一種高熱穩(wěn)定性的內(nèi)切木聚糖酶及其應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高熱穩(wěn)定性的內(nèi)切木聚糖酶。本發(fā)明通過對(duì)來源于嗜熱微生物的木聚糖酶DtX進(jìn)行改造，去除了信號(hào)肽，實(shí)現(xiàn)了木聚糖酶基因在異源宿主細(xì)胞如大腸桿菌內(nèi)的高效表達(dá)。本發(fā)明進(jìn)一步對(duì)該木聚糖酶進(jìn)行改造，截去了C端的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并在C末端引入二硫鍵，構(gòu)建的木聚糖酶蛋白突變體的分子量更小，熱穩(wěn)定性提高，比活力也大大提高。通過以上方式，使該木聚糖酶及其突變體更有潛力應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)?！緦＠f明】一種高熱穩(wěn)定性的內(nèi)切木聚糖酶及其應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于酶的基因工程領(lǐng)域，涉及一種木聚糖酶，尤其涉及一種高熱穩(wěn)定性的內(nèi)切木聚糖酶以及生產(chǎn)該高熱穩(wěn)定性內(nèi)切木聚糖酶的基因工程菌?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]木聚糖酶（Xylanase，EC.3.2.1.8)是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶，常被用于飼料、食品、飲料、制藥、造紙工業(yè)和生物能源等方面（Beg,Q.K.Kapoor,M.Mahajan,L.Hoondal,G.S(2001)Microbialxylanasesandtheirindustrialapplications:areview.ApplMicrobiolBiotechnol.56(3-4):326-338)。尤其在造紙工業(yè)，木聚糖酶在紙漿的預(yù)漂白、二次纖維的脫墨等過程中，水解凝結(jié)于纖維表面的半纖維素，提高漂白劑在紙漿中的擴(kuò)散速度，提高漂白效率，減少氯的使用量，從而減少漂白過程對(duì)環(huán)境的污染(LiisaViikari,AnneKantelinen,JormaSundquist,MattiLinko(1994)Xylanasesinbleaching:Fromanideatotheindustry.FEMSMicrobiologyReviews.13(2-3):335-350)。[0003]目前，研究報(bào)道的大多數(shù)木聚糖酶的最適溫度都在45_55°C，其穩(wěn)定性都比較差(Haki,G.(2003)Developmentsinindustriallyimportantthermostableenzymes:areview.BioresourTechnol.89(I):17-34)。隨著木聚糖酶的不斷開發(fā)和利用，對(duì)酶的穩(wěn)定性要求越來越高，而現(xiàn)有的商品化木聚糖酶大多數(shù)是從中溫微生物中獲得的，熱穩(wěn)定性差，在60°C以上很容易喪失催化活性，不能滿足工業(yè)應(yīng)用的需要。[0004]DictyoglomusturgidumDSM6724(以下簡(jiǎn)稱D.turgidumDSM6724)是一株于1990年在俄國(guó)堪察加半島的烏宗火山分離的菌株，是一種嗜高溫、厭氧的新型化能自養(yǎng)型微生物，最適生長(zhǎng)溫度高達(dá)80°C(Svetlichnii，V.A.，Svetlichnii，T.P.(1988)Dictyoglomusturgidussp.nov.,anewextremelythermophiliceubacteriumisolatedfromhotspringsoftheUzonvolcanocaldera.Mikrobiologiya,57:435-441)〇其基因組測(cè)序已在2008年完成（GenBankaccessionno.NC_011661).D.turgidumDSM6724能夠高效利用多種糖類作為碳源，利用糖基水解酶基因搜索，其基因組中包含54個(gè)糖類水解基因（Brumm,P.Hermanson,S.Hochstein,B.Boyum,J.Hermersmann,N.Gowda,K.Mead,D.(2011)MiningDictyoglomusturgidumforenzymaticallyactivecarbohydrases.163(2):205-14)。