建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，選取健康無(wú)傷的建鯉，從建鯉尾靜脈處采血，完畢后對(duì)魚體表面消毒，放入超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌采集建鯉肝臟；用含雙抗的PBS溶液漂洗，加入胰酶消化液，消化處理溫度為26~28℃，時(shí)間為15-20min；消化結(jié)束后加入培養(yǎng)基A終止消化，消化液經(jīng)過(guò)200目過(guò)濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液；分別用50g和30g各離心5min，然后用培養(yǎng)基B進(jìn)行洗滌2次，去除上清液，得到沉淀即為提取的肝細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，鋪板培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單快捷，能很大程度上節(jié)約分離時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)所用分離時(shí)間大約為40min，且獲得的肝細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，紅細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞存活率在95%左右。
【專利說(shuō)明】建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，屬于細(xì)胞生物學(xué)及生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]原代肝細(xì)胞的培養(yǎng)起源于上世紀(jì)40年代，肝細(xì)胞的成功培養(yǎng)被應(yīng)用于許多領(lǐng)域，如肝細(xì)胞移植、生物人工肝等方面，關(guān)于肝細(xì)胞的分離方法，哺乳動(dòng)物方面進(jìn)展較快，有二步膠原酶灌流法、組織塊培養(yǎng)法、酶消化法等；而魚類肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)起步較晚，進(jìn)展緩慢，主要采用二步灌流法和酶消化法。由于肝細(xì)胞具有完整的藥物代謝酶體系，是藥物生物轉(zhuǎn)化的主要場(chǎng)所，因此肝細(xì)胞的體外培養(yǎng)在肝病研究中發(fā)揮著日益重要的作用，體外培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞具有許多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)獲得大量性狀較均一的樣本，且培養(yǎng)體系中僅含實(shí)質(zhì)細(xì)胞，便于人為控制培養(yǎng)條件，排除了許多復(fù)雜因素的干擾，基本保留了肝臟原有的代謝功能和細(xì)胞分化狀態(tài)，存活時(shí)間長(zhǎng)。因此肝細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于藥物的藥理、毒理學(xué)的研究中。
[0003]目前，關(guān)于魚類肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，獲得肝細(xì)胞數(shù)量少、分離時(shí)間長(zhǎng)、紅細(xì)胞偏多、活性差，不能夠很好應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究中。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，本方法對(duì)現(xiàn)有肝細(xì)胞分離方法進(jìn)行了改良，方法簡(jiǎn)單快捷，能很大程度上節(jié)約分離時(shí)間，且獲得的肝細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，紅細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞存活率在95%左右。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
1)選取健康無(wú)傷的建鯉，從建鯉尾靜脈處采集血液，采血完畢后對(duì)魚體表面消毒，放入超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌采集建鯉肝臟；
2)將步驟I)采集的建鯉肝臟用含雙抗的PBS溶液漂洗，去除血塊，修剪成小塊，加入胰酶消化液，然后轉(zhuǎn)移到裝有玻璃珠的錐形瓶?jī)?nèi)，將錐形瓶置于水浴鍋中進(jìn)行消化，消化處理溫度為26?28°C，時(shí)間為15-20min ；
3)消化結(jié)束后加入含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基終止消化，消化液經(jīng)過(guò)200目過(guò)濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液；
