一種表達透明質酸酶的重組枯草芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達透明質酸酶的重組枯草芽孢桿菌，屬于生物工程【技術領域】。本發(fā)明通過選取不同的枯草芽孢桿菌分泌信號肽，融合在透明質酸酶N端，同時在信號肽與透明質酸酶之間融合6個組氨酸序列，在組成型強啟動子控制下，以無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)酵，在30℃培養(yǎng)60h的最高酶活可達到17164U/ml。本發(fā)明通過采用食品級枯草芽孢桿菌表達系統(tǒng)成功實現了對水蛭透明質酸酶的分泌表達，為實現水蛭來源的透明質酸酶的工業(yè)化制備生產奠定了基礎。
【專利說明】一種表達透明質酸酶的重組枯草芽孢桿菌

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種表達透明質酸酶的重組枯草芽孢桿菌，屬于生物工程【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 透明質酸酶是一類特異性水解透明質酸的水解酶，廣泛存在于真核生物和原核生 物中，主要水解透明質酸，是一種重要的生理活性物質。在動物機體內參與許多重要的生物 學過程，例如細胞分裂、細胞間的連接、生殖細胞的活動、DNA的轉染、胚胎發(fā)育、受傷組織的 修復，以及正常細胞和腫瘤細胞增生。許多病理變化過程往往伴隨著透明質酸酶和透明質 酸的變化，暗示它們可能起著重要的作用。同時透明質酸酶也可以改變機體內一些藥物和 生理活性物質的分布狀況。
[0003] 透明質酸酶于1928年被Duran Reynals發(fā)現并稱為擴散因子，1940年被Chain 和Duthie正式命名為透明質酸酶（hyaluronidase, HAase)。根據透明質酸酶作用的底物 特異性和催化機制，將其分為三類。第一類是來源于哺乳動物的透明質酸4-糖基水解酶 家族，這類透明質酸酶（EC3. 2. 1. 35)是具有水解和轉糖苷活性的糖苷酶，通過水解透明質 酸（HA)的β-1、4-糖苷鍵，產物以四糖透明質酸分子為主。也可作用于硫酸軟骨素、4-硫 酸軟骨素和6-硫酸軟骨素產生硫酸皮膚素產物。第一類中比較常見的有來自于哺乳動物 的睪丸、蛇毒、蜂毒以及溶菌體的透明質酸酶。第二類為微生物透明質酸酶，這類透明質酸 酶（EC4. 2.2. 1)通過β-消除反應裂解HA的β-糖苷鍵，產生以不飽和的雙糖分子為主 要產物。這類透明質酸裂解酶來源于包括Clostridium, Micrococcus, Streptococcus, and Streptomyces等微生物,并且它們的底物特異性也不同。第三類代表性的透明質酸酶主要 來源于水蛭，這類水蛭來源的透明質酸酶（EC3. 2. 1. 36)屬于透明質酸3-糖基水解酶家族， 通過水解HA的β-1、3-糖苷鍵，生產以四糖分子HA且還原端帶有葡萄糖醛酸為主的產物。 水蛭來源的透明質酸酶對底物的專一性強，對硫酸軟骨素、4-硫酸軟骨素和6-硫酸軟骨素 不具有活性，并且不具有轉糖苷活性。
[0004] 透明質酸水解酶作為一種藥理活性物質在臨床上具有比較廣泛的用途。1941年 Hirst首次證實水蛭透明質酸酶強有力的抗菌性。水蛭透明質酸酶能溶解體內和體外細菌 被膜并形成抗體，從而使宿主獲得很好的藥物治療效果。透明質酸酶能夠降解心肌透明質 酸，顯著減少間隙體積，阻止由缺血引起的動脈阻力增大，增加血流量。相關研究實驗也證 實透明質酸酶對治療心肌梗塞效果顯著。另外，透明質酸酶在抗腫瘤方面也具有重要的作 用，惡性組織經透明質酸酶處理后粘多糖含量增加，有利于腫瘤細胞結合更多的抗癌藥物。 如它可以加強阿霉素對乳腺癌的抗癌能力，降低膀胱癌的復發(fā)率等。此外，透明質酸酶在臨 床上也作為藥物擴散助劑，眼科手術后用于降低眼內壓，與麻醉劑利多卡因鹽酸鹽配合使 用，可加快進入麻醉狀態(tài)和延長麻醉時間。雖然哺乳動物透明質酸酶作為"擴散因子"被廣 泛應用于藥物擴散助劑，然而這類透明質酸酶活性易受肝素抑制。相比水蛭透明質酸酶活 性不受肝素影響，在臨床上作為"藥物擴散因子"、治療血栓、青光眼和其它藥用方面具有更 大的應用價值。水蛭來源的透明質酸酶由于其底物專一性強，與其它來源的透明質酸酶相 t匕，它不能降解軟骨素或硫酸軟骨素，活性不受肝素影響。因此，理論上來講，水蛭透明質酸 酶用于臨床藥用更具醫(yī)療價值意義。
