一種高效分泌表達轉肽酶Sortase A的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種高效分泌表達轉膚酶SodaseA的方法，屬于基因工程領域。
【背景技術】
[0002] SodaseA發(fā)現(xiàn)于革蘭氏陽性菌中，是一種介導細胞壁錯定蛋白與細胞壁共價結 合的轉膚酶。SortaseA不僅催化反應效率高，而且其作用的祀蛋白必須具有特異性識別序 列LPXTG狂為任意氨基酸）。自SodaseA被發(fā)現(xiàn)W來，其應用范圍不斷擴大，設及疫苗研 發(fā)、核酸修飾、蛋白修飾、蛋白多膚連接和固定化等領域。
[0003] 2001年，Schneewind課題組首次應用祀T9a載體在E.COliBL2UDE3)中成功 表達了ScxrtaseA。其蛋白表達量可W滿足實驗室水平研究ScxrtaseA的需求，但不利于 SodaseA的純化及后續(xù)的酶活性檢測或酶學性質研究。此外，SortaseA的胞內生產(chǎn)由于 需要經(jīng)過破壁等步驟工業(yè)化生產(chǎn)的成本較高。因此，利用大腸桿菌的胞外分泌表達方式更 適合SodaseA的工業(yè)化生產(chǎn)，更有利于其在各個領域的拓展和應用。
[0004] 利用重組大腸桿菌胞外分泌SodaseA所面臨的主要困難是帶信號膚的目的蛋白 只能轉運到周至空間，但由于缺乏相應的外轉運機制，只有少部分SodaseA可W滲透到培 養(yǎng)基當中。目前解決該問題的一個主要策略是利用化學添加劑破壞細胞壁的完整性。但 不同的化學試劑作用的效果不一致，相同化學試劑對不同目的蛋白或者不同宿主的影響也 不一致，相同化學試劑的添加濃度W及添加時間也會對目的蛋白的胞外分泌產(chǎn)生顯著的影 響。如甘氨酸為，1%的甘氨酸對環(huán)糊精葡基轉移酶的胞外分泌有明顯的促進作用，而甘氨 酸的添加對目的蛋白如憐脂酶CW及抗地高辛人單鏈抗體的分泌則具有抑制作用。

【發(fā)明內容】
陽0化]本發(fā)明首先提供了一種重組表達SodaseA酶的重組大腸桿菌，是將來源于金黃 色葡萄球菌的去除N端信號膚的Sd基因，W祀T2化為表達載體，WE.COliBL2UDE3)為 宿主構建得到的重組菌。
[0006] 本發(fā)明要解決的另一個技術問題是提供一種應用所述重組大腸桿菌高效分泌 表達轉膚酶SodaseA的方法，在添加IPTG誘導表達SodaseA的同時添加0.75 % (g/lOOmL)的甘氨酸，并在誘導表達6小時后再添加2% (g/lOOmL)的甘氨酸。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，按2%的接種量將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基裝 液量為10%的搖瓶，37°C、250巧m條件下培養(yǎng)至ODe。。= 0. 6之后，添加終濃度為ImM的IPTG 和0. 75% (g/100血）的甘氨酸進行誘導表達，30°C，250巧m，并在誘導化后添加2% (g/100 mL)的甘氨酸，總誘導培養(yǎng)時間為4她。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，按10%的接種量將預先培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵罐， 化發(fā)酵罐中所含發(fā)酵培養(yǎng)基為化，通氣量為3vvm，轉速為50化pm，37°C培養(yǎng)，在ODe。。達到 0. 6后加入終濃度為ImM的IPTG和0. 75% (m/v)的甘氨酸，降溫至30°C誘導，并在誘導化 后添加2% (m/v)的甘氨酸，總誘導培養(yǎng)時間為4她。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，種子培養(yǎng)基：蛋白腺lOg/l，酵母粉5g/l，化CllOg/ 以去離子水定容至1L。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白腺12g，甘油4g，去離子水定容至 900血，KH2PO42. 