一種用于人單個細(xì)胞基因組或線粒體dna pcr擴(kuò)增的內(nèi)參系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于人單個細(xì)胞基因組或線粒體DNA PCR擴(kuò)增的內(nèi)參系統(tǒng)，包含一對與細(xì)胞核重復(fù)核苷酸片段匹配的特異性引物和探針，其引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，探針序列如SEQ ID No.3。該內(nèi)參系統(tǒng)可用于單細(xì)胞擴(kuò)增的質(zhì)控及線粒體基因等相對拷貝數(shù)計算等。該系統(tǒng)的基本形式是基因組DNA PCR以及TaqMan熒光定量PCR法，其內(nèi)參是基于細(xì)胞核重復(fù)核苷酸序列設(shè)定的，適用于單細(xì)胞，亞細(xì)胞模板量的DNA PCR擴(kuò)增內(nèi)參，對稀有樣品特別適用，從而使得單細(xì)胞拷貝數(shù)等數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出真正的可靠性與價值。該系統(tǒng)可用于單細(xì)胞基礎(chǔ)研究，及臨床樣品檢測。
【專利說明】-種用于人單個細(xì)胞基因組或線粒體DNA PCR擴(kuò)增的內(nèi)參 系統(tǒng)

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種可用于人單個細(xì)胞基因組或線粒體DNA PCR擴(kuò)增的內(nèi)參系統(tǒng)，屬 于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 單細(xì)胞基因擴(kuò)增開始于上世紀(jì)90年代。目前，單細(xì)胞PCR擴(kuò)增在輔助生殖，腫瘤 等領(lǐng)域使用非常廣泛，體外受精卵細(xì)胞功能檢測，循環(huán)腫瘤細(xì)胞遺傳檢測，這些都是單細(xì)胞 基因擴(kuò)增檢測的典型例子。隨著高通量測序技術(shù)在研發(fā)與臨床應(yīng)用的逐步開展，單細(xì)胞基 因組擴(kuò)增檢測應(yīng)用越來越廣泛。
[0003] 但是在常規(guī)的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)單個細(xì)胞DNA檢測常常會出現(xiàn)細(xì)胞沒有挑到，細(xì) 胞全部或部分丟失，裂解不完全等現(xiàn)象，這就使得內(nèi)參非常重要，否則，其擴(kuò)增出的產(chǎn)物，測 出的基因絕對拷貝數(shù)等的代表性及意義就非常有限。
[0004] 只有兩個拷貝，只局限于一個染色體的小區(qū)域的其它內(nèi)參類型（如Actin， tubulin等），盡管在多細(xì)胞水平可以作為內(nèi)參，在單細(xì)胞水平則不適合做內(nèi)參，因為其無 法反映一個細(xì)胞其它區(qū)域的殘缺。在做單細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄RT-PCR時，因為同一種RNA可以有很 多拷貝，所以，其它類型的內(nèi)參也可以做單細(xì)胞RT-PCR的內(nèi)參，但不適合于單細(xì)胞基因組 或線粒體DNA擴(kuò)增的內(nèi)參。
[0005] 線粒體是細(xì)胞的重要煉油廠，能量來源。胎兒的線粒體基本從母親卵細(xì)胞獲得。卵 細(xì)胞線粒體功能直接影響早期受精卵的分裂，生長，胚胎的發(fā)育等。一些卵細(xì)胞線粒體異常 的婦女，體外輔助生殖成功率低，而將受精卵細(xì)胞核移到去核的正常卵細(xì)胞的胞漿中則能 糾正卵細(xì)胞線粒體的遺傳缺陷，這是解決線粒體病，線粒體嚴(yán)重缺失的重要方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 申請人:發(fā)明了一種用于人單個細(xì)胞基因組或線粒體DNA PCR擴(kuò)增的內(nèi)參系統(tǒng)。
[0007] 由于所針對的是單個細(xì)胞檢測，因此在傳統(tǒng)的檢測中常常會出現(xiàn)細(xì)胞沒有挑到， 細(xì)胞全部或部分丟失，裂解不完全等現(xiàn)象，這就使得內(nèi)參非常重要，否則，其擴(kuò)增出的產(chǎn)物， 測出的基因絕對拷貝數(shù)等的代表性及意義就非常有限。一般的基因在單個細(xì)胞內(nèi)只有兩個 拷貝，且只局限于一條染色體的一個非常小的區(qū)域，不適用于做單細(xì)胞或亞細(xì)胞DNA擴(kuò)增 內(nèi)參。由于重復(fù)核苷酸序列在一個細(xì)胞核里面有幾十萬到百萬拷貝，總量可達(dá)基因組順序 的10 %，而且在每個染色體都有廣泛分布。由于其拷貝數(shù)大且比較穩(wěn)定，因此本發(fā)明選擇了 細(xì)胞核重復(fù)核苷酸序列作為單細(xì)胞DNA擴(kuò)增的內(nèi)參從而用于人單細(xì)胞DNA PCR擴(kuò)增質(zhì)量控 制，線粒體等基因擴(kuò)增相對拷貝數(shù)計算等。
