專(zhuān)利名稱(chēng)：：母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494位c-t和1555位a-g突變的檢測(cè)方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體講是涉及母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494位C_T突變和1555位A—G突變的檢測(cè)方法。本發(fā)明還涉及制備根據(jù)該方法的體外檢測(cè)母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494位C一T突變和1555位A—G突變的試劑盒，以及該試劑盒在檢測(cè)所述的1494位C—T突變和1555位A—G突變中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：氨基糖甙類(lèi)抗生素(鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素及小諾霉素等)因其廣譜高效的抗菌作用以及低廉的價(jià)格在臨床上被廣泛用于控制革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌感染，但此類(lèi)抗生素具有嚴(yán)重的耳毒性作用，可使患者發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的聽(tīng)力損失。近十年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，部分氨基糖甙類(lèi)抗生素致聾患者有母系遺傳家族史，并與線(xiàn)粒體DNA12SrRNA基因1494C一T和1555A—G均質(zhì)性點(diǎn)突變有關(guān)。單次劑量的氨基糖甙類(lèi)藥物應(yīng)用即可導(dǎo)致攜帶1494C一T或1555A—G突變個(gè)體的重度聽(tīng)力損失。根據(jù)目前已有的研究結(jié)果可知，幾乎攜帶1494C一T或1555A—G突變的個(gè)體在應(yīng)用不同劑量的氨基糖甙類(lèi)抗生素后均可發(fā)生嚴(yán)重或者較嚴(yán)重的聽(tīng)力損失，是后天性獲得性耳聾發(fā)生的重要原因。鑒于這一耳聾的有明確的基因變化和誘發(fā)因素，使得這種耳聾成為一種可以預(yù)防的疾病。1555位A—G突變和1494位C一T突變會(huì)在12SrRNA的高度保守的A位形成新的1494C-G1555或1494U-A1555堿基對(duì)。這些改變使得12SrRNA在二級(jí)結(jié)構(gòu)上與細(xì)菌的16SrRNA的相應(yīng)區(qū)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)更加相似，因此，由于1494C一T和1555A—G突變?cè)?2SrRNA形成U-A和G-C配對(duì)使線(xiàn)粒體與氨基糖甙類(lèi)抗生素的結(jié)合更加容易，所以帶有這些突變的人在接觸了氨基糖甙類(lèi)抗生素時(shí)會(huì)出現(xiàn)或加重耳聾。G-CC—(3，孕ctericWa16SriRNAuc』—W9Sin扭rnalloop*a氣Al柳-"c"g.—l柳a—ulowerstemC—Gc—GAAA,AAanA"Ac--gAAACC■mitodhondrial12SrRNAi柳-ca—說(shuō)smw—c-g^-j欲i槲+y-咩—i鄉(xiāng)WiMtypeMatent線(xiàn)粒體DNA1555位A—G突變較為為常見(jiàn)，發(fā)生率約為1~3%(Mkaouar-RebaiE等，BiochemBiophysResCommun2006，340:1251-1258;OStergaardE等，ClinGenet2002，62:303-305;UsamiS等，JMedGenet2000，37:38-40)，而線(xiàn)粒體DNA1494位C—T突變?cè)谥袊?guó)耳聾人群中的發(fā)生頻率為0.45%(李琦等，中國(guó)聽(tīng)力言語(yǔ)康復(fù)科學(xué)雜志，2008),考慮到尚有很多同類(lèi)家系尚未被發(fā)現(xiàn)報(bào)道，以及1494C一T和1555A—G突變?cè)谏l(fā)性耳聾的致病機(jī)制中占有一定的比例，對(duì)這種耳聾的預(yù)防變得更為重要，其預(yù)防的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于通過(guò)篩查，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)攜帶線(xiàn)粒體1494C—T和1555A—G突變的個(gè)體，絕對(duì)禁止此類(lèi)個(gè)體接觸氨基糖甙類(lèi)抗生素，從而避免嚴(yán)重的耳毒性反應(yīng)發(fā)生。自1993年以來(lái)，對(duì)此突變的檢測(cè)除了直接測(cè)序外，最常用的篩選方法為BsmA1(Alw261)酶切法(Fischel-Ghodsi等，AmJOtolaryngol,1993,14:399-403;Fischel-Ghodsian等,AmJOtolaryngol,1997b,18:173-178;袁慧軍等，中華耳鼻咽喉科雜志，1998，33:67-70)。在國(guó)內(nèi)外，普遍應(yīng)用限制性酶BsmAI(Alw261)酶切配合序列分析鑒定有無(wú)線(xiàn)粒體DNA1555A—G突變，酶切鑒定方便快捷，cuccf^^60B6結(jié)果可靠，但不足的是BsmAI(Alw261)價(jià)格較貴，與常用的限制性酶相比，價(jià)格差異達(dá)50-100倍。