人肝細(xì)胞長期維持和增殖傳代培養(yǎng)的專用培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及人肝細(xì)胞體外長期維持和 增殖傳代培養(yǎng)的專用培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年有上百萬的人死于肝病。中國是一個肝病大國， 僅己型和丙型肝炎病毒帶原者就有1. 4億，約占全球的28%;有29. 7萬肝癌患者，占全球的 一半W上（55%)。因此在肝病研究、新藥肝毒檢測、生物人工肝及肝細(xì)胞移植等方面，需要 大量的合格人肝細(xì)胞。但肝源缺乏是全球問題，而現(xiàn)有人肝細(xì)胞培養(yǎng)方法都存在常規(guī)培養(yǎng) 維持其形態(tài)功能時間短，非常規(guī)培養(yǎng)操作繁雜、要求條件高、干擾因素多、培養(yǎng)時間不夠長， 并且都不能增殖傳代等缺陷。因此亟待研究新的人肝細(xì)胞培養(yǎng)增殖傳代方法。
[0003] 人肝細(xì)胞在醫(yī)藥相關(guān)領(lǐng)域有極為廣泛的應(yīng)用。長期W來，國內(nèi)外學(xué)者對肝細(xì)胞的 培養(yǎng)方法作了大量研究，但在常規(guī)培養(yǎng)條件下，長時間培養(yǎng)肝細(xì)胞并保持其形態(tài)功能的方 法，目前尚未見任何報道。尤其是讓肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下增殖傳代，更是難W突破。目 前分離的人肝細(xì)胞在體外常規(guī)培養(yǎng)最長可達(dá)14天，其它方法如共生培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、H明 治培養(yǎng)、H維培養(yǎng)等最長可W培養(yǎng)肝細(xì)胞到3個月。但由于干擾因素多（如共生培養(yǎng)）、操 作繁雜（H明治培養(yǎng)）、或者不能直接觀察細(xì)胞的形態(tài)改變（懸浮培養(yǎng)和H維培養(yǎng)）等送樣 郝樣的缺陷而無法滿足肝病研究的需要，因此僅部分用于檢測新藥物的肝毒性。然而，即使 用于檢測新藥物的肝毒，由于存在上述各種缺陷，所得結(jié)果也僅有相對的意義和價值。更大 的問題是，上述現(xiàn)有人肝細(xì)胞培養(yǎng)方法，都不能增殖傳代。因此，現(xiàn)有方法及所培養(yǎng)肝細(xì)胞 不僅不能作為肝病研究的合格細(xì)胞模型，更不可能為構(gòu)建生物人工肝及肝細(xì)胞移植提供合 格的肝細(xì)胞來源。
[0004] 綜上，本領(lǐng)域還有必要開發(fā)新型的人肝細(xì)胞長期維持和增殖傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)方法 及專用培養(yǎng)基。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種人肝細(xì)胞長期維持和增殖傳代培養(yǎng)的專用培養(yǎng)基和 培養(yǎng)方法。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種用于培養(yǎng)人肝細(xì)胞的培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基包括： 肝細(xì)胞基本培養(yǎng)基；W及
[0007]GSK3 目抑制劑CHIR99021 ;0. 5-10UM;
[0008]TGF目抑制劑SB431542 ;0. 5-10UM或 / 和
[0009]TGF目抑制劑A83-01 ;0. 5-10UM。
[0010] 在一個優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中包括：
[0011] GSK3 目抑制劑CHIR99021 ;l-4yM;
[001引TGF目抑制劑SB431542 ;l-8yM或 / 和 [001引TGF目抑制劑A83-01 ;l-8uM。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中還包括選自下組的成分：
[001引N-己醜-半脫氨酸（NAC) ;0. 25-25mM;
[001引 制瘤素M(OSM) ;l-100ng/ml;或 / 和
[0017] 白血病抑制因子OJ巧；100-1000u/ml。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中包括：
[001 引N-己醜-半脫氨酸（NAC) ;0.S-I2.SmM;
[0020] 制瘤素M(OSM) ;5-80ng/ml;或 / 和
[0021] 白血病抑制因子OJ巧：150-800u/ml。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中還包括選自下組的成分：
[0023] 人襲凌細(xì)胞生長因子 5-! 0化巧/!地 人戒纖維細(xì)臘生長閨子 5-K)0ng/m; 人沉細(xì)嫩生長:因子 5 -U)0ng/mH 地蠢米松 血小板銜化因子 M00ng./ml; H礫甲狀腺原魏驗 MOOng/mlo
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中：
[00巧] 乂表皮細(xì)蔽生長閑r 5-5謝m!， 人成巧維綱胞化長樹于 5~撕鳴/!化[; 人針細(xì)跑生眨詞rS-SOng/mlt 地?fù)崦姿?04-詠為感1; !虹小板.銜生因r 5-50ng/m!； 鱗巧狀腺爆毀酸 20-80t墻mL
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的肝細(xì)胞基本培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基中添加了 2. 5% 肥、5%827、1%非必須氨基酸、1%丙麗酸鋼和青鏈霉素混合液（100訝；或者添加入；5%肥 或10%B27U%非必須氨基酸、1 %丙麗酸鋼和1 %青鏈霉素（100訝等成分得到的培養(yǎng)基。 或直接使用基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基替代肝細(xì)胞基本培養(yǎng)基。所述基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM/F12、 MEM、DMEM、RPMI1640、Neurona化asal或Fischers等，均為市場上可購得的商品。
[0027] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于培養(yǎng)人肝細(xì)胞的試劑盒，所述的試劑盒中包 括前面任一所述的培養(yǎng)基。
[0028] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的培養(yǎng)基或所述的試劑盒的用途，用于維持和增 殖傳代培養(yǎng)人肝細(xì)胞。
[0029] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種維持和增殖傳代培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法，所述方法包 括；應(yīng)用前面任一所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)肝細(xì)胞。較佳地，所述的培養(yǎng)肝細(xì)胞的方法包括：