[0008] 有些單個細(xì)胞來源非常有限，如人卵細(xì)胞，而一個細(xì)胞常常又需要做很多不同的 檢測或研究，以及實驗的重復(fù)，這使得能用于做單個檢測的遺傳物質(zhì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于一個細(xì)胞的 遺傳物質(zhì)總量。我們的內(nèi)參系統(tǒng)非常適合于這種亞細(xì)胞水平下的檢測。
[0009] 本發(fā)明的內(nèi)參系統(tǒng)是以單細(xì)胞基因組擴(kuò)增PCR或TaqMan熒光定量PCR為基本形 式，以細(xì)胞核重復(fù)核苷酸片段為內(nèi)參。內(nèi)參引物與目標(biāo)引物同存在與一個反應(yīng)體系中，分別 同時擴(kuò)增目標(biāo)基因與內(nèi)參片段。在TaqMan PCR擴(kuò)增中，探針的存在增加了反應(yīng)信號的特異 性。反應(yīng)體系中還包括單細(xì)胞裂解物（擴(kuò)增模板），DNA聚合酶，擴(kuò)增底物，及反應(yīng)緩沖液。 [0010] 在本發(fā)明的內(nèi)參系統(tǒng)中，包含一對與細(xì)胞核重復(fù)核苷酸片段匹配的特異性引物和 探針，其引物序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,探針序列如SEQ ID No. 3。
[0011] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，上述的序列并非是絕對的，還可以采用與上述序列具有 較高同源度的序列，所述較高同源度是指上述序列的兩端變換或加減5-10個核苷酸堿基， 或中間順序堿基有5-10個被替代，或兩者都有。
[0012] 本發(fā)明的內(nèi)參系統(tǒng)可以用于單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒，該試劑盒可用于內(nèi)參用于檢測人 單個細(xì)胞線粒體等基因的相對拷貝數(shù)，或用于單細(xì)胞擴(kuò)增的質(zhì)控，驗證待測樣品有無收集 到單個細(xì)胞，如有，單個細(xì)胞的遺傳物質(zhì)是否完整，如部分丟失，或細(xì)胞裂解不完全。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1為不同人細(xì)胞擴(kuò)增模板量內(nèi)參擴(kuò)增線性圖（0. 1-10個Hela細(xì)胞）。
[0014] 圖2為單個人卵細(xì)胞線粒體及內(nèi)參qPCR擴(kuò)增圖（上部為線粒體基因擴(kuò)增，下部為 內(nèi)參基因擴(kuò)增。實際模板用量0.05個卵細(xì)胞）。

【具體實施方式】
[0015] 實施例1 :不同人細(xì)胞擴(kuò)增模板量內(nèi)參擴(kuò)增線性關(guān)系
[0016] 取生長正常的人Hela細(xì)胞50個，裂解在IOul細(xì)胞裂解液中（細(xì)胞裂解液由Tris 緩沖液，加 SDS及蛋白酶K組成），充分裂解后（50°C 50分鐘，80°C 10分鐘），用細(xì)胞裂解液 稀釋成每2ul含0. 1，0. 3，1，3,9個細(xì)胞，作為模板，做TaqMan qPCR擴(kuò)增內(nèi)參。擴(kuò)增后，計 算各反應(yīng)組Ct值。每組兩個重復(fù)。
[0017] 實驗結(jié)果如下表1和附圖1所示。
[0018] 表1 :不同人細(xì)胞擴(kuò)增模板量對應(yīng)的Ct
[0019]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于人單個細(xì)胞基因組或線粒體DNA PCR擴(kuò)增的內(nèi)參系統(tǒng)，包含一對與細(xì)胞核 重復(fù)核苷酸片段匹配的特異性引物和探針，其引物序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2,探 針序列如SEQ ID No. 3。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)參系統(tǒng)，其特征在于引物或探針順序為與上述序列具有較 高同源度的序列，所述較高同源度是指上述序列的兩端變換或加減5-10個核苷酸堿基，或 中間順序堿基有5-10個被替代，或兩者都有。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的內(nèi)參系統(tǒng)，其特征在于內(nèi)參用于檢測人單個細(xì)胞線粒 體等基因的相對拷貝數(shù)，或用于單細(xì)胞擴(kuò)增的質(zhì)控，驗證待測樣品有無收集到單個細(xì)胞，如 有，單個細(xì)胞的遺傳物質(zhì)是否完整，如部分丟失，或細(xì)胞裂解不完全。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1，2, 3任一所述的內(nèi)參系統(tǒng)，其特征在于基于這個基本方法研發(fā)成的 檢測試劑盒，用于實驗室研究，或臨床樣品檢測。
【文檔編號】C12N15/11GK104372002SQ201410558839
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】朱克卿, 朱霞, 胡月, 陸思嘉, 王春香 申請人:江蘇億康基因科技有限公司