專(zhuān)利號(hào)為ZL03156762.2的專(zhuān)利公開(kāi)了一種線(xiàn)粒體1555位A—G突變的檢測(cè)方法及試劑盒，此專(zhuān)利通過(guò)在線(xiàn)粒體DNA的1555位鄰近引入一個(gè)包括1555位在內(nèi)的新的限制性酶位點(diǎn)，然后用相應(yīng)的限制性酶消化，從而檢測(cè)該突變的存在。此方法簡(jiǎn)單快捷而且成本低，但不能達(dá)到快速、準(zhǔn)確、成本低并且同時(shí)檢測(cè)1494C一T和1555A—G兩個(gè)突變的要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)線(xiàn)粒體DNA的1494位C一T突變和1555A—G突變的方法所存在的缺陷，提供一種簡(jiǎn)單、快速、成本低并且同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)突變位點(diǎn)的方法。本發(fā)明要解決的另一個(gè)的技術(shù)問(wèn)題是提供一種根據(jù)上述方法的體外檢測(cè)母系遺傳耳聾縛粒體基因1494位C—T突變和1555位A—G突變的試劑盒。本發(fā)明要解決的再一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是該試劑盒在檢測(cè)所述的1494位C—T突變和1555位A—G突變中的應(yīng)用。為了解決本發(fā)明的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明設(shè)計(jì)了兩組特異性引物，各4條。利用所設(shè)計(jì)的4條引物，根據(jù)堿基配對(duì)原則，經(jīng)PCR擴(kuò)增和凝膠電泳，突變基因與正常基因擴(kuò)增出不同的基因片段，從而檢測(cè)1494C一T和1555A—G突變。其中，在第一組引物中引物1是線(xiàn)粒體的DNA核苷酸1026—1045，其序列為序列表中的SEQIDNO:l;引物2是線(xiàn)粒體的DNA核苷酸1513—1494，其序列為序列表中的SEQIDNO:2，其中1494位的G置換為A，1497位的G置換為C;引物3是線(xiàn)粒體的DNA核苷酸1536—1555，其序列為序列表中的SEQIDNO:3，其中1552位的G置換為C，1555位的A置換為G;引物4是線(xiàn)粒體的DNA核苷酸1761—1742，其序列為序列表中的SEQIDNO:4。將四條引物等比例加入同一體系對(duì)于1494位為C和1555位為A的線(xiàn)粒體DNA，引物1與引物4配對(duì)，擴(kuò)增出一條736bp片段；對(duì)于1494位為T(mén)的線(xiàn)粒體DNA，弓|物1分別與引物2和引物4配對(duì)，擴(kuò)增出三條片段488bp、736bp和一條錯(cuò)誤引發(fā)片段；對(duì)于1555位為G的線(xiàn)粒體DNA，引物4分別與引物1和引物3配對(duì)，擴(kuò)增出226bp和736bp兩條片段，示意圖見(jiàn)附圖1。從而通過(guò)擴(kuò)增出基因片段的不同檢測(cè)出1494C一T和1555A—G突變。電泳圖譜見(jiàn)附圖2。在第二組引物中弓l物1是線(xiàn)粒體的DNA核苷酸1026—1045，其序列為序列表中的SEQIDN0:1;引物2是線(xiàn)粒體的DNA核苷酸1513—1494，其中其1497位的G置換為C，其序列為序列表中的SEQIDNO:5;引物3是線(xiàn)粒體的DNA核苷酸1536—1555，其中1552位的G置換為C其序列為序列表中的SEQIDNO:6;弓l物4是線(xiàn)粒體的DNA核苷酸1761—1742，其序列為序列表中的SEQIDNO:4。將四條引物等比例加入同一體系對(duì)于1494位為C和1555位為A的線(xiàn)粒體DNA，引物1與引物2配對(duì)，引物3與引物4配對(duì)，引物1與引物4配對(duì)，擴(kuò)增出226bp、488bp和736bp三條片段；對(duì)于1494位為T(mén)的線(xiàn)粒體DNA，引物4分別與引物3和引物1配對(duì)，擴(kuò)增出226bp和736bp兩條片段；對(duì)于1555位為G的線(xiàn)粒體DNA，引物1分別與引物2和引物4配對(duì)，擴(kuò)增出488bp和736bp兩條片段。示意圖見(jiàn)附圖3。從而通過(guò)擴(kuò)增出基因片段的不同檢測(cè)出1494C一T和1555A—G突變。電泳圖譜見(jiàn)附圖4。PCR擴(kuò)增，優(yōu)選為T(mén)opch-downPCR擴(kuò)增，因?yàn)門(mén)opch-downPCR每隔一個(gè)循環(huán)降低rc的反應(yīng)退火溫度，可以避免確定最佳退火溫度的實(shí)驗(yàn)步驟，從而簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程。凝膠電泳，優(yōu)選為瓊脂糖凝膠電泳。本發(fā)明采用的Touch-downPCR的擴(kuò)增體系為10Xbuffer(含有15mMMg2+)2.Opl;IXdNTP0.5~4.0^il;引物1(lOpM)0.2~2.0|il;引物2'(10pM)0.2~2.0pl;引物3(lOpM)0.2~2.0pl;引物4(lOpM)0.2~2.(Hil;Taq酶(5U/|il)0.1~1.0pl;DNA模板20~400ng;加三蒸水至20W。