4)將步驟3)的濾液采用梯度離心,分別用50g和30g各離心5min，然后用不含血清的L-15培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌2次，去除上清液，得到沉淀即為提取的肝細(xì)胞；
5)細(xì)胞培養(yǎng)板預(yù)處理，在細(xì)胞培養(yǎng)板每孔內(nèi)滴入大鼠尾膠原溶液，使其均勻鋪滿孔底，然后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12?24 h，取出培養(yǎng)板，吸棄每孔內(nèi)的大鼠尾膠原溶液，以L-15培養(yǎng)基沖洗，吸凈培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱中備用；
6)將步驟4)提取的肝細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中，制成細(xì)胞懸液，在步驟5)預(yù)處理好的細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行鋪板操作，然后將鋪好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0006]步驟I)中選取的野生建鯉的質(zhì)量為80-100g。發(fā)明人通過(guò)多次摸索，總結(jié)出SO-1OOg左右的幼魚的肝臟分離后肝細(xì)胞活力較好，質(zhì)量較高；可能是隨著個(gè)體生長(zhǎng)，其肝臟活性可能會(huì)下降，進(jìn)而影響分離后肝細(xì)胞的活力強(qiáng)弱。
[0007]步驟2)中加入的胰酶消化液的體積為肝組織塊體積的5倍。
[0008]步驟2)中修剪成小塊的體積為I?3mm3。
[0009]步驟2)中所述玻璃珠的直徑為2_4mm。加入玻璃珠可以促進(jìn)組織與消化液的充分接觸，消化時(shí)間較短，能夠很好地保持細(xì)胞活力，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索發(fā)現(xiàn)，消化時(shí)間和消化液濃度過(guò)高，會(huì)嚴(yán)重影響肝細(xì)胞活力。
[0010]步驟2)中消化處理溫度為27°C，時(shí)間為15min ；
步驟5)和步驟6)中的CO2培養(yǎng)箱中溫度為27°C，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%。
[0011]步驟3)的濾液中主要是肝細(xì)胞，還有少量雜細(xì)胞，步驟4)中采用梯度離心可以起到純化肝細(xì)胞的目的，洗滌的目的是盡可能多去除雜細(xì)胞。
[0012]步驟5)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)板預(yù)處理的目的是促進(jìn)肝細(xì)胞的貼壁。
[0013]本發(fā)明中培養(yǎng)基選擇穩(wěn)定性較好的L-15培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),可以避免培養(yǎng)基pH值變化過(guò)快給肝細(xì)胞的培養(yǎng)造成影響。
[0014]有益效果:
本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)現(xiàn)有肝細(xì)胞分離方法進(jìn)行了改良，方法簡(jiǎn)單快捷，能很大程度上節(jié)約分離時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)所用分離時(shí)間大約為40min，且獲得的肝細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，紅細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞存活率在95%左右。且不用紅細(xì)胞裂解液能夠很好的去除大部分紅細(xì)胞(使用紅細(xì)胞裂解液雖然可以很好的去除紅細(xì)胞，但是同時(shí)也會(huì)對(duì)肝細(xì)胞造成一定損傷，影響肝細(xì)胞活力，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞活性較差，影響后續(xù)試驗(yàn))，生長(zhǎng)狀況良好，能夠很好地滿足實(shí)驗(yàn)需求，為后續(xù)試驗(yàn)的順利開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1:剛分離出來(lái)的肝細(xì)胞12h在顯微鏡下觀察呈現(xiàn)小亮點(diǎn)狀態(tài)，肝細(xì)胞圖片X 100倍；
圖2:肝細(xì)胞在24h，出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，肝細(xì)胞圖片X 100倍；
圖3:肝細(xì)胞在72h，出現(xiàn)伸展變形現(xiàn)象，呈島嶼狀生長(zhǎng)，肝細(xì)胞圖片X 200倍。

【具體實(shí)施方式】
[0016]L-15培養(yǎng)基:購(gòu)自于美國(guó)sigma公司；
培養(yǎng)基A:含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基，配方為:L-15培養(yǎng)基1000ml、10ml新生胎牛血清FBSUOml雙抗、胰島素10mg。