31g，K2HPO4.3H2O16. 4g，去離子水定容至100血，憐酸鹽和其余成分分開滅 菌，再合并成IL;種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基W12rC滅菌20min。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，種子培養(yǎng)液獲得方法為：將重組菌接種到種子培養(yǎng) 基中，10血試管裝液3血，溫度為37°C，轉速25化pm，培養(yǎng)時間為12-1化。
[0012] 本發(fā)明通過對目的蛋白載體W及發(fā)酵體系中添加劑和添加策略的優(yōu)化，表明 pET-2化載體是適合SodaseA胞外生產(chǎn)的載體，采取兩階段添加甘氨酸（階段一：誘導時 添加終濃度為0. 5%的甘氨酸；階段二：誘導后6小時添加2%的甘氨酸）可W極大地提高 大腸桿菌胞外生產(chǎn)ScxrtaseA的水平，4化的胞外ScxrtaseA酶量可達272. 3111旨/1，并且縮短 發(fā)酵周期12h。可見運種兩階段分別添加甘氨酸的策略可在較短的發(fā)酵時間內將Sodase A直接分泌至胞外，既不影響發(fā)酵產(chǎn)酶初期菌體的生長和酶的過量表達，又能縮短發(fā)酵時 間節(jié)約生產(chǎn)成本。分泌至胞外的SodaseA避免了后期純化中細胞破壁的步驟，可W實現(xiàn) SodaseA的工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】 陽01引 圖1 :不同添加劑對胞外SodaseA酶活的影響（誘導后4她）。
[0014] 圖2:不同濃度甘氨酸對胞外SodaseA酶活的影響（誘導4她，甘氨酸在誘導時 添加）。
[0015] 圖3 :不同濃度甘氨酸對細胞生長的影響。
[0016] 圖4:甘氨酸不同添加策略對胞外SodaseA酶活的影響。A(誘導時添加0.75% 的甘氨酸）；B(誘導后化添加2%的甘氨酸）；C(兩階段添加策略，階段一：誘導時添加 0. 75 %的甘氨酸；階段二：誘導后化繼續(xù)添加2 %的甘氨酸）。
[0017] 圖5:SortaseA的化發(fā)酵罐胞外生產(chǎn)。
[0018] 圖6:胞外及破壁上清蛋白電泳圖。右圖，未添加甘氨酸的對照；左圖，兩階段添加 甘氨酸。
[0019] 圖7=SortaseA發(fā)酵階段（未添加添加劑）破壁上清蛋白電泳圖。圖中所注時間 為誘導后時間（如Ih表示誘導后Ih)。
【具體實施方式】
[0020] 菌體生長情況的測定：使用MapadaLive-1800分光光度計在波長600nm下測定菌 體的濃度，具體操作步驟參考儀器使用說明書。
[0021] 蛋白含量的測定：使用碧云天生物技術研究所研發(fā)的化a壯ord蛋白濃度測定試 劑盒進行檢測，具體操作步驟參看試劑盒使用說明。
[0022] SodaseA酶活測定方法：利用SodaseA能夠切斷膚段LPXTG序列中T虹和 Gly之間膚鍵的原理，合成了特異性底物D油巧^QALPETGEE-Edans(d-QALPETGEE-e)(吉 爾生化有限公司），其中Edans(e)是巧光基團，而Dabcyl(d)是澤滅基團。當該底物未被 SodaseA切斷時，Edans(e)在激發(fā)狀態(tài)下發(fā)生巧光共振能量轉移，其發(fā)出的巧光被臨近的 D油cyl(d)吸收并W熱的形式散發(fā)，巧光被澤滅，無法檢測到巧光。而當SodaseA將底物 切割成兩段之后，Edans(e)與D油cyl(d)分離，不再發(fā)生澤滅，即可檢測到其巧光值。因此 可通過Edans(e)巧光強度的變化來檢測SodaseA的酶活性。檢測方法是在96孔板中加 入200yL反應緩沖液，4yLd-QALPETGEE-e底物（1.25g/L)，20yLSodaseA酶溶液?；旌?液于Synergy?H4全功能酶標儀度ioTek)中37°C下進行動力學反應比，在激發(fā)波長350皿、 發(fā)射波長495nm下檢測巧光強度的變化情況。ScxrtaseA酶活計算公式如下：
[0023]
[0024] 其中A代表Sodas