專利名稱：一種擬穴青蟹線粒體全基因組dna及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于擬穴青蟹基因組學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
在絕大多數(shù)的多細(xì)胞動(dòng)物中，線粒體基因組DNA為典型的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度在14 18kb之間，能夠自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。線粒體·基因組通常編碼37個(gè)基因，包括13個(gè)蛋白編碼基因、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因，此外，還包含I個(gè)大的非編碼區(qū)(controI region)。線粒體全基因組不僅能夠提供比單基因更多的遺傳信息，而且能夠揭示出基因組水平的特征，從而有助于更好的理解基因組進(jìn)化與發(fā)育特點(diǎn)。到目前為止，學(xué)者們已經(jīng)揭示了較多甲殼類動(dòng)物的線粒體全基因組DNA信息，包括斑節(jié)對(duì)蝦、中國(guó)對(duì)蝦、中華絨螯蟹、三疣梭子蟹、鋸緣青蟹、日本轉(zhuǎn)等。由于具有單倍性、低重組率、母性遺傳及進(jìn)化速率快等特點(diǎn)，線粒體DNA已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于遺傳學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化學(xué)及物種鑒定等領(lǐng)域。擬穴青蟹(Scyl Iaparamamosain)俗稱青蟹,在我國(guó)主要分布于長(zhǎng)江口及以南沿海海域，是我國(guó)重要的海洋漁業(yè)資源和海水養(yǎng)殖蟹類。擬穴青蟹具有體型大、生長(zhǎng)速度快、肉味鮮美等優(yōu)點(diǎn)，深受廣大消費(fèi)者青睞。近年來，我國(guó)擬穴青蟹的人工養(yǎng)殖年產(chǎn)量一直穩(wěn)定在10萬噸以上，保持了健康的發(fā)展勢(shì)頭。學(xué)者們圍繞擬穴青蟹繁殖生物學(xué)、養(yǎng)殖生物學(xué)等方面已經(jīng)開展了較多的研究工作。此外，開展了微衛(wèi)星和SNPs分子標(biāo)記研究，同時(shí)，還克隆了擬穴青蟹線粒體CO1、12S rRNA和16S rRNA基因序列，并分別利用這3種基因標(biāo)記分析了青蟹屬4個(gè)種的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。然而，單基因標(biāo)記所揭示的遺傳信息遠(yuǎn)低于全基因組所提供的信息，并且有可能對(duì)研究結(jié)果起誤導(dǎo)作用。因此，有必要開展擬穴青蟹線粒體全基因組DNA研究，從基因組水平揭示其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和種群遺傳多樣性水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA及檢測(cè)方法，該方法具有快速、低成本、容易掌握等優(yōu)點(diǎn)，所獲得的線粒體全基因組DNA可應(yīng)用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源鑒定與保護(hù)及系統(tǒng)發(fā)育等領(lǐng)域。本發(fā)明的獲得的擬穴青蟹線粒體全基因組DNA為閉合環(huán)形結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為15824bp，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測(cè)方法，包括( I)擬穴青蟹線粒體相關(guān)基因序列的收集與分析可通過三種方法獲得擬穴青蟹的線粒體相關(guān)基因序列一是從測(cè)序獲得的基因組文庫(kù)或轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中查找；二是從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公開的擬穴青蟹基因序列中查找；三是若通過以上兩種渠道無法獲得相關(guān)基因序列，則可通過收集近緣種的線粒體序列進(jìn)行同源比對(duì)，在保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，然后以擬穴青蟹的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過測(cè)序后獲得擬穴青蟹線粒體部分基因序列。最后，將獲得的部分基因序列與近緣種的線粒體全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，分析相關(guān)基因在近緣種的線粒體全基因組序列上的相對(duì)位置。(2 )引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增根據(jù)擬穴青蟹線粒體基因在近緣種全基因組序列上的相對(duì)位置，以擬穴青蟹基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，采用PCR方法擴(kuò)增相鄰的兩個(gè)已知基因間的未知序列。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 yl，包括基因組DNA模板I yl、終濃度均為0.4iimol/L的上下游引物、終濃度為1. 5mmol/L Mg2+、終濃度為 0. 2mmol/L dNTP、0. 75U TagDNA 聚合酶、I XPCR buffer，最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為25iU ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、特異性的退火溫度退火50秒、72°C延伸50秒，35個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸5分鐘。PCR反應(yīng)完成后，采用1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物的質(zhì)量。所述步驟(2)中的引物序列和退火溫度如表1:表I
