一種基于高通量測序的線粒體基因組文庫及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于高通量測序的線粒體基因組文庫及其構(gòu)建方法。所述構(gòu)建方法包括以下步驟：S1、自總DNA中一步PCR擴(kuò)增線粒體全長DNA；S2、將線粒體全長DNA打碎，得到DNA片段；S3、對DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，得到平末端DNA片段；S4、在平末端DNA片段3’端加A，得到加A的DNA片段；S5、在加A的DNA片段的3’端加接頭，得到加接頭的DNA片段；S6、對加接頭的DNA片段進(jìn)行前LM?PCR；S7、對LM?PCR產(chǎn)物進(jìn)行后PCR。本發(fā)明線粒體基因組文庫構(gòu)建方法通過自總DNA中一步PCR擴(kuò)增得到線粒體全長DNA，可以保障人類線粒體基因組的精確擴(kuò)增，不被在人類基因組的同源序列污染混合使突變檢測更靈敏和準(zhǔn)確。
【專利說明】
一種基于高通量測序的線粒體基因組文庫及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種基于高通量測序的線粒體基因組文庫及 其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生能量的細(xì)胞器。線粒體DNA是線粒體中的遺傳物質(zhì)，呈雙鏈環(huán) 狀。一個線粒體中可有一個或數(shù)個線粒體DNA分子。人類線粒體DNA(mtDNA)，共包含37個基 因，其中，22個基因編碼轉(zhuǎn)移核糖核酸（tRNA)，2個基因編碼核糖體核糖核酸（12S和 16SrRNA)，13個基因編碼多肽。這些線粒體基因組上的基因是線粒體產(chǎn)生功能蛋白所必不 可少，而且線粒體核糖體是存在于線粒體基質(zhì)內(nèi)的一種核糖體，負(fù)責(zé)完成線粒體內(nèi)進(jìn)行的 翻譯工作。
[0003] 線粒體疾病是由于線粒體的功能不正常而導(dǎo)致的一些疾病。線粒體疾病往往是由 于線粒體DNA的突變造成的。這些基因突變可能在mtDNA上，也可能發(fā)生在核基因上。對于線 粒體疾病患者進(jìn)行線粒體基因組的分析而發(fā)現(xiàn)相關(guān)基因突變是一種理想的遺傳學(xué)診斷方 法。由于線粒體病涉及基因眾多，目前臨床只能選擇少數(shù)常見的線粒體基因位點進(jìn)行突變 和缺失篩查，陽性率很低，大多數(shù)患者難以獲得準(zhǔn)確的病因診斷。
[0004] 高通量測序技術(shù)也稱二代測序、下一代測序技術(shù)、深度測序或大規(guī)模平行測序，它 是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定。其核心 思想是邊合成邊測序(Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確 定DNA的序列。高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可 能。目前，主要有三種主流的測序平臺：illumina公司Hiseq平臺、life technologies公司 的PGM平臺以及Roche公司的454平臺。
[0005] 高通量測序技術(shù)由于其超高的測序能力在科研和臨床中具有極為重要的應(yīng)用。然 而，雖然二代測序大大降低了 DNA分析的成本，其樣本制備過程依然繁瑣，成為其今后廣泛 應(yīng)用中的一種障礙。因此，人們對其DNA文庫構(gòu)建方法進(jìn)行了大量研究，以期簡化樣本的制 備步驟。
[0006] 如公開號為CN 104894651 A的中國發(fā)明專利申請公開了 一種微量起始DNA的高通 量測序文庫構(gòu)建方法及其所構(gòu)建的高通量測序文庫。該構(gòu)建方法包括:步驟S1、對樣本DNA 進(jìn)行物理打斷，得到片段化DNA;步驟S2、對片段化DNA進(jìn)行末端修復(fù)及加 A，得到修復(fù)DNA;步 驟S3、利用連接增強(qiáng)劑對修復(fù)DNA進(jìn)行接頭連接，得到帶接頭片段;步驟S4、對帶接頭片段進(jìn) 行擴(kuò)增，得到高通量測序文庫;連接增強(qiáng)劑為DMS0、乙醇、乙二醇或甘油。在所述步驟S3之后 以及所述步驟S4之前，所述構(gòu)建方法還包括對所述帶接頭片段進(jìn)行磁珠純化的步驟。