一種水蛭高f值寡肽及其酶解制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種水蛭高F值寡肽及其酶解制備方法與應(yīng)用，制備方法包括：（1）水蛭干體初步清洗除雜，高速粉碎；（2）原料堿預(yù)浸泡；（3）堿性蛋白酶AlcalaseAF2.4L結(jié)合木瓜蛋白酶雙酶水解；（4）采用活性炭粉靜態(tài)吸附脫除芳香族氨基酸；（5）以凝膠過(guò)濾層析柱進(jìn)一步分離純化，收集分離產(chǎn)物，冷凍干燥，獲得分子量低于2000Da，F(xiàn)值（Fischerratio，即支鏈氨基酸與芳香族氨基酸摩爾含量的比值）高于20的水蛭寡肽粉。本發(fā)明公開(kāi)的制備過(guò)程簡(jiǎn)單，選用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶兩種商業(yè)用酶，易于工業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)率較高，具有一定的抗凝血效果，并為高F值類(lèi)產(chǎn)品增加了新來(lái)源。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種水蛭高F值寡肽及其酶解制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物肽及其制備方法與應(yīng)用，具體涉及一種水蛭高F值寡肽及其酶解制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]高F值寡肽是一種支鏈氨基酸和芳香族氨基酸摩爾數(shù)比值大于20的生物活性寡肽混合物。它不僅能減輕肝性腦病癥狀、改善肝功能和肝昏迷程度，還對(duì)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)失?；颊哂蟹e極作用。在實(shí)際生產(chǎn)中，高F值寡肽可以廣泛應(yīng)用在治療肝臟疾病的藥品、護(hù)肝食品、外科手術(shù)病人的蛋白營(yíng)養(yǎng)食品、消化酶缺乏患者的腸道營(yíng)養(yǎng)劑和高強(qiáng)度勞動(dòng)者的食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑等方面。高F寡肽混合物較支鏈氨基酸配方更具有實(shí)際效用，其獨(dú)特生理功能已受到多方人士的高度關(guān)注，具有良好的發(fā)展前景。
[0003]水蛭俗稱(chēng)螞蝗，是中國(guó)傳統(tǒng)的藥用水生動(dòng)物，具有治療中風(fēng)、淤血腫痛、高血壓、閉經(jīng)等疾病的功效，其中以寬體金線蛭最為常見(jiàn)。寬體金線蛭(Whitmania Pigra),隸屬于真輕亞綱(Euhirdinea)、無(wú)吻輕目(Arhynchobdelliada)、黃輕科(Haemopidae)、金線輕屬(Whimania),《中國(guó)藥典》2010年版中記載為“螞幢W.pigra Whitman”,廣泛分布于我國(guó)大部分地區(qū)的湖泊、池塘及水田，其干體的蛋白含量在70%~80%之間，是目前我國(guó)中藥材市場(chǎng)中主流的水蛭品種。國(guó)內(nèi)中藥材市場(chǎng)上的主流藥用水蛭品種。好幾個(gè)世紀(jì)以前，人類(lèi)就已經(jīng)成功利用水蛭進(jìn)行相關(guān)疾病預(yù)防和治療，但是，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，能起相同療效的藥物如阿司匹林、硝酸甘油等的相繼出現(xiàn)，水蛭的作用漸漸被被世人所遺忘。目前，市面上的水蛭產(chǎn)品主要以抗凝血、抗血栓為主，產(chǎn)品種類(lèi)較為單一，因此探索水蛭更豐富的應(yīng)用潛能，開(kāi)發(fā)一種方法簡(jiǎn)便、成本較低、容易吸收的水蛭高F值寡肽具有一定的市場(chǎng)價(jià)值。本發(fā)明以水蛭干粉作為原料，利用酶工程技術(shù)和現(xiàn)代分離純化技術(shù)，生產(chǎn)一種純天然、易吸收的高F值生物活性寡肽混合物，這一研究為寬體金線蛭資源的合理運(yùn)用開(kāi)發(fā)提供依據(jù)，為進(jìn)一步提高其附加值提供重要的運(yùn)用途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種水蛭高F值寡肽及其酶解制備方法與應(yīng)用。本方法所采用的堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶為商業(yè)用酶，價(jià)格相對(duì)低廉，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。