其中，包含三個(gè)木聚糖基因。目前，這些木聚糖酶還沒有被研究和利用。本發(fā)明涉及其中一個(gè)木聚糖酶（GeneID:217966449)基因，即DtXynllA(以下簡(jiǎn)稱DtX)。由于原始菌株的最適生長(zhǎng)溫度高達(dá)80°C，預(yù)測(cè)該基因編碼的木聚糖酶可能具有良好的熱穩(wěn)定性。[0005]但是利用野生型菌產(chǎn)酶所要求的培養(yǎng)條件苛刻。另外，野生型菌株產(chǎn)酶水平非常低，是細(xì)菌的千分之一以下。此外，野生型菌株所產(chǎn)的酶系復(fù)雜，無法直接應(yīng)用，而且目的酶的純化困難。應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)天然基因進(jìn)行改造，可以突破自然進(jìn)化的限制，獲得針對(duì)工業(yè)用途特定設(shè)計(jì)的、具有優(yōu)良性質(zhì)的人工酶基因?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，且又由于在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)重組菌中天然的木聚糖酶DtX表達(dá)量很低，而且很難純化，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是改造高熱穩(wěn)定性的木聚糖酶基因，使其在表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)高效表達(dá)，同時(shí)簡(jiǎn)化目的酶的純化步驟，并對(duì)目的酶進(jìn)行改造，進(jìn)一步提高其催化效率與熱穩(wěn)定性，以滿足工業(yè)應(yīng)用的需求。[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種基因工程木聚糖酶的制備方法，包括以下步驟：[0008]1)構(gòu)建目的蛋白基因；[0009]2)構(gòu)建基因工程菌并表達(dá)目的蛋白；[0010]3)純化目的蛋白。[0011]對(duì)于步驟1)，所述目的蛋白基因可以為木聚糖酶DtX的全基因，其序列見序列表SEQIDNO:1，其蛋白序列見序列表SEQIDNO:2。本發(fā)明利用SignalP3.0軟件對(duì)目的蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，木聚糖酶DtX的N末端存在一段含28個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。信號(hào)肽的存在可能影響目的蛋白的表達(dá)。為此，應(yīng)用分子生物學(xué)工具在DtX上去除了信號(hào)肽基因，重新構(gòu)建了不含信號(hào)肽的目的蛋白基因，其基因序列為SEQIDNO:3,蛋白序列為SEQIDN0:4。[0012]進(jìn)一步地，通過NCBIBlastp對(duì)DtX基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行分析，得出該蛋白由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，包括N端的催化結(jié)構(gòu)域（CatalyzeDomain,⑶）和C端的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CarbohydrateBindingModule,CBM)，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域由一段柔性的連接肽（Linker)相連。其中，其催化結(jié)構(gòu)域?qū)儆谔擒账饷?1家族（GHll)，碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)儆贑BM第36家族（CBM36)。但是，僅僅根據(jù)NCBIBlastp的結(jié)果，很難界定⑶的C-末端和CBM的N-末端，即Linker區(qū)域的起始和終止。為此，我們分別搜集收集了大量關(guān)于GHll和CBM36家族的蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)。通過MEGA軟件進(jìn)行序列比對(duì)，利用Pymol軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)分析，最終確定1-201位的區(qū)域?yàn)榇呋Y(jié)構(gòu)域CD(編號(hào)是從去除信號(hào)肽的蛋白的第一個(gè)氨基酸開始），202-211的區(qū)域?yàn)長(zhǎng)inker，212-328的區(qū)域?yàn)镃BM。