[0030] (1)將培養(yǎng)板打底（較佳地，用基質(zhì)膠、鼠尾膠、明膠、纖維連接蛋白、玻璃粘連蛋 白其中一種打底）1-24小時，然后將原代肝細(xì)胞在貼壁培養(yǎng)基（較佳地，為添加10%血清的 肝細(xì)胞基本培養(yǎng)基）中混懸，鋪板；37C培養(yǎng)1-12小時；
[0031] (2)棄用（1)中的培養(yǎng)基，將肝細(xì)胞分別換入權(quán)利要求1-5任一所述的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，前面所述的培養(yǎng)基、試劑盒、用途或方法中，所述的人肝細(xì)胞包 括但不限于；人原代肝細(xì)胞及其傳代肝細(xì)胞，從干細(xì)胞分化所得的人肝細(xì)胞或成體細(xì)胞轉(zhuǎn) 化所得的人肝細(xì)胞。
[0033] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0034] 圖1、人原代肝細(xì)胞在不同條件培養(yǎng)下，第1，14和20天拍攝的細(xì)胞形態(tài)圖。
[0035] 圖2、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-2. 1培養(yǎng)14天的體外培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)圖。
[0036] 圖3、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-3. 4培養(yǎng)21天的體外培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)圖。
[0037] 圖4、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-3. 1培養(yǎng)35天的體外培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)圖。
[0038] 圖5、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-3. 2傳代培養(yǎng)第二代，共培養(yǎng)56天的細(xì)胞形態(tài)圖。
[0039] 圖6、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-3. 3傳代培養(yǎng)第二代，共培養(yǎng)80天的細(xì)胞形態(tài)圖。
[0040] 圖7、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-2. 2傳代培養(yǎng)第H代，共培養(yǎng)110天的細(xì)胞形態(tài)圖。
[0041] 圖8、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-2. 2傳代培養(yǎng)的肝細(xì)胞形態(tài)圖。
[0042] 圖9、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-1.1/2與I-2. 1/2培養(yǎng)人原代肝細(xì)胞，在培養(yǎng)至第 20天時獲得的細(xì)胞形態(tài)圖。其中，"2個核必因子"是指"CHIR99021+SB431542"或 "CHIR99021+A83-01"。
[0043] 圖10、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-2. 2培養(yǎng)84天肝特異性標(biāo)志物的免疫染色。
[0044] 圖11、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-2. 1培養(yǎng)77天肝系相關(guān)基因的表達(dá)。
[0045] 圖12、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-3. 1培養(yǎng)11周的P450酶誘導(dǎo)功能實驗結(jié)果。
[0046] 圖13、肝細(xì)胞培養(yǎng)基I-3. 1培養(yǎng)11周的肝細(xì)胞糖原染色。
【具體實施方式】
[0047] 本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，掲示了一種人肝細(xì)胞長期維持和增殖傳代培養(yǎng) 的培養(yǎng)基W及培養(yǎng)方法。所述方法克服了現(xiàn)有肝細(xì)胞培養(yǎng)方法的缺陷，可在常規(guī)條件下長 期維持培養(yǎng)人肝細(xì)胞并使其增殖傳代，且保持與新分離的人原代肝細(xì)胞基本一致的形態(tài)功 能。所述方法培養(yǎng)條件簡單，成本低廉且安全穩(wěn)定。
[004引如本文所用，術(shù)語"含有"或"包括"包括了"包含"、"主要由……構(gòu)成（制成）"、 "基本上由......構(gòu)成"和"由......構(gòu)成"。
[0049] 培養(yǎng)基
[0050] 本發(fā)明人提供了用于進(jìn)行人肝細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。所述的培養(yǎng)基包括；GSK3目抑 制劑CHIR99021，TGF目抑制劑SB431542或/和A83-01。上述組分W適合的比例添加到肝 細(xì)胞基本培養(yǎng)基中，可為肝細(xì)胞提供適合的生長環(huán)境，促進(jìn)肝細(xì)胞的生長和擴(kuò)增，維持肝細(xì) 胞在相當(dāng)長的時間內(nèi)（約15天內(nèi)）保持穩(wěn)定的形態(tài)功能。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，用于配 制本發(fā)明的培養(yǎng)基的組分的用量如表1所示。
[0051]表1
[0052]
[005引所述的GSK3目抑制劑CHIR99021具有如下式（I)所示的結(jié)構(gòu)式：
[0054]
[00巧]所述的TGF目抑制劑SB431542具有如下式（II)所示的結(jié)構(gòu)式：
[0056]
[0057] 所述的TGF目抑制劑A83-01具有如下式（III)所示的結(jié)構(gòu)式：
[0058]
[0059] 本發(fā)明還包括與上述化合物（I)、（II)或（III)等效的藥劑制品、類似物和/或其 鹽、水合物或前體。
[0060] 所述化合物的類似物包括但不限于；所述化合物的異構(gòu)體、外消旋體。化合物具有 一個或多個不對稱中必。所W，送些化合物可W作為外消旋的混合物、單獨(dú)的對映異構(gòu)體、 單獨(dú)的非對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體混合物、順式或反式異構(gòu)體存在。
[0061] 所述的"鹽"包括但不限于；（1)與如下無機(jī)酸形成的鹽；如鹽酸、硫酸、硝酸、磯酸 等；（2)與如下有機(jī)酸形成的鹽，如己酸、草酸、了二酸、酒石酸、甲礙