對所 述連接片段進(jìn)行分步擴(kuò)增，并在每次擴(kuò)增之后增加磁珠純化的步驟。所述步驟S4包括:對所 述帶接頭片段擴(kuò)增4~7個循環(huán)，得到第一擴(kuò)增片段;對所述第一擴(kuò)增片段進(jìn)行0.95~1.20 倍體積的磁珠純化，得到第一擴(kuò)增純化片段;對所述第一擴(kuò)增純化片段擴(kuò)增6~9個循環(huán)，得 到第二擴(kuò)增片段;對所述第二擴(kuò)增片段進(jìn)行0.95~1.20倍體積的磁珠純化，得到第二擴(kuò)增 純化片段；以及利用ο. 7~0.85倍體積的磁珠對所述第二擴(kuò)增純化片段進(jìn)行分選，得到所述 高通量測序文庫。該發(fā)明中磁珠純化分開進(jìn)行且磁珠用量不同，純化操作復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，有必要針對上述的問題，本發(fā)明提供一種基于高通量測序的線粒體基 因組文庫及其構(gòu)建方法。
[0008] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] -種基于高通量測序的線粒體基因組文庫構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0010] S1、自總DNA中用一步PCR擴(kuò)增線粒體全長DNA;
[0011] S2、將線粒體全長DNA打碎，得到DNA片段；
[0012] S3、對DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，得到平末端DNA片段；
[0013] S4、在平末端DNA片段3'端加 A，得到加 A的DNA片段；
[0014] S5、在加 A的DNA片段的3 '端加接頭，得到加接頭的DNA片段；
[0015] S6、對加接頭的DNA片段進(jìn)行前LM-PCR;
[0016] S7、對 LM-PCR 產(chǎn)物進(jìn)行后 PCR。
[0017]優(yōu)選地，所述步驟S1具體為:提取全血DNA，并以其為模板PCR擴(kuò)增線粒體全長DNA〇
[0018] 更優(yōu)選地，步驟S 1中所用引物對的具體序列為P r i m e r F : ccgcacaagagtgctactctcctc，Primer R:gatattgatttcacggaggatggtg〇
[0019] 優(yōu)選地，所述步驟SI中PCR反應(yīng)體系如下：
[0020]
[0021 ]優(yōu)選地，所述步驟S1中PCR反應(yīng)的程序如下：
[0022] Lid：105°C ,ffait,Auto；Block：95〇C ,2min；
[0023] 95〇C ,20sec；68〇C ,18min；30cycles；
[0024] 72〇C,20min；4〇C,hold〇
[0025] 優(yōu)選地，前LM-PCR的反應(yīng)體系如下：
[0026]
[0027] 優(yōu)選地，前LM-PCR的反應(yīng)條件如下：98°C45sec;98°C15sec，60°C30sec，72°C 30sec，9cycles;72°C lmin;4°C 〇
[0028] 優(yōu)選地，后PCR反應(yīng)的體系如下：
[0029]
[0030] 優(yōu)選地，后PCR反應(yīng)的條件如下：98°C45sec;98°C15sec，60°C30sec，72°C30sec， 14cycles;72°C lmin;4°C 〇
[0031] 優(yōu)選地，所述步驟S3-S7包含純化步驟。
[0032]優(yōu)選地，純化步驟為：向樣本中加入相應(yīng)的反應(yīng)液混勻，室溫孵育10分鐘，使DNA與 磁珠充分結(jié)合;將管放置于磁力架上，直至溶液變清澈，棄掉上清，將管繼續(xù)留在磁力架上， 加入80 %酒精，室溫孵育30秒以上，吸走酒精，將管繼續(xù)留在磁力架上，加入80 %酒精，室溫 孵育30秒以上，吸走酒精;室溫下充分干燥。
[0033]更優(yōu)選地，當(dāng)需要將DNA與磁珠分離時，純化后將管從磁力架上取出，加入pH 8.0 的10mM Tris-HCl，室溫孵育2分鐘即可。
[0034] -種基于高通量測序的線粒體基因組文庫，通過上述線粒體基因組文庫構(gòu)建方法 構(gòu)建。