通過DiscoveryStudio3.0軟件進(jìn)行同源建模，得到DtX的結(jié)構(gòu)模型（如圖1所示）。[0013]我們預(yù)測(cè)CBM僅影響木聚糖酶與纖維素的結(jié)合能力，對(duì)底物特異性、酶活性中心、米氏常數(shù)和可溶性木聚糖的水解能力無明顯影響。而linker的功能還不清楚，但小分子量的酶蛋白分子在反應(yīng)體系中更易于擴(kuò)散，應(yīng)該具有更強(qiáng)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。為此，根據(jù)對(duì)DtX的基因序列分析結(jié)果構(gòu)建了截去CBM結(jié)構(gòu)域的突變體基因，我們?cè)O(shè)計(jì)了的兩個(gè)截短突變體，分別是DtX-CDL(基因序列為SEQIDN0:5,蛋白序列為SEQIDN0:6)和DtX-CD(基因序列為SEQIDN0:7,蛋白序列為SEQIDN0:8)。[0014]為了進(jìn)一步提高木聚糖酶的熱穩(wěn)定性，可以在木聚糖酶C末端引入相互作用，如氫鍵、離子鍵、二硫鍵等。本發(fā)明在Dtx-CD的基礎(chǔ)上，利用Disulfidebydesign軟件，對(duì)DtX-CD的結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行計(jì)算分析，篩選出兩處可以引入二硫鍵的合理位置分別在DtX-CD中引入二硫鍵，構(gòu)建了突變體DtX-⑶Sl(基因序列為SEQIDN0:9,蛋白序列為SEQIDNO:10)和DtX-CDS2(基因序列為SEQIDNO:11，蛋白序列為SEQIDNO:12)。[0015]對(duì)于步驟2)，重組基因的載體優(yōu)選為質(zhì)粒pET28a，構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-DtXynllA的結(jié)構(gòu)如圖2所示，除此以外也可以將木聚糖酶基因整合在宿主細(xì)胞基因組上進(jìn)行表達(dá)。[0016]以上述各天然或重組基因構(gòu)建基因工程菌，使各基因可以在宿主菌中高效表達(dá)，所述宿主菌可以為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌、絲狀真菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。在此基礎(chǔ)上，通過在重組目的蛋白（包括去除信號(hào)肽的DtX及其截短突變體和含二硫鍵的截短突變體）的N端引入His-tag，不僅可以保護(hù)目的蛋白的N-末端，使得目的蛋白的表達(dá)量提高2倍，而且還有利于后續(xù)純化。[0017]對(duì)于步驟3)，具體方法為將發(fā)酵后收獲的大腸桿菌菌體懸液超聲破碎后，放置于55-65°C熱處理20-30分鐘，沉淀大量雜蛋白，此時(shí)DtX的純度已達(dá)到80%以上，再經(jīng)過一步Ni-NTA親和層析處理后就能得到95%以上純度的目的蛋白。[0018]在本發(fā)明的實(shí)施例中，將DtX及其兩個(gè)截短突變體DtX-⑶L和DtX-⑶以及含二硫鍵的截短突變體DtX-⑶Sl和DtX-⑶S2的熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較（結(jié)果如表1所示）。包括T_(最適反應(yīng)溫度）、t1/2(-定溫度下，蛋白質(zhì)活性損失一半時(shí)所需要的時(shí)間）、T5(I(-定時(shí)間內(nèi)，蛋白質(zhì)活性損失一半時(shí)所需要的溫度）等動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性參數(shù)以及通過差示熱量掃描儀（differentialscanningcalorimetry,DSC)測(cè)定的蛋白質(zhì)解折疊50%時(shí)的溫度（Tm)這一熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性參數(shù)。[0019]最適溫度比較：DtX為78?82°C;DtX-CDL為85?87°C;DtX-CDSl和DtX-CDS2為83?85°C;DtX-CD為80?82°C。與DtX比較，DtX-CD的最適溫度有一定的提高，DtX-CDL，DtX-CDSl和DtX-CDS2的最適溫度明顯提高。