[0005] 目前市場供應的透明質酸酶來源于動物組織提取，成本較高，酶活單位低 (IO2-IO3UAig)，而且具有動物病毒交叉感染的風險。然而，尚無水蛭來源的透明質酸酶基因 的相關報道。水蛭來源的透明質酸酶是以活體水蛭組織進行提取為主獲得，且每個水蛭提 取所獲得透明質酸酶僅約為230U。水蛭原料的來源和提取分離步驟的繁瑣等因素都極大的 限制了水蛭透明質酸酶在醫(yī)療和科研上的廣泛應用?；卺t(yī)療衛(wèi)生安全考慮，本發(fā)明以食 品級工程菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtiIis)重組發(fā)酵生產水蛭透明質酸酶?？莶菅挎?桿菌由于具有諸多優(yōu)勢，例如安全、好氧生長、營養(yǎng)條件低、遺傳操作工具完善等。本發(fā)明提 供的重組微生物工程菌株高效生產制備水蛭透明質酸酶的方法，打破了水蛭透明質酸酶的 活體水蛭提取純化的瓶頸。對實現工業(yè)化生產和醫(yī)療科研應用水蛭透明質酸酶奠定了堅實 的基礎。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種高效分泌表達活性水蛭透明質酸酶的重組枯草芽孢桿菌。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述透明質酸酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，進一步融合編碼6個組氨酸的核苷酸序列，使編碼的透明質酸酶的N端融合6個 組氨酸。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，以載體pMA5為出發(fā)載體，以來源于枯草芽孢桿菌的 wapA-SP、yvgO-SP、yweA-SP信號肽，構建重組表達載體，轉化枯草芽孢桿菌。所述信號肽是 wapA-SP、yvg〇-SP或yweA-SP，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO. 3-5所示。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌為Bacillus subtilis 168。
[0010] 本發(fā)明提供了一種應用所述重組枯草芽孢桿菌表達透明質酸酶的方法，使用以蔗 糖為碳源的無機鹽培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵生產透明質酸酶。將發(fā)酵上清液采用葡聚 糖-鎳柱進行特異性純化，可獲得純化的透明質酸酶。
[0011] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有0.5-2 %酵母粉，1-5 %蔗糖，磷酸二氫鈉15. 6g/L，硫酸鉀 3. 9g/L〇
[0012] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，所述無機鹽培養(yǎng)基：酵母粉20g/L，蔗糖20g/L，磷 酸二氫鈉15. 6g/L，硫酸鉀3. 9g/L。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，將種子培養(yǎng)液按10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基 中，溫度為 25-37°C、pH 為 6. 0-7. 0 培養(yǎng) 24-60h。
[0014] 所述重組枯草芽孢桿菌，以枯草芽孢桿菌為Bacillus subtilis 168為宿主，以 枯草芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭表達載體pMA5載體重組表達已融合編碼信號肽wapA-SP、 yvg〇-SP或yweA-SP和6個組氨酸的水蛭透明質酸酶基因。
