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一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑的用途的制作方法

文檔序號:11114460閱讀:842來源:國知局
一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑的用途的制造方法與工藝

本發(fā)明屬于生物工程技術的應用用途,具體涉及一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑的用途。



背景技術:

高F 值寡肽混合物是一個由由3~7個氨基酸殘氨基酸殘基所組成的混合小肽(或稱寡肽)體系。F值(Fischer ratio)是指支鏈氨基酸(BCAA:Val,Ile,Leu)與芳香族氨基酸(AAA:Trp,Tyr,Phe)含量的摩爾數比值。正常人的血液中F值為3.0-3.5,而患有肝臟疾病病人的F值只有1.0或者更低,而高F值寡肽的F值應大于20,遠高于人體中這兩類氨基酸的比值。由于它具有獨特的氨基酸組成和生理功能,已經受到食品和醫(yī)藥界的高度關注。

鰹魚(Katsuwonus pelamis),屬鱸形總目、金槍魚亞目、金槍魚科、舵鰹亞科、鰹屬,又名正鰹、炸彈魚、堅魚、松魚、飛虎魚。鰹魚是大洋性重要經濟魚。鰹魚分布范圍較廣,在印度洋、太平洋和大西洋水溫高于15 攝氏度以上的水域,都有鰹魚的蹤跡,并且儲量豐富、開發(fā)利用前景樂觀。



技術實現要素:

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑在肝損傷、皮膚光老化、衰老及其它與Nrf2-ARE通路密切相關的疾病方面的用途。

本發(fā)明為解決上述技術問題所采取的技術方案為:一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑的用途,其特征在于該Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW) 對羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用;可促進Nrf2 蛋白質積累,激活Nrf2-ARE通路,上調抗氧化酶和II 相解毒酶清除有害物,保護機體免受氧化應激產生的活性氧的損傷;可用作制備肝損傷、皮膚光老化、衰老及其它與Nrf2-ARE通路密切相關的疾病的藥品或保健食品。

該激活劑的制備方法為:

(1)金槍魚碎肉的酶解:取金槍魚碎肉勻漿,按固液比1 g:10mL~15 mL加入Gly-NaOH緩沖液(0.05mol/L,pH 9.5),用HCl或NaOH調節(jié)pH到9.0~10.0,將溶液溫度調制55~65℃,按照金槍魚碎肉質量的1.0 %~1.5 %加入堿性蛋白酶(酶活力≥1.95×105 U/g),酶解時間3.5 h~4.0 h后,酶解液于90~95℃保溫10~15min,滅酶活;將酶解液溫度調至45~55℃,調節(jié)pH到6.0~7.0,按照金槍魚碎肉質量的0.8 %~1.0%加入復合風味蛋白酶(酶活力≥1×103 LAPU/g),酶解時間2.5 h~3.0 h,酶解液于90~95℃保溫10~15min后降至室溫,于8000~10000 rpm離心15~20 min,取上清液。

(2)金槍魚碎肉高F值寡肽的制備:取上述上清液,采用1 kDa超濾膜進行超濾處理,收集分子量小于3 kDa部分,得超濾酶解液;將超濾酶解液調pH值至2.5~3.5,按照物料與活性炭顆粒比為10~15:1將超濾酶解液以0.3~0.5mL/min 流速緩慢加入到裝載有活性炭顆粒的玻璃柱中,上樣完成后,采用2~3倍柱體積的1:1比例的1mol/L氨水和無水乙醇混合溶液洗脫色譜柱,收集洗脫液,干燥,得活性炭精制多肽;將活性炭精制多肽配成10~20 mg/mL的溶液,調pH值至6.5~7.5,緩慢加入到物料與D101大孔樹脂比為10~15:1的裝載D101大孔樹脂的玻璃柱中,用2~3倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質,再用2~3倍柱體積的95%乙醇洗脫,收集95%乙醇洗脫物,噴霧干燥,即為金槍魚碎肉高F值寡肽。

(3)金槍魚碎肉高F值寡肽中Nrf2-ARE通路激活劑制備:將金槍魚碎肉高F值寡肽依次經凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化,得Nrf2-ARE通路激活劑。

作為優(yōu)選,所述步驟1)中的金槍魚為鰹魚(Katsuwonus pelamis)。

作為優(yōu)選,所述步驟3)的凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化的具體過程為:

凝膠柱層析:將上述大孔樹脂精制多肽溶于雙蒸水配成濃度為20~30 mg/mL的溶液,經過葡聚糖凝膠Sephadex G-15柱層析分離,用雙蒸水進行洗脫,流速為0.5~0.8 mL/min,洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm檢測,按峰合并試管內溶液,比較各峰對Nrf2蛋白質水平的影響,選擇Nrf2蛋白質水平最高組分凍干,即為凝膠層析酶解物;

反相高效液相色譜純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成90~100 μg/mL的溶液,利用反相高效液相色譜進行純化,根據對Nrf2蛋白質水平的影響得1個活性多肽Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW),ESI-MS測定分子量為658.76 Da。

再優(yōu)選,所述反相高效液相色譜條件為:進樣量10~15 μL;色譜柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:水-乙腈梯度洗脫(0~40min乙腈濃度由0勻速升至50%);洗脫速度0.8~1.0 mL/min;紫外檢測波長220 nm。