[0017]培養(yǎng)基B:不含血清L-15培養(yǎng)基，配方為:L-15培養(yǎng)基1000ml、10ml雙抗。
[0018]雙抗(青霉素及鏈霉素溶液)，含有青霉素(10，000 IU/mL)和鏈霉素(10，000μδ/mL)在100倍的工作濃度的混合液。
[0019]實(shí)施例1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器消毒處理:
將實(shí)驗(yàn)所需的L-15培養(yǎng)基、大鼠尾膠原、胎牛血清、雙抗、0.25%胰酶消化液、75%酒精、
0.4%臺(tái)盼藍(lán)等試劑藥品，剪刀、鑷子、槍頭、移液管、錐形瓶、玻璃珠、過(guò)濾器、計(jì)數(shù)板等進(jìn)行滅菌消毒處理。(其中百分比均為體積百分比)
細(xì)胞培養(yǎng)板預(yù)處理:
細(xì)胞培養(yǎng)板預(yù)處理的目的是為了促進(jìn)細(xì)胞的貼壁，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，無(wú)菌條件下，在每孔內(nèi)滴入200 μ L大鼠尾膠原溶液，輕晃使其均勻鋪滿孔底。把涂有膠原溶液的培養(yǎng)板放入0}2培養(yǎng)箱(27°〇、5%0)2)中過(guò)夜。次日取出培養(yǎng)板至超凈工作臺(tái)中，吸棄每孔內(nèi)的膠原溶液，再加入500 μ L L-15培養(yǎng)基沖洗，以消除醋酸對(duì)建鯉肝細(xì)胞的影響，最后吸凈培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱中備用。
[0020]建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng):
選取健康無(wú)傷質(zhì)量為SO-1OOg左右的野生建鯉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)證明，質(zhì)量較小的魚類獲得的肝細(xì)胞活力較好)，于建鯉尾靜脈處采集血液，尾靜脈采血完畢后，在建鯉鰓脈弓處剪開(kāi)放血,此處放血相當(dāng)于動(dòng)物上面的動(dòng)脈血管,可以將魚體內(nèi)血液去除干凈，這樣培養(yǎng)出來(lái)的肝細(xì)胞會(huì)去除絕大部分紅細(xì)胞，將血液去除干凈可明顯降低分離后肝細(xì)胞中紅細(xì)胞數(shù)量，采血完畢后對(duì)魚體表面用75%酒精進(jìn)行消毒，放入超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌采取建鯉肝臟。
[0021]將肝臟放置于事先準(zhǔn)備好的含雙抗的PBS溶液(NaCl 8.0g, KCl 0.2g、Na2HPO3.12H20 3.63g、KH2PO4 0.24g、1mL 雙抗，加蒸餾水 600mL 溶解，調(diào) pH 至 7.2，再加蒸餾水定容到1L，高壓滅菌待用。)中進(jìn)行漂洗，修剪，去除血塊，然后將肝組織修剪成Imm3小塊，加入5倍肝組織塊體積的胰酶消化液，另外準(zhǔn)備一只50mL錐形瓶，里面放入10顆直徑2-4mm的玻璃珠，加入玻璃珠可以促進(jìn)肝組織與酶消化液的充分接觸(錐形瓶和玻璃珠均已進(jìn)行洗滌滅菌處理)，然后將肝組織轉(zhuǎn)移至錐形瓶?jī)?nèi)，于27度水浴鍋中進(jìn)行消化，瓶口用滅菌消毒過(guò)的錫箔紙進(jìn)行遮蓋處理，防止外界污染物進(jìn)入瓶?jī)?nèi)造成細(xì)胞污染，消化處理時(shí)間為15min，期間每隔2min進(jìn)行搖晃一次，促進(jìn)胰酶消化液與肝組織充分接觸。
[0022]所用胰酶消化液濃度為0.125%，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)摸索如果濃度過(guò)大，會(huì)嚴(yán)重影響肝細(xì)胞活力，因此將0.25%的胰酶消化液與L-15培養(yǎng)基按1:1比例進(jìn)行了稀釋。(百分比是體積百分比)
消化結(jié)束后加入培養(yǎng)基A (含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基)lmL終止消化，以200目過(guò)濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾,采用梯度離心法分別用50g和30g離心5min,用培養(yǎng)基B(不含血清L-15培養(yǎng)基)進(jìn)行洗滌2次，將上清液去掉，將沉淀中加入5mL培養(yǎng)基A制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞存活率是采用細(xì)胞板計(jì)數(shù)得來(lái)的臺(tái)盼藍(lán)染色法(細(xì)胞懸液與0.5%臺(tái)盼藍(lán)染液按I: I體積比混合，I min后于血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，活細(xì)胞圓形透明，死細(xì)胞染成藍(lán)色，用活細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞中的百分比表示細(xì)胞存活率)。計(jì)數(shù)結(jié)束后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行鋪板操作，鋪好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，27°C、5%體積分?jǐn)?shù)CO2條件下培養(yǎng)。