[0035] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0036] 本發(fā)明線粒體基因組文庫構(gòu)建方法通過自總DNA中一步PCR擴(kuò)增得到線粒體全長 DNA，可以保障人類線粒體基因組的精確擴(kuò)增，不被在人類基因組的同源序列污染混合使突 變檢測更靈敏和準(zhǔn)確，且節(jié)省了時間；通過進(jìn)行前LM-PCR可以引入不同序列以備高通量測 序使用;通過進(jìn)行后PCR可以獲得足夠數(shù)量的DNA，以便進(jìn)行后續(xù)高通量測序。
[0037]本發(fā)明線粒體基因組文庫構(gòu)建方法在末端修復(fù)、加 A、加接頭、前LM-PCR和后PCR后 進(jìn)行純化，且末端修復(fù)、加 A后純化DNA不與磁珠分離，簡化了操作步驟，節(jié)省了時間。
[0038]對本發(fā)明構(gòu)建的線粒體DNA文庫進(jìn)行高通量測序，進(jìn)行生物信息分析得到檢測樣 本線粒體基因組DNA序列，便可檢測出不同突變類型和對之進(jìn)行定量。由于高通量測序具有 對常見和罕見變異高靈敏度，能發(fā)現(xiàn)線粒體的編碼區(qū)外顯子區(qū)絕大部分疾病相關(guān)變異。可 以通過增加測序深度，提高突變檢測的敏感度。在5000x的覆蓋深度，獲得更多的序列信息 進(jìn)行統(tǒng)計分析，可以達(dá)到的敏感度為0.1-1%。
【附圖說明】
[0039] 圖1為步驟S1中PCR產(chǎn)物電泳圖。
[0040]圖2為步驟S2中片段打碎電泳圖。
[0041 ] 圖3為步驟S6中前LM-PCR產(chǎn)物純化后電泳圖。
[0042] 圖4為步驟S7中后PCR產(chǎn)物純化后電泳圖。
【具體實施方式】
[0043] 為了更好的說明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】做進(jìn)一步說明。除有特殊 說明外，本發(fā)明中所用的試劑、設(shè)備或方法等都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，在此不再贅 述。
[0044] 本發(fā)明中使用的以下試劑的配方如下：
[0045] 末端修復(fù)反應(yīng)混合物(End Repair Master Mix，20μ1):
[0046] 水 8μ1
[0047] 10XΚΑΡΑ End Repair Buffer 7μ1
[0048] ΚΑΡΑ End Repair Enzyme Mix 5μ1〇
[0049] 加 A反應(yīng)混合物(A-Tailing Master Mix，5〇yl):
[0050] 水 42μ1
[0051] 10XΚΑΡΑ A-Tailing Buffer 5μ1
[0052] ΚΑΡΑ A-Tailing Enzyme 3μ1〇
[0053] 連接混合物（Ligation Master Μ?χ，55μ1):
[0054] 水 30μ1
[0055] 5XΚΑΡΑ Ligation Buffer 10μ1
[0056] ΚΑΡΑ T4DNA Ligase 5μ1。
[0057] 實施例1
[0058] 一種基于高通量測序的線粒體基因組檢測和分析方法，包括以下步驟：
[0059] S1、PCR擴(kuò)增線粒體全長DNA
[0060] 按照常規(guī)方法從300μ1全血中提取DNA，取2μ1 DNA樣本在NanoDrop上進(jìn)行濃度測 定。測得DNA濃度要求0D260/0D280比值在1.8~2.0之間，0D260/0D230比值在1.8~2.2之 間，以上兩個比值可以判斷所提取的DNA純度如何。若超出上述范圍，則可認(rèn)為提取DNA純度 不符合要求，需重新提取或再純化。根據(jù)測定的濃度，用DNA溶解緩沖液進(jìn)一步稀釋到濃度 為50ng/yl。
[0061 ]以稀釋后的全血DNA為模板進(jìn)行一步PCR擴(kuò)增線粒體全長DNA，PCR反應(yīng)體系如表1 所示。
[0062] 表1、PCR反應(yīng)體系
[0063]
[0064] 本實施例中所用的引物對是發(fā)明人根據(jù)已公開的線粒體序列設(shè)計的，可以擴(kuò)增線 粒體全長DNA，具體序列如下：
[0065] Primer F(SEQ ID NO：1):ccgcacaagagtgctactctcctc,
[0066] Primer R(SEQ ID N0：2):gatattgatttcacggaggatggtg〇
[0067] 上述PCR反應(yīng)的程序如下：
[0068] Lid:105°C，Wait，Auto;Block:95°C，2min。
