一種小鼠肝星狀細(xì)胞的改良分離方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種細(xì)胞分離方法，尤其是一種小鼠肝星狀細(xì)胞的改良分離方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是，通過插管固定、灌注消化、細(xì)胞分散、小鼠肝星狀細(xì)胞分離等步驟完成對小鼠肝星狀細(xì)胞的分離。用上述方法得到了需要的小鼠肝星狀細(xì)胞，質(zhì)量很好，比傳統(tǒng)大鼠的分離質(zhì)量好很多，而且在整個過程比較便捷，在普通實(shí)驗(yàn)室就能完成，很穩(wěn)定，由于采用了小鼠，不用一些特殊的設(shè)備，降低了這種分離方法的成本，在得到高質(zhì)量的小鼠肝星狀細(xì)胞，為進(jìn)一步深入研究小鼠肝星狀細(xì)胞的生物學(xué)行為創(chuàng)造了條件。
【專利說明】一種小鼠肝星狀細(xì)胞的改良分離方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)胞分離方法，尤其是一種小鼠肝星狀細(xì)胞的改良分離方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝星狀細(xì)胞是ECM的主要來源，HSC激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(MFC)，各種致纖維化因素均把HSC作為最終靶細(xì)胞，肝星狀細(xì)胞激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(MFC)，各種致纖維化因素均把HSC作為最終靶細(xì)胞，正常情況下肝星狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。當(dāng)肝臟受到炎癥或機(jī)械刺激等損傷時，肝星狀細(xì)胞被激活，其表型由靜止型轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ钚?，激活的肝星狀?xì)胞一方面通過增生和分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與肝纖維化的形成和肝內(nèi)結(jié)構(gòu)的重建，另一方面通過細(xì)胞收縮使肝竇內(nèi)壓升高。
[0003]通常在通過大鼠的肝臟分離得到，但是這種方法成本很高，需要特殊的儀器，而且分離的質(zhì)量一般，通過小鼠肝臟分離是比較理想的方法，但是目前沒有一種小鼠肝星狀細(xì)胞分離的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于，提供一種分離質(zhì)量高的小鼠肝星狀細(xì)胞的改良分離方法。
[0005]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:第一步:選取雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量25~30g，普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)飲，對其操作前禁食12h ；
[0006]第二步:將選取的小鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射，待麻醉起效后，固定于工作臺中，用75%乙醇腹部洗浴消毒，剔毛、75%乙醇再次消毒、剖腹，將腸管推于左側(cè)，充分暴露門靜脈、下腔靜脈、上腔靜脈，在下腔`靜脈、上腔靜脈各預(yù)置I號縫線I根，暫不結(jié)扎，楔形剪開下腔靜脈，插管，結(jié)扎固定，同時結(jié)扎上腔靜脈，剪開門靜脈；
[0007]第三步:采用37°C預(yù)熱的D-HanK’ s液對門靜脈進(jìn)行灌注，速度為5~7mL/min，灌注7min后，觀察肝臟變黃白，流出的D-HanK’s液中無肉眼可見血液后，開始灌注37°C預(yù)熱含膠原蛋白酶的HBSS溶液，IOmin左右，速度為3~5mL/min，直至肝臟變軟、變脆，壓之凹陷不易恢復(fù)時，結(jié)束灌注；
[0008]第四步:取肝臟置于消毒平皿內(nèi)，去除肝包膜、血管等纖維結(jié)締組織，去除膽囊，充分細(xì)致剪碎肝組織，加入HBSS液20mL，于37°C進(jìn)行震蕩消化25min得到細(xì)胞懸液；
[0009]第五步:細(xì)胞懸液中加入4°C含20% FBS的DMEM液20mL終止消化，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾進(jìn)入50mL聚丙烯離心管中，30Xg離心5min,取上清液,上清液450Xg離心7min,去上清，取沉淀，加入6mL的15 %的optiprep,充分混勻，在混合液上面加6mL的11.5 %的optiprep,然后在其上再加6mL的HBSS, 1400Xg, 4?離心18min后，吸取界面層細(xì)胞。