權(quán)利要求
1.一種擬穴青蟹全基因組DNA，其特征在于所述DNA分子為閉合環(huán)形結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為15824bp，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測(cè)方法，包括 (1)收集擬穴青蟹線粒體相關(guān)基因序列，并與近緣種的線粒體全基因組序列進(jìn)行比對(duì)，分析相關(guān)基因在近緣種的線粒體全基因組序列上的相對(duì)位置； (2)根據(jù)線粒體基因在近緣種全基因組序列上的相對(duì)位置設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法擴(kuò)增相鄰的兩個(gè)已知序列間的未知序列； (3)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序、序列分析，將所有線粒體相關(guān)基因序列進(jìn)行組裝，獲得全基因組DNA序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(I)中線粒體相關(guān)基因序列來源于測(cè)序獲得的基因組文庫(kù)或轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)、GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公開的擬穴青蟹線粒體基因序列；或通過近緣種的線粒體序列進(jìn)行同源比對(duì)，并在保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，然后以擬穴青蟹DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序后獲得擬穴青蟹線粒體部分基因序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(I)中的近緣種為鋸緣青蟹、欖綠青蟹、紫鰲青蟹、三疣梭子蟹或日本蟲尋。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(2)中的引物共3對(duì)，其引物序列和退火溫度為Sp-ND3-5 F GGAGCTTTAGAATGATCTAAGTAATRAAAGTAGCAGATAAAGGTTGATTTG 退火溫度為53°C ；Sp-16-12S F AATTATCCCTGATACACAAGGTACARTTAGTCTTGTCAGAGGAACCTGTT 退火溫度為55°C ；Sp-12-ND2 F AAAGTATAACCGCAACTGCTGGCACRTTAATTCAAACAGAACTAAAGAGAT 退火溫度為60°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(2)中的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 yl，包括基因組DNA模板I yl、終濃度均為.0.4umol/L 的上下游引物、終濃度為1. 5mmol/L Mg2+、終濃度為 0. 2mmol/LdNTP、0. 75U TagDNA聚合酶、I XPCR buffer，最后補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為25 ;反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒、特異性的退火溫度退火50秒、72°C延伸50秒，35個(gè)循環(huán)；最后于72°C延伸5分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(3)中的PCR產(chǎn)物的測(cè)序方法為雙向、直接測(cè)序。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA的檢測(cè)方法，其特征在于所述步驟(3)中的組裝方法是以鋸緣青蟹的線粒體全基因組DNA序列為參照物，將所有擬穴青蟹線粒體的基因序列進(jìn)行拼接，獲得擬穴青蟹線粒體全基因組DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種擬穴青蟹線粒體全基因組DNA及檢測(cè)方法，該DNA分子為閉合環(huán)形結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為15824bp；檢測(cè)方法包括(1)擬穴青蟹線粒體相關(guān)基因序列的收集及與近緣種線粒體全基因組序列的比對(duì)；(2)引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增；(3)PCR產(chǎn)物測(cè)序與序列組裝。本發(fā)明獲得了擬穴青蟹線粒體全基因組DNA序列。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有快速、低成本、容易掌握等優(yōu)點(diǎn)，所獲得的線粒體全基因組DNA可應(yīng)用于擬穴青蟹遺傳變異分析、種質(zhì)資源鑒定與保護(hù)及系統(tǒng)發(fā)育等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103060332SQ20121055363
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月19日
發(fā)明者馬洪雨, 馬凌波, 馬春艷 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所