[0020]從圖7的85°C時(shí)的熱穩(wěn)定性可以看出，DtX-CDL和DtX-CD的熱穩(wěn)定性明顯高于DtX。從表1的具體數(shù)據(jù)可見，DtX的半衰期t1/2為8.54h;DtX-CD的t1/2為62.45h，為DtX的7.3倍；DtX-CDL的穩(wěn)定性最好，t1/2為77.63h;DtX-CDSl和DtX-CDS2的熱穩(wěn)定性相對(duì)于DtX-CD有一定的提高，t1/2分別為68.14h和70.02h。[0021]T5Q(3C0的比較結(jié)果顯示，DtX為82.51°C;DtX-CDL為91.2°C;DtX-CD為89.7°C;DtX-CDSl和DtX-CDS2的T5Q(XI)均為91°C左右，都高于DtX大約8.5°C。[0022]該結(jié)果與DSC所檢測(cè)的Tm結(jié)果一致（圖8)，DtX有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，故Tml=92.86°C，Tni2=75.46°C;DtX-CDL為94.58°C;DtX-CD為94.18°C;DtX-CDSl和DtX-CDS2的T111相對(duì)于DtX-CD提高了約0.6°C。[0023]由于DtX、DtX-CDL、DtX-CD、DtX-CDSl和DtX-CDS2分子量存在差異，我們將比活力定義為每Umol木聚糖酶所含的酶活力（U/ymol)。表1的數(shù)據(jù)顯示，DtX-⑶L的比活力最高，高于DtX-CD，說明linker的存在有助于提高酶的活力，推測(cè)因?yàn)镈tX-CDL的最適溫度和熱穩(wěn)定性的提高。DtX比活力反而最低，可能CBM的存在不利于酶的催化水解。DtX-CDSl和DtX-⑶S2相對(duì)于DtX-⑶活力略有提高，二硫鍵的引入并沒有破壞DtX-⑶原有的催化活性。從DtX、DtX-CDL、DtX-CD、DtX-CDSl和DtX-CDS2的比較可以看出，C末端對(duì)酶的熱穩(wěn)定性有較大影響，穩(wěn)定該區(qū)域可能提高酶的熱穩(wěn)定性。[0024]通過以上技術(shù)方案的實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：[0025](1)在極端嗜熱菌中獲得新型內(nèi)切木聚糖酶，比常規(guī)的中溫菌中獲得的內(nèi)切木聚糖酶具有更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性與高溫催化活性。[0026](2)通過對(duì)編碼木聚糖酶的基因片段去除信號(hào)肽和引入N末端組氨酸尾，可以在異源宿主細(xì)胞如大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行木聚糖酶基因的高效表達(dá)。[0027](3)目的蛋白木聚糖酶的表達(dá)水平高，且純化方便。[0028](4)構(gòu)建的木聚糖酶蛋白突變體的分子量更小，熱穩(wěn)定性提高，比活力也大大提商。[0029]以上優(yōu)點(diǎn)使得木聚糖酶及其截短突變體更有潛力應(yīng)用于食品、造紙、飼料等行業(yè)的工業(yè)生產(chǎn)中。[0030]以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、【具體實(shí)施方式】及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果?！緦＠綀D】【附圖說明】[0031]圖1是DtX的結(jié)構(gòu)模型；[0032]圖2是重組質(zhì)粒pET28a_DtXynllA的構(gòu)建圖；[0033]圖3是DtX的酶學(xué)性質(zhì)表征：最適溫度曲線；[0034]圖4是DtX的酶學(xué)性質(zhì)表征：熱穩(wěn)定性曲線；[0035]圖5是DtX的酶學(xué)性質(zhì)表征：最適pH曲線；[0036]圖6是DtX的酶學(xué)性質(zhì)表征：pH穩(wěn)定性曲線；[0037]圖7是DtX及其截短突變體和含二硫鍵的截短突變體的85°C熱穩(wěn)定性比較圖；[0038]圖8是DtX及其截短突變體和含二硫鍵的截短突變體的DSC曲線圖。【具體實(shí)施方式】[0039]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步闡述。