[0015] 本發(fā)明采用原核表達系統(tǒng)成功實現真核動物來源的透明質酸酶異源高效活性表 達，表達透明質酸酶操作及其純化制備方法簡單。在未對水蛭透明質酸酶基因做任何修飾 的情況下，直接重組表達或采用IipA信號肽表達，均未能獲得透明質酸酶的活性表達。而 本發(fā)明通過在透明質酸酶序列的前段添加一段序列，結合不同信號肽，最終獲得了三株重 組分泌表達活性高的透明質酸酶生產菌株。與真核系統(tǒng)畢赤酵母表達相比，枯草芽孢桿菌 為"食品級"工業(yè)菌株，培養(yǎng)條件簡單，發(fā)酵時間短，生產強度大。本發(fā)明為實現水蛭來源的 透明質酸酶的工業(yè)化制備生產奠定了基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1為含有pMA5-LHyal和pMA5-lipA-sp-LHyal重組酶的菌株發(fā)酵液上清進行平 板法透明質酸酶的活性的檢測分析。
[0017] 圖 2 為 SDS-PAGE 蛋白電泳分析重組菌株 pMA5-LHyal 和 pMA5-lipA-sp-LHyal 的 透明質酸酶蛋白表達：兩株重組菌株都顯示，目標蛋白（箭頭所示）都以包涵體的無活性形 式表達。
[0018] 圖3為SDS-PAGE蛋白電泳分析重組菌株發(fā)酵液上清中透明質酸酶 的分泌表達：pMA5-wapA-SP_H6LHyal (wapA)、pMA5-yvg〇-SP_H6LHyal (yvgO)、 pMA5-yweA-SP_H6LHyal (yweA)，黑色箭頭標示處為目標條帶。
[0019] 圖4為平板法鑒定發(fā)酵液產透明質酸酶的活性：pMA5-wapA-SP-H6LHyal (wapA)、 pMA5-yvg〇-SP_H6LHyal (yvgO)、pMA5-yweA-SP_H6LHyal (yweA)分別有兩株菌透明質酸酶發(fā) 酵液，對照為不含重組基因的枯草芽孢桿菌對照發(fā)酵液。
[0020] 圖 5 為重組 pMA5-wapA-SP_H6LHyal (wapA)、pMA5-yvg〇-SP_H6LHyal (yvgO)、 pMA5-yweA-SP_H6LHyal (yweA)搖瓶發(fā)酵產透明質酸酶的粗酶液比活。

【具體實施方式】
[0021] 表1信號肽序列
[0022]

【權利要求】
1. 一種分泌表達活性透明質酸酶的重組枯草芽孢桿菌，是在編碼透明質酸酶的基因中 融合編碼6個組氨酸的核苷酸序列，使編碼的透明質酸酶的N端融合6個組氨酸；然后以 PMA5為出發(fā)載體，結合信號肽WapA、YvgO或YweA，構建重組表達載體，轉化枯草芽孢桿菌。
2. 根據權利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述信號肽WapA、YvgO或 YweA的氨基酸序列分別如SEQIDN0. 3-5所示。
3. 根據權利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述枯草芽孢桿菌為 Bacillus subtilisl68〇
4. 一種應用權利要求1所述重組枯草芽孢桿菌表達透明質酸酶的方法，其特征在于， 使用以蔗糖為碳源的無機鹽培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵生產透明質酸酶。
5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，將發(fā)酵上清液采用葡聚糖-鎳柱進行特異 性純化，獲得純化的透明質酸酶。
6. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有酵母粉5-20g/L，蔗 糖 10-50g/L，磷酸二氫鈉 15. 6g/L，硫酸鉀 3. 9g/L。
7. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，將種子培養(yǎng)液按10 %的接種量接種到發(fā) 酵培養(yǎng)基中，溫度為25-37°C、pH為6. 0-7. 0培養(yǎng)24-60h。
8. 權利要求1所述重組枯草芽孢桿菌在透明質酸酶的生產中的應用。
9. 權利要求1所述重組枯草芽孢桿菌在透明質酸的生產中的應用。
【文檔編號】C12P19/26GK104278005SQ201410555212
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月17日 優(yōu)先權日:2014年10月17日
【發(fā)明者】康振, 陳堅, 堵國成, 金鵬 申請人:江南大學