[0069] 95°C，20sec;68°C，18min;30cycles〇
[0070] 72°C，20min;4°C，hold。
[0071] 取2μ1所得PCR產(chǎn)物和3μ1染料混勻，用1 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，電泳條件 為100v，60min。結(jié)果如圖1所示。第1泳道是分子大小標(biāo)記，第2、3泳道是對不同樣本進(jìn)行線 粒體擴(kuò)增，大小約為16kb，第4泳道是陰性對照。
[0072] S2、片段打碎
[0073]將擴(kuò)增后的基因組DNA用Q800R超聲波破碎儀打斷。具體步驟如下：
[0074] 往杯式探頭杯中加入純水，且沒過鈦合金探頭。在0.5ml的離心管中轉(zhuǎn)入40μ1擴(kuò)增 產(chǎn)物，將其固定在樣本固定器上，并輕輕彈走底部的氣泡。將樣本固定器放入到杯式探頭 中，并再次往杯式探頭中加入純水，直至純水液面與管中DNA液面平齊。
[0075] 提前開啟Q800R的循環(huán)冷凝水系統(tǒng)，設(shè)置溫度在3°C。在主機(jī)上設(shè)置好打斷程序： Pulse on 20sec;Pulse off 30sec;Time 20min;Amplitude 40%。待溫度降到設(shè)定溫度3 °C時，即可開啟打斷程序。程序運行完成后，將微管中的樣本冷凍保存。所有樣本完成打斷 后，關(guān)掉循環(huán)冷凝水系統(tǒng)，關(guān)閉發(fā)動機(jī)。
[0076] 每例樣本取?μL，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，最終每例樣本的片段長度應(yīng)在 500bp以下，峰值在350bp為合格。結(jié)果如圖2所示。第1泳道是分子大小標(biāo)記，第2、3泳道是為 對不同樣本進(jìn)行DNA打斷，片段大小在500bp以下，峰值約350bp左右。
[0077] S3、末端修復(fù)
[0078]每例樣本取50μ1 DNA片段，加入20μ1末端修復(fù)反應(yīng)液，總體積70μ1。在熱循環(huán)儀 (擴(kuò)增儀)上20°C孵育30min，結(jié)束后立即進(jìn)行純化。
[0079] 純化的具體方法如下：向每例樣本中加入120μ1的AgencourtRAMPure RXP reagent， 總體積190μ1。用移液槍上下反復(fù)吸打，充分混勻溶液。室溫孵育10分鐘，使DNA與磁珠充分 結(jié)合。將管放置于磁力架上，直至溶液變清澈，小心棄掉上清。將管繼續(xù)留在磁力架上，加入 200μ1 80%酒精。室溫孵育30秒以上，小心吸走酒精。將管繼續(xù)留在磁力架上，加入200μ1 80%酒精。室溫孵育30秒以上，小心吸走酒精，此步應(yīng)盡可能將酒精吸干凈，但應(yīng)注意不要 吸走底部的磁珠。室溫充分干燥。將管從磁力架上取出。
[0080] S4、加 A
[00811向每個含有修復(fù)DNA-磁珠的管中加入50μ1的加 A反應(yīng)混合物，總體積50μ1。移液槍 上下反復(fù)吸打，充分混勻樣本。熱循環(huán)儀(擴(kuò)增儀)上30°C孵育30min，結(jié)束后立即進(jìn)行純化。 [0082] 純化的具體方法如下：向每例樣本中加入90μ1的PEG/NaclSPRIRSolution，總體積 140μ1。用移液槍上下反復(fù)吸打，充分混勻溶液。室溫孵育10分鐘，使DNA與磁珠充分結(jié)合。將 管放置于磁力架上，直至溶液變清澈，小心棄掉上清。將管繼續(xù)留在磁力架上，加入200μ1 80 %酒精。室溫孵育30秒以上，小心吸走酒精。將管繼續(xù)留在磁力架上，加入200μ1 80 %酒 精。室溫孵育30秒以上，小心吸走酒精，此步應(yīng)盡可能將酒精吸干凈，但應(yīng)注意不要吸走底 部的磁珠。室溫充分干燥。
[0083] S5、加接頭
[0084] 向每個加了 Α的DNA樣本管中加入以下反應(yīng)液： 水 2μΙ 連接混合物 45μ1
[0085] 接頭 3μΙ 總體積 50μ1。
[0086]用移液槍上下反復(fù)吸打，充分混勻樣本。熱循環(huán)儀(擴(kuò)增儀)上20°C孵育15min，結(jié) 束后立即進(jìn)行后續(xù)純化步驟。純化的具體方法如下：