本發(fā)明采用的Touch-downPCR的擴(kuò)增體系優(yōu)選為10Xbuffer(含有15mMMg2+)2.O^il;IXdNTP2.0pi;引物1(10pM)1.0引物2(lOpM)1.0jal;引物3(lOpM)1.0pi;引物4(lOpM)1.0pi;Taq酶(5，)0.5pi;DNA模板200ng;加三蒸水至20)al。本發(fā)明采用的Touch-downPCR的擴(kuò)增條件為:95。C變性4~6分鐘；94。C變性30~50秒，53。C退火3050秒，72。C延伸30~50秒，每個(gè)循環(huán)條低rC，共5個(gè)循環(huán)；接著94'C變性30~50秒，48'C退火30~50秒，72t:延伸3050秒，共25個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸6~8分鐘。本發(fā)明采用的Touch-downPCR的擴(kuò)增條件優(yōu)選為95t:變性5分鐘；94。C變性40秒，53。C退火40秒，72'C延伸40秒，每個(gè)循環(huán)降低rc'，共5個(gè)循環(huán)；接著94。C變性40秒，48。C退火40秒，72。C延伸40秒，共25個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸7分鐘。本發(fā)明還根據(jù)本發(fā)明中設(shè)計(jì)的引物序列，通過(guò)人工合成(通過(guò)給定序列由自動(dòng)化核酸合成儀合成)獲得引物，并與提取血樣DNA的試劑，包括dNTP、10XPCR緩沖液、Mg2+、三蒸水、Taq酶的PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑，兩個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照，一個(gè)陰性標(biāo)本對(duì)照，一個(gè)空白對(duì)照以及使用說(shuō)明書(shū)組合起來(lái)，提供了用于體外檢測(cè)母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494位C一T突變和1555位A—G突變的試劑盒，其主要功能在于將所有試劑集成在一個(gè)小盒內(nèi)，使得DNA提取、核酸片段擴(kuò)增可以在試劑盒提供的試劑基礎(chǔ)上順序完成。優(yōu)選的本發(fā)明的試劑盒內(nèi)還含有兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性標(biāo)本對(duì)照，兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照分別為1494C—T和1555A—G突變基因的人工合成產(chǎn)物，陰性標(biāo)本對(duì)照為正?；虻娜斯ず铣僧a(chǎn)物。其中1494C一T陽(yáng)性對(duì)照的序列為SEQIDNO:7，1555A—G陽(yáng)性對(duì)照的序列為SEQIDNO:8，陰性對(duì)照的序列為SEQIDNO:9。本發(fā)明的試劑盒適用于大規(guī)模篩查或預(yù)防性檢查線(xiàn)粒體基因1494C—T突變和1555A—G突變，禁止陽(yáng)性結(jié)果者使用氨基糖甙類(lèi)抗生素，從而避免嚴(yán)重的耳毒性反應(yīng)發(fā)生。利用本發(fā)明的方法檢測(cè)母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494C一T和1555A—G突變具有以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)1.本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)單，易于操作的特點(diǎn)。本發(fā)明通過(guò)對(duì)引物的設(shè)計(jì)，僅通過(guò)PCR擴(kuò)增和凝膠電泳兩個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟，使正常基因和突變基因經(jīng)過(guò)擴(kuò)增產(chǎn)生不同的基因片段，從而檢測(cè)突變位點(diǎn)。2.本發(fā)明可以同時(shí)檢測(cè)到1494C一T和1555A—G兩個(gè)突變位點(diǎn)，并且成本低，適用于在全國(guó)范圍內(nèi)對(duì)線(xiàn)粒體DNA的突變進(jìn)行檢測(cè)，從而避免氨基糖甙類(lèi)藥物性耳聾的發(fā)生。3.本發(fā)明的方法特異性強(qiáng)、靈敏度高。PCR過(guò)程中引物與模板DNA的結(jié)合及延伸都遵循堿基配對(duì)原則，而且我們選擇的靶基因區(qū)具有很高的特異性和保守性，因此本發(fā)明的方法具有很強(qiáng)特異性。PCR產(chǎn)物的生成量以指數(shù)方式增加的，靈敏度很高，并且不需要純度很高的標(biāo)本。4.本發(fā)明的方法具有簡(jiǎn)單快速的優(yōu)勢(shì)。Touch-downPCR可避開(kāi)確定最佳退火溫度，使實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)化，從而快速準(zhǔn)確的擴(kuò)增到目的基因。圖1:第一組引物設(shè)計(jì)示意圖圖2:第一組引物的電泳結(jié)果M為2000bpMarker，其中1、2、3、4為正常個(gè)體，其電泳條帶為一條736bp的條帶；5、6、7、8為線(xiàn)粒體DNA的1555A—G突變個(gè)體，其電泳條帶為2條226bp和736bp;9、10、11、12為線(xiàn)粒體DNA的1494C一T突變個(gè)體，其電泳條帶為三條488bp、736bp和一條錯(cuò)誤引發(fā)條帶。