[0005]本發(fā)明的目的由以下方案實(shí)現(xiàn):
[0006](1)將水蛭干燥體用清水洗凈，并于去離子水中浸泡8~24h，再于分析純乙醇中浸泡8~24h，干燥粉碎，得到水蛭干粉，置于-4~-20°C冷藏備用；
[0007](2)稱(chēng)步驟(1)得 到的水蛭干粉，加水溶解，按干粉與水重量比為I~8:100配制懸濁液，調(diào)整pH至8~11，浸泡10~60min，再調(diào)節(jié)pH至7.5~11，加入堿性蛋白酶，反應(yīng)溫度保持在30~80°C，酶解I~6h ;煮沸5~30min，滅酶活，冷卻，4000~10000r/min離心5~20min，收集上清液，調(diào)節(jié)pH至7~10，加入木瓜蛋白酶，反應(yīng)溫度保持在25~80°C，酶解I~6h ;煮沸5~30min,滅酶活，冷卻，4000~10000r/min離心5~20min,收集上清液，調(diào)整pH至2~7，按活性炭重量與上清液體積比0.2~20g =IOOmL加入活性炭，在25~60°C下吸附30~IOOmin, 4000~10000r/min離心5~30min,收集上清液；
[0008](3)裝柱:根據(jù)層析柱體積稱(chēng)量適量S^hadex G_15凝膠填料進(jìn)行溶脹處理，排除破碎顆粒，按照1.6X 120cm的規(guī)格填層析柱，以去離子水沖柱穩(wěn)定；
[0009](4) Sephadex G_15凝膠過(guò)濾:加入經(jīng)活性炭靜態(tài)吸附的酶解液，以去離子水洗脫，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300— 1500Da的洗脫液，富集濃縮，冷凍干燥，得到水蛭高F值寡肽粉。
[0010]優(yōu)選地,所述的水蛭為寬體金線蛭Whitmania Pigra0
[0011]優(yōu)選地,步驟⑴和步驟⑵中所述pH調(diào)至以8~11,調(diào)節(jié)pH至7.5~11,調(diào)節(jié)pH至7~10具體為:用0.l-2mol/L NaOH將pH調(diào)至所述pH值；所述收集上清液，調(diào)整pH至2~7具體為:用0.l-2mol/L的HCl將pH調(diào)至2~7。
[0012]優(yōu)選地，所添加的堿性蛋白酶為Alcalase2.4L，酶活力3.9323 X 105U/mL，所添加的木瓜蛋白酶為Papain，酶活力0.8231 X 105U/g。
[0013]優(yōu)選地，所述堿性蛋白酶添加量為4000~15000U/g pro，優(yōu)選6000~13000U/gpro ;所述木瓜蛋白酶添加量為按2000~10000U/g pro，優(yōu)選2000~8000U/g pro。
[0014]優(yōu)選地，所添加的活性炭為針劑型活性炭，用于吸附酶解液中的芳香族氨基酸，添加活性炭重量與上清液體積比為0.5~IOg:100mL。
[0015]優(yōu)選的,步驟(3)中所述凝膠填料為Sephadex G-15。
[0016]一種水蛭高F值寡肽，所述水蛭高F值寡肽的分子量在300— 1500Da ;所述F值為
20.0—30.0 ο
[0017]一種水蛭高F值寡肽應(yīng)用于制備高F值寡肽功能性食品，所述功能性食品為粉劑、片劑、口服液或膠囊。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0019]1.首次以水蛭作為原料制備高F值寡肽；
[0020]2.制備過(guò)程簡(jiǎn)單，選用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶兩種商業(yè)用酶，易于工業(yè)生產(chǎn)；
[0021]3.采用活性炭結(jié)合凝膠層析結(jié)合方法脫出芳香族氨基酸，芳香族氨基酸消除率在90%以上，并獲得F值大于20的寡肽產(chǎn)品；
[0022]4.分子量在300_1500Da，易于腸道吸收。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1是本發(fā)明Sephadex G_15凝膠層析柱標(biāo)準(zhǔn)品圖譜；
[0024]圖2是本發(fā)明活性炭吸附后水蛭酶解產(chǎn)物Sephadex G_15凝膠層析圖譜；
[0025]圖3是本發(fā)明水蛭高F值寡肽質(zhì)譜圖。
[0026]具體實(shí)施實(shí)例
[0027]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步地具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，對(duì)于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。