[0010]上述方法中，第五步吸取界面層細(xì)胞，就得到了需要的小鼠肝星狀細(xì)胞，利用這種方法得到的小鼠肝星狀細(xì)胞質(zhì)量很好，比傳統(tǒng)大鼠的分離質(zhì)量好很多，而且在整個過程比較便捷，在普通實(shí)驗(yàn)室就能完成，很穩(wěn)定，由于采用了小鼠，不用一些特殊的設(shè)備，降低了這種分離方法的成本，在得到高質(zhì)量的小鼠肝星狀細(xì)胞，為進(jìn)一步深入研究小鼠肝星狀細(xì)胞的生物學(xué)行為創(chuàng)造了條件。
【具體實(shí)施方式】
[0011]第一步:選取雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量25~30g，普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)飲，在操作前禁食12h。
[0012]
[0013]第二步:將小鼠用3%戊巴比妥鈉(60mg/kg)腹腔注射，待麻醉起效后，固定于工作臺中，75%乙醇腹部洗浴消毒，剔毛、75%乙醇再次消毒、剖腹，將腸管推于左側(cè)，充分暴露門靜脈、下腔靜脈、上腔靜脈，在下腔靜脈、上腔靜脈各預(yù)置I號縫線I根，暫不結(jié)扎，楔形剪開下腔靜脈，插管，結(jié)扎固定，同時結(jié)扎上腔靜脈，剪開門靜脈。
[0014]第三步:采用37°C預(yù)熱的D-HanK’ s液對門靜脈進(jìn)行灌注，速度為6mL/min，灌注7min后，觀察肝臟變黃白，流出的D-HanK’ s液中無肉眼可見血液后，開始灌注37°C預(yù)熱含膠原蛋白酶的HBSS溶液(0.3mg/mL的IV型膠原酶)，lOmin，速度為4mL/min，直至肝臟變軟、變脆，壓之凹陷不易恢復(fù)時，結(jié)束灌注。
[0015]第四步:剪斷肝周韌帶，取肝臟置于消毒平皿內(nèi)，去除肝包膜、血管等纖維結(jié)締組織，去除膽囊，充分細(xì)致剪碎肝組織，加入已配制好的HBSS液20mL (0.3mg/mL的IV型膠原酶、2 μ g/mDNA酶)，于37°C進(jìn)行震蕩消化25min得到細(xì)胞懸液。
[0016]第五步:細(xì)胞懸液中加入4°C含20% FBS的DMEM液20mL終止消化，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾后進(jìn)入50mL聚丙烯離心管中，30Xg離心5min,棄沉淀,取上清液,450Xg離心7min,去上清，取沉淀，加入6mL的15% optiprep,充分混勻，在混合液上面加6mL的11.5%的optiprep,然后在其上再加6mL的HBSS, HOOXgdO離心18min,吸取界面層細(xì)胞。
`[0017]取得小鼠肝星狀細(xì)胞后可以加入5mL的GBSS懸浮后，450Xg，8min離心清洗后去上清，沉淀中加入DMEM培養(yǎng)液(含20% FBS及雙抗)重懸，活細(xì)胞鑒定后，種瓶培養(yǎng)。
[0018]可以進(jìn)一步活細(xì)胞鑒定、性質(zhì)鑒定、原代培養(yǎng)等細(xì)胞研究。
【權(quán)利要求】
1.一種小鼠肝星狀細(xì)胞的改良分離方法，其方法如下: 第一步:選取雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量25~30g，普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)飲，對其操作前禁食12h ； 第二步:將選取的小鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射，待麻醉起效后，固定于工作臺中，用75%乙醇腹部洗浴消毒，剔毛、75%乙醇再次消毒、剖腹，將腸管推于左側(cè)，充分暴露門靜脈、下腔靜脈、上腔靜脈，在下腔靜脈、上腔靜脈各預(yù)置I號縫線I根，暫不結(jié)扎，楔形剪開下腔靜脈，插管，結(jié)扎固定，同時結(jié)扎上腔靜脈，剪開門靜脈； 第三步:采用37°C預(yù)熱的D-HanK’ s液對門靜脈進(jìn)行灌注，速度為5~7mL/min，灌注7min后，觀察肝臟變黃白，流出的D-HanK’ s液中無肉眼可見血液后，開始灌注37°C預(yù)熱含膠原蛋白酶的HBSS溶液，IOmin左右，速度為3~5mL/min，直至肝臟變軟、變脆，壓之凹陷不易恢復(fù)時，結(jié)束灌注； 第四步:取肝臟置于消毒平皿內(nèi)，去除肝包膜、血管等纖維結(jié)締組織，去除膽囊，充分細(xì)致剪碎肝組織，加入HBSS液20mL，于37°C進(jìn)行震蕩消化25min得到細(xì)胞懸液； 第五步:細(xì)胞懸液中加入4°C含20% FBS的DMEM液20mL終止消化，經(jīng)200目濾網(wǎng)過濾進(jìn)入50mL聚丙烯離心管中，30Xg離心5min,取上清液,上清液450Xg離心7min,去上清,取沉淀，加入6mL的15%的optiprep,充分混勻，在混合液上面加6mL的11.5%的optiprep,然后在其上再加6mL的HBSS，1400Xg，4°C離心18min后，吸取界面層細(xì)胞。
【文檔編號】C12N5/071GK103805553SQ201210455728
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月8日
【發(fā)明者】俞富祥 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院