圖3:第二組引物的設(shè)計(jì)示意圖圖4:第二組引物的電泳結(jié)果M為2000bpMarker，其中1為空白對(duì)照，2、3、4為正常個(gè)體，其電泳條帶為226bp、488bp和736bp三條條帶；5、6、7為線(xiàn)粒體DNA的1555A~G突變個(gè)體，其電泳條帶為488bp和736bp兩條條帶；8、9、10為線(xiàn)粒體DNA的1494C—T突變個(gè)體，其電泳條帶為226bp和736bp兩條條帶。圖5:實(shí)施例1的家系1的系譜圖圖6:實(shí)施例1家系2的系譜圖具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例用來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但這并不意味著對(duì)本發(fā)明的任何限制。實(shí)施例1母系遺傳耳聾家系線(xiàn)粒體基因1494C一T突變和1555A—G突變的檢一.檢測(cè)樣本選擇以母系遺傳為傳遞特征的耳聾家系9個(gè)，總?cè)藬?shù)137人，受檢者30人。使用上海華舜生物工程有限公司生產(chǎn)的柱離心式血液基因組DNA抽提試劑盒，從被檢個(gè)體提取外周全血DNA作為檢測(cè)樣本，9個(gè)家系綜合情況見(jiàn)表1，其中家系1和家系2的系譜圖見(jiàn)圖5和圖6。其余家系的疾病傳遞方式均類(lèi)似。二.引物設(shè)計(jì)使用GenetoolLite和primerpremier5.0程序協(xié)助設(shè)計(jì)引物，根據(jù)已公開(kāi)的線(xiàn)粒體基因劍橋序列(CambridgeSequence),引物設(shè)計(jì)方案如下(1)序列SEQIDNO:2和序列SEQIDN0:3的3，端分別位于1494和1555位點(diǎn)；序列SEQIDNO:l是線(xiàn)粒體核苷酸1026—1045，序列SEQIDN0:4是線(xiàn)粒體核苷酸1761—1742;(2)序列SEQIDN0:2的1494位的G置換為A，序列SEQIDNO:3的1555位的A置換為G，目的是為了與突變的線(xiàn)粒體DNA在擴(kuò)增時(shí)形成配對(duì)堿基。另外序列SEQIDNO:2的1497位的G置換為C，序列SEQIDNO:3的1552位的G置換為C，錯(cuò)配的堿基降低PCR反應(yīng)時(shí)的退火溫度，使得線(xiàn)粒體基因檢測(cè)的目的得以實(shí)現(xiàn)。三.Touch-downPCR擴(kuò)增反應(yīng)根據(jù)上述設(shè)計(jì)的弓I物序列SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4，通過(guò)人工合成(通過(guò)給定序列由自動(dòng)化序列合成儀合成)得到四條引物序列，并以提取的被測(cè)樣本外周血DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng):10Xbuffer(含有15mMMg2+)2.0^1;1XdNTP2.0)Lll;引物IDNO:l(10nM)1,0^1;引物IDN0:2(10pM)1.0引物IDNO:3(10pM)1.0引物IDNO:4(10pM)1.0Taq酶(5U/jal)0.5DNA模板200ng;加三蒸水至20^1。反應(yīng)條件95。C變性5分鐘；94。C變性40秒，53。C退火40秒，72。C延伸40秒，每個(gè)循環(huán)降低rC，共5個(gè)循環(huán)；接著94。C變性40秒，48。C退火40秒，72'C延伸40秒，共25個(gè)循環(huán)；最后72"延伸7分鐘。四.電泳用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物1.制膠稱(chēng)取0.8g瓊脂糖粉，加入40ml1XTAE電泳緩沖液中配制成2%的瓊脂糖，振蕩混勻后，微波加熱50秒，冷卻至60。C左右加入2^il不含溴化乙錠的EB替代染料，混勻后倒入裝配好的25孔制膠床內(nèi)，室溫下30min待瓊脂糖完全凝固后小心拔出加樣梳取膠備用。2.加樣lpl6XLoadingBuffer與5plPCR產(chǎn)物混合，微量移液器吹打均勻后小心加入加樣孔中，5(alDL2000作為DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Marker)同時(shí)加樣。每次加樣均同時(shí)加入陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照標(biāo)本以判斷PCR擴(kuò)增效果。3.電泳將上好樣的凝膠小心放入DYY-6C型電泳儀中，以110V電壓、100mA電流進(jìn)行電泳，電泳時(shí)間均為25min。4.掃描電泳結(jié)束后，將凝膠置于電泳成像分析儀中進(jìn)行圖像掃描。五.檢測(cè)結(jié)果如表1所示，在總共9個(gè)家系中，6個(gè)家系14個(gè)耳聾患者的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)226bp和736bp兩條條帶，表明其存在mtDNA1555A—G突變。2個(gè)家系的14個(gè)耳聾患者的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)488bp、736bp和一條錯(cuò)誤引發(fā)條帶，表明其存在mtDNA1494A—G突變。