[0028]以下實(shí)施例中的蛋白回收率和水解度按照下列公式得出:
[0029]1.蛋白回收率。
[0030]采用凱氏定氮法測(cè)定酶解產(chǎn)物中蛋白質(zhì)含量占總蛋白質(zhì)含量的百分比，計(jì)算公式如下:
【權(quán)利要求】
1.一種水蛭高F值寡肽的酶解制備方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將水蛭干燥體用清水洗凈，并于去離子水中浸泡8~24h，再于分析純乙醇中浸泡8~24h，干燥粉碎，得到水蛭干粉，置于-4'20°C冷藏備用； (2)稱(chēng)步驟(1)得到的水蛭干粉，加水溶解，按干粉與水重量比為廣8:100配制懸濁液，調(diào)整pH至8~11，浸泡l(T60min，再調(diào)節(jié)pH至7.5~11，加入堿性蛋白酶，反應(yīng)溫度保持在30^800C，酶解I~6h ;煮沸5~30min，滅酶活，冷卻，400(T10000r/min離心5~20min，收集上清液，調(diào)節(jié)PH至疒10，加入木瓜蛋白酶，反應(yīng)溫度保持在25~80°C，酶解I~6h ;煮沸5~30min，滅酶活，冷卻，400(T10000r/min離心5~20min，收集上清液，調(diào)整pH至2~7，按活性炭重量與上清液體積比0.2~20g:100mL加入活性炭，在25~60°C下吸附3(T100min，400(T10000r/min離心5~30min，收集上清液，過(guò)凝膠過(guò)濾層析，以去離子水洗脫，收集在214nm吸收值大于2，在280nm吸收值小于0.2，分子量在300— 1500Da的洗脫液，富集濃縮，冷凍干燥，得到水蛭高F值寡肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水蛭高F值寡肽的酶解制備方法，其特征在于:所述的水蛭為寬體金線蛭Whitmania Pigra0
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水蛭高F值寡肽的酶解制備方法，其特征在于:步驟(1)和步驟(2 )中所述pH調(diào)至以8~11，調(diào)節(jié)pH至7.5~11，調(diào)節(jié)pH至7~10具體為:用0.l_2mol/LNaOH將pH調(diào)至所述pH值；所述收集上清液，調(diào)整pH至2~7具體為:用0.l-2mol/L的HCl將pH調(diào)至2~7。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水蛭高F值寡肽的酶解制備方法，其特征在于:所添加的堿性蛋白酶為Alcalase 2.4L，酶活力3.9323X 105U/mL，所添加的木瓜蛋白酶為Papain，酶活力 0.8231X 105U/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水蛭高F值寡肽的酶解制備方法，其特征在于:所述堿性蛋白酶添加量為400(Tl5000U/g pro，所述木瓜蛋白酶添加量為按200(T10000U/g pro。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水蛭高F值寡肽的酶解制備方法，其特征在于:所述堿性蛋白酶添加量為600(Tl3000U/g pro，所述木瓜蛋白酶添加量為200(T8000U/g pro。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水蛭高F值寡肽的酶解制備方法，其特征在于:所添加的活性炭為針劑型活性炭，添加活性炭重量與上清液體積比為0.5"10g:100mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水蛭高F值寡肽的酶解制備方法，其特征在于:步驟(2)中所述凝膠填料為Sephadex G_15。
9.由權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)所述的制備方法制備得到水蛭高F值寡肽，其特征在于:所述水蛭高F值寡肽的分子量在300— 1500Da ;所述F值為20.0—30.0。
10.權(quán)利要求9所述的水蛭高F值寡肽應(yīng)用于制備高F值寡肽功能性食品，所述功能性食品為粉劑、片劑、口服液或膠囊。
【文檔編號(hào)】C07K1/18GK104004087SQ201410198756
【公開(kāi)日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2014年5月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月12日
【發(fā)明者】吳暉, 任堯, 賴(lài)富饒, 楊祎靜, 李曉鳳 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)