[0040]實(shí)施例1、D.turgidumDSM6724菌株的培養(yǎng)和保存[0041]按照DSMZ的配方，配置厭氧培養(yǎng)基（anaerocellummedium)，分裝于厭氧試管中，每管5ml，培養(yǎng)基封閉后用真空泵將試管中的空氣抽干，并充入一定量的氮?dú)夂投趸嫉幕旌蠚怏w（80%N2和20%CO2)，在厭氧箱中用培養(yǎng)基Iml溶解購(gòu)買于DSMZ的D.turgidumDSM6724,按照1%的接菌量接種于5ml試管中，混勻，80°C靜置培養(yǎng)數(shù)天，直至細(xì)菌開始生長(zhǎng)起來。然后轉(zhuǎn)移至裝有IOOml培養(yǎng)基的錐形瓶中80°C培養(yǎng)數(shù)天，-80°C保存菌體。[0042]實(shí)施例2、基因組DNA的提取[0043]取5ml小試管培養(yǎng)的D.turgidumDSM6724,用北京普博欣生物技術(shù)有限責(zé)任公司的細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒（BacteriaGenomicMiniPreparationKit)提取細(xì)菌的基因組，所得基因組DNA溶液放4°C冰箱備用。[0044]實(shí)施例3、目的基因的克隆[0045]以GenBank報(bào)道的D.turgidumDSM6724DtX(GeneID:217966449)基因序列（即SEQIDNO:1)為模板，用01ig〇7.0設(shè)計(jì)兩條特異性引物，通過PCR技術(shù)獲得目的基因。引物如下：[0046]Pl:5'-TCAGCCATGGGCATGTTTAAAGTGTA-3'(下劃線標(biāo)注的為NcoI的酶切位點(diǎn)）[0047]P2:5'-GTGCCAAGCTTCTATTGTATTTCTAA-3'(下劃線標(biāo)注的為HindIII的酶切位點(diǎn)）[0048]將目的基因與載體進(jìn)行NcoI和HindIII雙酶切處理，體系如下，[0049]【權(quán)利要求】1.一種基因工程木聚糖酶，其特征在于，其基因序列為SEQIDN0:3,蛋白序列為SEQIDN0:4。2.-種基因工程木聚糖酶，其特征在于，其是DtX酶截去了C端的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域之后的突變體。3.如權(quán)利要求2所述的基因工程木聚糖酶，其特征在于，其基因序列為SEQIDNO:5，蛋白序列為SEQIDN0:6;或基因序列為SEQIDN0:7,蛋白序列為SEQIDN0:8。4.一種基因工程木聚糖酶，其特征在于，其是DtX酶截去了C端的碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域之后，又在C末端引入相互作用的突變體。5.如權(quán)利要求4所述的基因工程木聚糖酶，其特征在于，所述引入的相互作用為二硫鍵。6.如權(quán)利要求5所述的基因工程木聚糖酶，其特征在于，其基因序列為SEQIDN0:9，蛋白序列為SEQIDNO:10;或基因序列為SEQIDNO:11，蛋白序列為SEQIDNO:12。7.-種制備基因工程木聚糖酶的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)構(gòu)建目的蛋白基因；2)構(gòu)建基因工程菌并表達(dá)目的蛋白；3)純化目的蛋白；其中，步驟1)中目的蛋白基因?yàn)镾EQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:5、SEQIDN0:7、SEQIDN0:9或SEQIDN0:11。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟2)在構(gòu)建基因工程菌時(shí)，在重組目的蛋白的N端引入His-tag。9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟3)的具體方法為將發(fā)酵后收獲的宿主菌菌體懸液超聲破碎后，放置于55-65°C熱處理20-30分鐘，沉淀大量雜蛋白，再經(jīng)過一步Ni-NTA親和層析處理后得到目的蛋白。10.如權(quán)利要求1-6所述的基因工程木聚糖酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用?！疚臋n編號(hào)】C12N9/42GK104293748SQ201410535145【公開日】2015年1月21日申請(qǐng)日期:2014年10月11日優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日【發(fā)明者】馮雁,楊廣宇,吳秀娟,安嬌,于瑤,王慧楠,張少博申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)