還有1個(gè)家系的4個(gè)成員的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅出現(xiàn)一條736bp的條帶，表明其不存在mtDNA1494C"T和1555A—G突變。六.可靠性檢驗(yàn)所有被檢測(cè)個(gè)體的1494位點(diǎn)和1555位點(diǎn)均經(jīng)過(guò)直接測(cè)序檢測(cè)，結(jié)果與上述方法檢測(cè)結(jié)果完全一致，說(shuō)明使用本發(fā)明方法檢測(cè)1494C—T和1555A—G突變的可靠性和穩(wěn)定性。_表1母系遺傳家系情況及線(xiàn)粒體1494位點(diǎn)和1555位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>實(shí)施例二應(yīng)用體外檢測(cè)試劑盒檢測(cè)母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494C一T突變和1555A—G突變一.試劑盒組成1.提取血樣DNA的試劑；2.PCR試劑10mMdNTP0.5ml;IOXPCR緩沖液(含有15mMMg2+)lml;5U/|ilTaq酶2500ju四種10pM引物各1ml3.四種引物的核苷酸序列為-引物IDNO:1AAGTGGCTTTAACATATCTG引物IDNO:2TTGAAGTATACTTGAGCAGA弓I物IDNO:3ACGCATTTATATAGAGCAGG弓I物IDNO:4TCAATTTCTATCGCCTATAC4.陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本10(^1，陰性對(duì)照標(biāo)本lOOpl其中兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照分別為線(xiàn)粒體DNA的1494C一T和1555A—G突變基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，陰性標(biāo)本對(duì)照為正?；虻腜CR擴(kuò)增產(chǎn)物。5.使用說(shuō)明書(shū)二.檢測(cè)對(duì)象選擇家系1(系譜圖見(jiàn)圖5)和家系2(系譜圖見(jiàn)圖6)，本實(shí)施例各選取兩家系中四名患者為受檢對(duì)象。三.檢測(cè)方法和結(jié)果按照本試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)1.反應(yīng)體系為1Oxbuffer(含有15mMMg2+)2.Opl;lxdNTP2.0jil;引物IDNO:l(lOpM)1.0|nl;引物IDNO:2(10pM)LOjil;引物IDNO:3(lOpM)1.0pi;引物IDNO:4(10pM)1.0pi;Taq酶(5U1)0.5jil;15DNA模板200ng;加三蒸水至20y。2.TouchdownPCR反應(yīng)條件95。C變性5分鐘；94。C變性40秒，53'C退火40秒，72。C延伸40秒，每個(gè)循環(huán)降低rc，共5個(gè)循環(huán)；接著94。C變性40秒，48。C退火40秒，72。C延伸40秒，共25個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸7分鐘。按同樣的PCR反應(yīng)條件，用試劑盒內(nèi)提供的1494C一T和1555A—G陽(yáng)性模板和陰性模板同時(shí)作陽(yáng)性和陰性對(duì)照PCR反應(yīng)，并設(shè)立無(wú)模板PCR空白對(duì)照管。3.反應(yīng)結(jié)果反應(yīng)后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢査擴(kuò)增產(chǎn)物，1494C一T陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出488bp、736bp和一條錯(cuò)誤引發(fā)條帶，1555A—G陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出226bp和736bp條帶，陰性對(duì)照擴(kuò)增出736bp條帶，空白對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增條帶，受檢標(biāo)本結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致。應(yīng)用體外檢測(cè)試劑盒檢測(cè)母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494C一T突變和1555A—G突變一.試劑盒組成1.提取血樣DNA的試劑；2.PCR試劑10mMdNTP0.5ml;10XPCR緩沖液(含有15mMMg2+)lml;5U/plTaq酶2500ju四種10|LiM引物各lml6.四種引物的核苷酸序列為引物IDNO:1AAGTGGCTTTAACATATCTG引物IDNO:5TTGAAGTATACTTGAGCAGG引物IDNO:6ACGCATTTATATAGAGCAGA引物IDNO:4TCAATTTCTATCGCCTATAC7.陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本100W，陰性對(duì)照標(biāo)本100H1其中兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照分別為線(xiàn)粒體DNA的1494C—T和1555A—G突變基因的人工合成產(chǎn)物，陰性標(biāo)本對(duì)照為正?