[0087] 向每例樣本中加入50μ1的PEG/NaclSPRIRSolution總體積100μΙ。用移液槍上下反 復(fù)吸打，充分混勻溶液。室溫孵育10分鐘，使DNA與磁珠充分結(jié)合。將管放置于磁力架上，直 至溶液變清澈，小心棄掉上清。將管繼續(xù)留在磁力架上，加入200μ1 80%酒精。室溫孵育30 秒以上，小心吸走酒精。將管繼續(xù)留在磁力架上，加入200μ1 80 %酒精。室溫孵育30秒以上， 小心吸走酒精，此步應(yīng)盡可能將酒精吸干凈，但應(yīng)注意不要吸走底部的磁珠。室溫充分干 燥。將管從磁力架上取出。加入50μ1的10mM Tris-HCl(pH 8.0)，室溫孵育2分鐘，使得DNA從 磁珠上分離開來。將上清全部轉(zhuǎn)移至一個新的管中，繼續(xù)后面的操作。
[0088] S6、前LM-PCR
[0089] 前LM-PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表2和表3所示。
[0090] 表2、前LM-PCR的反應(yīng)體系
[0091]
[0092] 表3、前LM-PCR的反應(yīng)條件
[0093]
[0094] 樣本在4°C或_20°C保存72小時，或者直接進(jìn)行后續(xù)的純化實驗。前LM-PCR產(chǎn)物純 化的具體方法為：
[0095] 每例樣本中加入50μ1的AgencourtRAMPureRXP reagent，總體積100μΙ。用移液槍上 下反復(fù)吸打，充分混勻溶液。室溫孵育10分鐘，使DNA與磁珠充分結(jié)合。將管放置于磁力架 上，直至溶液變清澈，小心棄掉上清。將管繼續(xù)留在磁力架上，加入200μ1 80 %酒精。室溫孵 育30秒以上，小心吸走酒精。將管繼續(xù)留在磁力架上，加入200μ1 80 %酒精。室溫孵育30秒 以上，小心吸走酒精，此步應(yīng)盡可能將酒精吸干凈，但應(yīng)注意不要吸走底部的磁珠。室溫充 分干燥。將管從磁力架上取出。加入50μ1 10mM Tris-HCl(pH 8.0)，室溫孵育2分鐘，使得 DNA從磁珠上分離開來。
[0096 ]用1.5 %凝膠電泳、Nano dr ο p及Qub i t測定擴(kuò)增后的DNA濃度及片段大小。如圖3所 示，第1泳道是分子大小標(biāo)記，第2、3泳道是為對不同樣本進(jìn)行前LM-PCR，片段大小約在 400bp左右。Qubit測定擴(kuò)增后的第2、3泳道兩個樣品DNA濃度分別為34.2ngAU和42.2ngAi 1〇
[0097] S7、后PCR
[0098] 后PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如表4和表5所示。
[0099] 表4、后PCR反應(yīng)體系
[0100]
[0101] 表5、后PCR反應(yīng)條件
[0102]
[0103]樣本在4°C或-20 °C保存72小時，或者直接進(jìn)行后續(xù)的純化實驗。PCR后純化的方法 為：
[0104] 將AgencourtRAMPureRXP reagent翻轉(zhuǎn)幾次，使得其充分混勾。往每個樣本管中加 入90μ1的AgencourtRAMPureRXP reagent，禍旋2秒。室溫放置15min。瞬時離心，然后將樣本 放入磁力架中，靜置直至液體變得清澈。小心吸走溶液，注意不要吸走底部的磁珠。不要從 磁力板中移走樣本管，直接往管中加入200μ1 80 %酒精，靜置lmin，然后吸出液體。重復(fù)該 步驟一次。將管放入到加熱器中，37±0.5°(：，51^11，或者直到管中酒精完全蒸發(fā)。用52以1的 NF水溶解磁珠。移液器吹打10次，室溫2min。將離心管放回到磁力板中直至溶液變清澈。每 例樣本直接轉(zhuǎn)移50μ1至1.5ml離心管中。
[0105]用1.5%凝膠電泳、Qubit及qPCR測定擴(kuò)增后的DNA濃度及片段大小。經(jīng)過多重PCR 后，此時產(chǎn)物中將增加68bp附加物，應(yīng)注意仔細(xì)觀察峰值出現(xiàn)是否一致。凝膠電泳圖如圖4 所示，第1泳道是分子大小標(biāo)記，第2、3泳道是為對不同樣本進(jìn)行后PCR，峰值約在400bp左 右。下表為Qubit及qPCR測定擴(kuò)增后的DNA濃度如表6所示。
[0106] 表6、Qubit及qPCR測定擴(kuò)增后的DNA濃度
[0107]
[0108] 對本發(fā)明構(gòu)建的線粒體DNA文庫進(jìn)行高通量測序，進(jìn)行生物信息分析得到檢測樣 本線粒體基因組DNA序列，便可檢測出不同突變類型和對之進(jìn)行定量。由于高通量測序具有 對常見和罕見變異高靈敏度，能發(fā)現(xiàn)線粒體的編碼區(qū)外顯子區(qū)絕大部分疾病相關(guān)變異?？?以通過增加測序深度，提高突變檢測的敏感度。在5000x的覆蓋深度，獲得更多的序列信息 進(jìn)行統(tǒng)計分析，可以達(dá)到的敏感度為0.1-1%。