與現在技術相比,本發(fā)明所提供的一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑 Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW) 對羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用;可促進Nrf2 蛋白質積累,激活Nrf2-ARE通路,上調抗氧化酶和II 相解毒酶清除有害物,保護機體免受氧化應激產生的活性氧的損傷;可用作制備肝損傷、皮膚光老化、衰老及其它與Nrf2-ARE通路密切相關的疾病的藥品或保健食品。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的葡聚糖凝膠Sephadex G-15層析圖。

圖2葡聚糖凝膠Sephadex G-15制備酶解物的反相高效液相色譜色譜圖。

圖3 Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)對Nrf2蛋白質表達水平的影響。

具體實施方式

以下結合附圖實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。

實施例:

一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑的用途的制備方法,制備工藝流程如下:金槍魚碎肉→雙酶酶解→酶解物→超濾→活性炭吸附→大孔樹脂純化→金槍魚高F值寡肽→凝膠過濾層析→高效液相色譜制備→Nrf2-ARE通路激活劑。

(1)金槍魚碎肉的酶解:取鰹魚碎肉勻漿,按固液比1 g:12 mL加入Gly-NaOH緩沖液(0.05mol/L,pH 9.5),用HCl或NaOH調節(jié)pH到9.3,將溶液溫度調制60℃,按照金槍魚碎肉質量的1.2 %加入堿性蛋白酶(酶活力≥1.95×105 U/g),酶解時間3.5 h后,酶解液于95℃保溫12 min,滅酶活;將酶解液溫度調至50℃,調節(jié)pH到7.0,按照金槍魚碎肉質量的0.9%加入復合風味蛋白酶(酶活力≥1×103 LAPU/g),酶解時間3.0 h,酶解液于95℃保溫15min后降至室溫,于9000 rpm離心15 min,取上清液。

(2)金槍魚碎肉高F值寡肽的制備:取上述上清液,采用1 kDa超濾膜進行超濾處理,收集分子量小于3 kDa部分,得超濾酶解液;將超濾酶解液調pH值至3.0,按照物料與活性炭顆粒比為12:1將超濾酶解液以0.3mL/min 流速緩慢加入到裝載活性炭顆粒的玻璃柱中,上樣完成后,采用3倍柱體積的1:1比例的1mol/L氨水和無水乙醇混合溶液洗脫色譜柱,收集洗脫液,干燥,得活性炭精制多肽;將活性炭精制多肽配成15 mg/mL的溶液,調pH值至7.0,緩慢加入到物料與D101大孔樹脂比為15:1的裝載D101大孔樹脂的玻璃柱中,用3倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質,再用3柱體積的95%乙醇洗脫,收集95%乙醇洗脫物,噴霧干燥,即為金槍魚碎肉高F值寡肽。

(3)金槍魚碎肉高F值寡肽中Nrf2-ARE通路激活劑制備:將金槍魚碎肉高F值寡肽依次經凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化,得Nrf2-ARE通路激活劑。

作為優(yōu)選,所述步驟3)的凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化的具體過程為:

①凝膠柱層析:將上述大孔樹脂精制多肽溶于雙蒸水配成濃度為20 mg/mL的溶液,經過葡聚糖凝膠Sephadex G-15柱層析分離,用雙蒸水進行洗脫,流速為0.6 mL/min,洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm檢測,按峰合并試管內溶液,比較各峰對Nrf2蛋白質水平的影響,選擇Nrf2蛋白質水平最高組分凍干,即為凝膠層析酶解物Fr.3(圖1)。

②反相高效液相色譜純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成100 μg/mL的溶液,利用反相高效液相色譜進行純化(條件為:進樣量15 μL;色譜柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:水-乙腈梯度洗脫(0~40min乙腈濃度由0勻速升至50%);洗脫速度0.8 mL/min;紫外檢測波長220 nm。),根據對Nrf2蛋白質水平的影響得1個活性多肽(圖2)。

③結構檢測:收集對Nrf2蛋白質累計水平最高的多肽,經反相高效液相色譜檢測為單一峰,利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW),ESI-MS測定分子量為658.76 Da。

自由基清除實驗:將制得的金槍魚碎肉多肽Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)進行自由基清除實驗。實驗結果表明:Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)對羥基自由基(EC50 0.12 mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC50 0.06 mg/mL)具有良好的清除作用。

抗氧化肽對激活Nrf2/ARE 通路的作用:取對數生長期的人胚腎細胞株HEK293 細胞接種于60mm 皿24 小時后,分別加入10μM的酶解液和Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW),繼續(xù)培養(yǎng)4 小時。棄去上清,細胞用RIPA 緩沖液( 上海碧云天生物技術有限公司) 裂解,BCA 法測定蛋白濃度。每個樣品取20μg 蛋白經SDS-PAGE分離,然后按常規(guī)免疫印跡方法檢測Nrf2的蛋白水平。

與現在技術相比,本發(fā)明所提供的一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑 Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW) 對羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用;可促進Nrf2 蛋白質積累,激活Nrf2-ARE通路,上調抗氧化酶和II 相解毒酶清除有害物,保護機體免受氧化應激產生的活性氧的損傷;可用作制備肝損傷、皮膚光老化、衰老及其它與Nrf2-ARE通路密切相關的疾病的藥品或保健食品。

最后,還需要注意的是,以上列舉的僅是本發(fā)明的一個具體實施例。顯然,本發(fā)明不限于以上實施例,還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形,均應認為是本發(fā)明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋學院

<120> 一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑的用途

<130> zjou-wb-201602-102

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Ile Glu Leu Val Trp

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