem）對(duì)細(xì)菌的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳（DenaturingGradientGelElectrophoresis，簡(jiǎn)稱DGGE）分析，變性梯度凝膠電泳（DGGE）操作步驟如下：（1）在電泳槽中倒入6.50L的1×核酸電泳緩沖液（TAE），設(shè)定溫度為60℃，預(yù)熱；（2）分別配制16mL40%的變性劑和16mL60%的變性劑，再分別加入150μL10%過(guò)硫酸銨和15μL四甲基乙二胺（TEMED）；（3）將不同濃度的成膠液分別吸入相應(yīng)的專用注射器中，將膠緩慢勻速的注入兩塊玻璃板中間，灌膠完畢，迅速插入梳子，2h后變性膠即可凝固；（4）將凝膠玻璃放入預(yù)熱至60℃的電泳槽內(nèi)，然后將20μL聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物用移液器加入點(diǎn)樣孔中，最后以80V電壓，60℃電泳16h；（5）電泳完畢后，剝離凝膠，用超純水漂洗2min；倒掉超純水，加入350mL固定液，放置15min；倒掉固定液，繼續(xù)用超純水漂洗2min，倒掉超純水；（6）倒入350mL銀染液中，低速避光搖蕩10min；倒掉銀染液，用去離子水沖洗兩次，每次5~10s，加入350mL顯色液顯色，待DNA條帶顯示清楚停止；（7）倒掉顯色液，倒入固定液，染色完成；將銀染的凝膠放置在白光板上，用數(shù)碼相機(jī)拍照保存圖片。3.6.4Shannon’s多樣性指數(shù)計(jì)算使用Quantity-One（Bio-Rad）軟件分析變性梯度凝膠電泳（DGGE）圖譜，并依據(jù)式1計(jì)算Shannon’s多樣性指數(shù)H＇。式1式中，s為每個(gè)泳道條帶數(shù)，pi為每個(gè)條帶強(qiáng)度占總條帶強(qiáng)度的比例，H＇為Shannon’s多樣性指數(shù)，其值越大說(shuō)明樣品的多樣性程度越高。3.6.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)產(chǎn)品與服務(wù)解決方案18.0軟件（SPSS）進(jìn)行分析，結(jié)果采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤的方法表示，對(duì)不同處理組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（onewayANOVE），用Duncan進(jìn)行多重比較，P<0.05為差異顯著。3.7不同來(lái)源脂肪酶及其組合對(duì)黃羽肉雞回腸微生物多樣性的影響圖3和圖4微生物16SrDNA基因V3區(qū)基因片段的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物1%瓊脂糖電泳圖5微生物16SrDNA基因V3區(qū)基因片段變性梯度凝膠電泳（DGGE）指紋圖譜圖表14含不同來(lái)源脂肪酶的日糧對(duì)黃羽肉雞回腸微生物多樣性的影響圖3和圖4表示微生物16SrDNA基因V3區(qū)基因片段聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物1%瓊脂糖電泳圖。條帶單一且清晰，在200bp左右，能夠用來(lái)進(jìn)行變性梯度凝膠電泳（DGGE）。圖5為16SrDNA基因V3區(qū)基因片段聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳（DGGE）指紋圖譜，不同來(lái)源脂肪酶及其組合的添加對(duì)黃羽肉雞回腸微生物影響見表14，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)不同來(lái)來(lái)源脂肪酶組合使用能顯著增加黃羽肉雞回腸微生物多樣性（P<0.05）。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3