[0109]以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種基于高通量測序的線粒體基因組文庫構(gòu)建方法，其特征在于，包括W下步驟： 51、 自總DNA中一步PCR擴(kuò)增線粒體全長DNA; 52、 將線粒體全長DNA打碎，得到DNA片段； 53、 對DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，得到平末端DNA片段； 54、 在平末端DNA片段3 '端加 A，得到加 A的DNA片段； 55、 在加 A的DNA片段的3'端加接頭，得到加接頭的DNA片段； 56、 對加接頭的DNA片段進(jìn)行前LM-PCR; 57、 對LM-PCR產(chǎn)物進(jìn)行后PCR。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的線粒體基因組文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟Sl具體 為:提取全血DNA，并W其為模板PCR擴(kuò)增線粒體全長DNA。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的線粒體基因組文庫構(gòu)建方法，其特征在于，步驟Sl中所用引物 又守白勺；"(本歹Ll ^Primer F:cc 邑cacaa邑a邑 t 邑ctactctcctc，Primer R : 邑曰t曰tt邑曰tttc曰Cggsggstggtgo4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的線粒體基因組文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟Sl中PCR 反應(yīng)體系如下：12 根據(jù)權(quán)利要求4所述的線粒體基因組文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟Sl中PCR 反應(yīng)的程序如下： Lid:105°C，Wait，Auto;Block:95°C，2min; 95°C ,20sec；68°C ,18min；30cycles； 72°C,20min；4°C,hold〇 2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的線粒體基因組文庫構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S6中前LM-PCR 的反應(yīng)體系如下：7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的線粒體基因組文庫構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S6中前LM-PCR 的反應(yīng)條件如下：98°C45sec;98°C15sec，60°C30sec，72°C30sec，9cycles;72°Clmin;4°C。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的線粒體基因組文庫構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S7中后PCR反 應(yīng)的體系如下：后PCR反應(yīng)的條件如下：98°C45sec;98°C15sec，60°C30sec，72°C30sec，14(：ycles;72°C lmin;4°C。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的線粒體基因組文庫構(gòu)建方法，其特征在于，所述步驟S3-S7包 含純化步驟。10. -種基于高通量測序的線粒體基因組文庫，其特征在于，通過權(quán)利要求1所述的線 粒體基因組文庫構(gòu)建方法構(gòu)建。
【文檔編號】C40B40/06GK105907748SQ201610308792
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】張巍
【申請人】廣州嘉檢醫(yī)學(xué)檢測有限公司