；虻娜斯ず铣僧a(chǎn)物。8.使用說(shuō)明書(shū)二.檢測(cè)對(duì)象選擇家系1(系譜圖見(jiàn)圖5)和家系2(系譜圖見(jiàn)圖6)，本實(shí)施例各選取兩家系中三名患者為受檢對(duì)象。三.檢測(cè)方法和結(jié)果按照本試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)3.反應(yīng)體系為10Xbuffer(含有15mMMg2+)2.0pl;IXdNTP2.0pi;引物IDN0:1(lOpM)l.Opl;引物IDNO:5(lOpM)l.Ojul;引物IDNO:6(10|iM)1,0jil;引物IDNO:4(lOpiM)1.0pi;Taq酶(5U/V1)0.5DNA模板200ng;加三蒸水至20pl。4.TouchdownPCR反應(yīng)條件95。C變性5分鐘；94。C變性40秒，53。C退火40秒，72。C延伸40秒，每個(gè)循環(huán)降低rc，共5個(gè)循環(huán)；接著94。C變性40秒，48t:退火40秒，72。C延伸40秒，共25個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸7分鐘。按同樣的PCR反應(yīng)條件，用試劑盒內(nèi)提供的1494C一T和1555A—G陽(yáng)性模板和陰性模板同時(shí)作陽(yáng)性和陰性對(duì)照PCR反應(yīng)，并設(shè)立無(wú)模板PCR空白對(duì)照管。3.反應(yīng)結(jié)果反應(yīng)后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增產(chǎn)物，1494C一T陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出226bp和736bp條帶，1555A—G陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出488bp和736bp條帶，陰性對(duì)照擴(kuò)增出226bp、488bp和736bp條帶，空白對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增條帶，受檢標(biāo)本結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致。<no>董大光<120>母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494位C一T和1555位A—G突變的檢測(cè)方法及其試劑盒<160>:力<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1AAGTGGCTTTAACATATCTG<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2TTGAAGTATACTTGAGCAGA<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3ACGCATTTATATAGAGCAGG<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4TCAATTTCTATCGCCTATAC<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5TTGAAGTATACTTGAGCAGG<210>6<21]>20<212>DNA<213>人工序列<400>6ACGCATTTATATAGAGCAGA<210>7<211>736<212>DNA<213>人工序列<400>7aagtggctttaacatatctgaacacacaatagctaagacccaaactggga50ttagataccccactatgcttagccctaaacctcaacagttaaatcaacaa100aactgctcgccagaacactacgagccacagcttaaaactcaaaggacctg150gcggtgcttcatatccctctagaggagcctgttctgtaatcgataaaccc200cgatcaacctcaccacctcttgctcagcctatataccgccatcttcagca250aaccctgatgaaggctacaaagtaagcgcaagtacccacgtaaagacgtt300aggtcaaggtgtagcccatgaggtggcaagaaatgggctacattttctac350cccagaaaactacgatagcccttatgaaacttaagggtcgaaggtggatt400tagcagtaaactaagagtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgc450gtacacaccgcccgtcactctcctcaagtatacttcaaaggacatttaac500taaaacccctacgcatttatatagaggagacaagtcgtaacatggtaagt550gtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacacaaagca600cccaacttacacttaggagatttcaacttaacttgaccgctctgagctaa650acctagccccaaacccactccaccttactaccagacaaccttagccaaac700catttacccaaataaagtataggcgatagaaattga736<210>8<211>736<212>DNA<213>人工序列<400>8aagtggctttaacatatctgaacacacaatagctaagacccaaactggga50ttagataccccactatgcttagccctaaacctcaacagttaaatcaacaa訓(xùn)aactgctcgccagaacactacgagccacagcttaaaactcaaaggacctg150gcggtgcttcatatccctctagaggagcctgttctgtaatcgataaaccc200cgatcaacctcaccacctcttgctcagcctatataccgccatcttcagca250aaccctgatgaaggctacaaagtaagcgcaagtacccacgtaaagacgtt300aggtcaaggtgtagcccatgaggtggcaagaaatgggctacattttctac350cccagaaaactacgatagcccttatgaaacttaagggtcgaaggtggatt400tagcagtaaactaagagtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgc450gtacacaccgcccgtcaccctcctcaagtatacttcaaaggacatttaac500taaaacccctacgcatttatatagaggaggcaagtcgtaacatggtaagt550gtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacacaaagca600cccaacttacacttaggagatttcaacttaacttgaccgctctgagctaa650acctagccccaaacccactcC3ccttoctaccagacaaccttagccaaac了OOcatttacccaaataaagtataggcgatagaaattga736<210>9<211>736<212>DNA<213>人工序列<400〉9aagtggctttaacatatctgaacacacaatagctaagacccaaactggga50ttagataccccactatgcttagccctaaacctcaacagttaaatcaacaa100aactgctcgccagaacactacgagccacagcttaaaactcaaaggacctg150gcggtgcttcatatccctctagaggagcctgttctgtaatcgataaaccc200cgatcaacctcaccacctcttgctcagcctatataccgccatcttcagca250aaccctgatgaaggctacaaagtaagcgcaagtacccacgtaaagacgtt300aggtcaaggtgtagcccatgaggtggcaagaaatgggctacattttctac350cccagaaaactacgatagcccttatgaaacttaagggtcgaaggtggatt400tagcagtaaactaagagtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgc450gtacacaccgcccgtcaccctcctcaagtatacttcaaaggacatttaac500taaaacccctacgcatttatatagaggagacaagtcgtaacatggtaagt550gtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacacaaagca600cccaacttacacttaggagatttcaacttaacttgaccgctctgagctaa650acctagccccaaacccactccaccttactaccagacaaccttagccaaac700catttacccaaataaagtataggcgatagaaattga73權(quán)利要求1.一種母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494C-T和1555A-G突變的檢測(cè)方法，其特征在于所述方法設(shè)計(jì)了四條特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增和凝膠電泳，突變基因與正?；驍U(kuò)增出不同的基因片段，從而檢測(cè)1494C-T和1555A-G突變。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494C~T和1555A—G突變的檢測(cè)方法，其特征在于所述的四條引物的核苷酸序列如下引物1的核苷酸序列為序列表中的SEQIDNO:l;引物2的核苷酸序列為序列表中的SEQIDNO:2;引物3的核苷酸序列為序列表中的SEQIDNOJ;引物4的核苷酸序列為序列表中的SEQIDN0:4。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494C一T和1555A—G突變的檢測(cè)方法，其特征在于以正常線(xiàn)粒體DNA為模板擴(kuò)增出一條736bp片段；以1494位為T(mén)的線(xiàn)粒體DNA為模板擴(kuò)增出三條片段488bp、736bp和一條錯(cuò)誤引發(fā)片段；以1555位為G的線(xiàn)粒體DNA為模板擴(kuò)增出226bp和736bp兩條片段，從而檢測(cè)出1494C一T和1555A—G突變。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494C—T和1555A—G突變的檢測(cè)方法，其特征在于所述的四條引物的核苷酸序列如下弓l物1的核苷酸序列為序列表中的SEQIDNO:l;引物2的核苷酸序列為序列表中的SEQIDN0:5;引物3的核苷酸序列為序列表中的SEQIDN0:6;引物4的核苷酸序列為序列表中的SEQIDN0:4。