剛分離出來(lái)的肝細(xì)胞，還沒(méi)有貼壁，在顯微鏡下觀察只是一個(gè)個(gè)“亮圈”，見(jiàn)圖1 ;隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，肝細(xì)胞開(kāi)始貼壁、變形，出現(xiàn)伸展現(xiàn)象，見(jiàn)圖2 ;72h后肝細(xì)胞連接緊密，出現(xiàn)島嶼狀生長(zhǎng)，見(jiàn)圖3。本方法簡(jiǎn)單快捷，所用分離時(shí)間大約為40min，且獲得的肝細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好，紅細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞存活率在95%左右。且不用紅細(xì)胞裂解液能夠很好的去除大部分紅細(xì)胞(使用紅細(xì)胞裂解液雖然可以很好的去除紅細(xì)胞，但是同時(shí)也會(huì)對(duì)肝細(xì)胞造成一定損傷，影響肝細(xì)胞活力，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞活性較差，影響后續(xù)試驗(yàn))。
【權(quán)利要求】
1.建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟: 1)選取健康無(wú)傷的建鯉，從建鯉尾靜脈處采集血液，并在建鯉鰓脈弓處剪開(kāi)放血，完畢后對(duì)魚體表面消毒，放入超凈臺(tái)內(nèi)無(wú)菌采集建鯉肝臟； 2)將步驟1)采集的建鯉肝臟用含雙抗的PBS溶液漂洗，去除血塊，修剪成小塊，加入胰酶消化液，然后轉(zhuǎn)移到裝有玻璃珠的錐形瓶?jī)?nèi)，將錐形瓶置于水浴鍋中進(jìn)行消化，消化處理溫度為26?28°C，時(shí)間為15-20min ； 3)消化結(jié)束后加入培養(yǎng)基A終止消化，消化液經(jīng)過(guò)200目過(guò)濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，收集濾液； 4)將步驟3)的濾液采用梯度離心，分別用50g和30g各離心5min，然后用培養(yǎng)基B進(jìn)行洗滌2次，去除上清液，得到沉淀即為提取的肝細(xì)胞； 5)細(xì)胞培養(yǎng)板預(yù)處理，在細(xì)胞培養(yǎng)板每孔內(nèi)滴入大鼠尾膠原溶液，使其均勻鋪滿孔底，然后放入C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12?24 h，取出培養(yǎng)板，吸棄每孔內(nèi)的大鼠尾膠原溶液，以L-15培養(yǎng)基沖洗，吸凈培養(yǎng)基，置co2培養(yǎng)箱中備用； 6)將步驟4)提取的肝細(xì)胞加入培養(yǎng)基A中，制成細(xì)胞懸液，在步驟5)預(yù)處理好的細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行鋪板操作，然后將鋪好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟1)中選取的野生建鯉的質(zhì)量為80-100g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟2)中加入的胰酶消化液的體積為肝組織塊體積的5倍，胰酶消化液濃度為0.125% (體積百分比)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟2)中修剪成小塊的體積為廣3mm3。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟2)中所述玻璃珠的直徑為2-4mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟2)中消化處理溫度為27°C，時(shí)間為15-20min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟5)和步驟6)中的C02培養(yǎng)箱中溫度為27°C，C02體積分?jǐn)?shù)為5%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:培養(yǎng)基A配方為:L-15培養(yǎng)基1000mL、100mL新生胎牛血清FBS、10mL雙抗、胰島素10mg。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建鯉原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于:培養(yǎng)基B配方為:L-15培養(yǎng)基1000mL、10mL雙抗。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104293731SQ201410535197
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】杜金梁, 曹麗萍, 殷國(guó)俊, 賈睿, 劉英娟, 申玉金, 趙才源 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心