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494C一T和1555A—G突變的檢測(cè)方法，其特征在于以正常線(xiàn)粒體DNA為模板擴(kuò)增出226bp、488bp和736bp三條片段；對(duì)于1494位為T(mén)的線(xiàn)粒體DNA為模板擴(kuò)增出226bp和736bp兩條片段；對(duì)于1555位為G的線(xiàn)粒體DNA為模板擴(kuò)增出488bp和736bp兩條片段。6.根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494C一T和1555A~G突變的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的PCR擴(kuò)增為T(mén)ouch-downPCR擴(kuò)增，所述的凝膠電泳為瓊脂糖凝膠電泳。7.根據(jù)權(quán)利宴求6所述的母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494C—T和1555A—G突變的檢測(cè)方法，其特征在于Touch-downPCR的擴(kuò)增體系為10Xbuffer(含有15mMMg2+)2.0^1;IXdNTP0.54.0jli1;引物1(10pM)0.2~2.0|il;引物2(10pM)0.22.0|ul;引物3(lOjiM)0.2~2.(V1;引物4(10pM)0.2~2.(Hil;Taq酶(5U/|il)0.1~1.0|il;DNA模板20~400ng;加三蒸水至20nl。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494C一T和1555A—G突變的檢測(cè)方法，其特征在于Touch-downPCR的擴(kuò)增條件為95。C變性46分鐘；94。C變性30~50秒，53""C退火3050秒，72"C延伸3050秒，每個(gè)循環(huán)降低1°C，共5個(gè)循環(huán)；接著9fC變性30-50秒，48。C退火30~50秒，72。C延伸30~50秒，共25個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸68分鐘。9.一種用于體外檢測(cè)權(quán)利要求1所述的母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494C~~T和1555A—G突變的試劑盒，其特征在于該試劑盒中含有(1)提取血樣DNA的試劑；(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑，包括dNTP、IOXPCR緩沖液、Mg2+、三蒸水、Taq酶；(3傳比例混合的一組引物；(4)陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照；(5)陰性標(biāo)本對(duì)照；(6)空白對(duì)照；(7)使用說(shuō)明書(shū)。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的體外檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的四條引物的核苷酸序列如下弓l物1的核苷酸序列為序列表中的SEQIDNO:l;引物2的核苷酸序列為序列表中的SEQIDNO:2;弓l物3的核苷酸序列為序列表中的SEQIDNO:3;引物4的核苷酸序列為序列表中的SEQIDNO:4。11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的體外檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的四條引物的核苷酸序列如下引物1的核苷酸序列為序列表中的SEQIDNO:l;引物2的核苷酸序列為序列表中的SEQIDNO:5;引物3的核苷酸序列為序列表中的SEQIDNO:6;引物4的核苷酸序列為序列表中的SEQIDNO:4。12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的體外檢測(cè)試劑盒，其特征在于有兩個(gè)陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照，分別為1494C一T和1555A—G突變基因的人工合成序列，陰性標(biāo)本對(duì)照為正?；虻娜斯ず铣尚蛄?。13.根據(jù)權(quán)利要求812之任一項(xiàng)所述的體外檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)線(xiàn)粒體基因1494C一T和1555A—G突變的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494C-T和1555A-G突變的檢測(cè)方法。該方法設(shè)計(jì)改良引物，通過(guò)Touch-downPCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)1494C-T和1555A-G突變。該方法簡(jiǎn)單，成本低，檢測(cè)結(jié)果直接、可靠，適用于對(duì)母系遺傳耳聾線(xiàn)粒體基因1494C-T和1555A-G突變的大規(guī)模篩查或預(yù)防性檢查。文檔編號(hào)C12N15/11GK101684498SQ20081022341公開(kāi)日2010年3月31日申請(qǐng)日期2008年9月27日優(yōu)先權(quán)日2008年9月27日發(fā)明者董大光申請(qǐng)人:董大光