專利名稱：可自發(fā)綠色熒光能轉(zhuǎn)移的人肝癌細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，具體涉及可自發(fā)綠色熒光，具轉(zhuǎn)移能力的人肝癌細(xì)胞系，及其建立方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)是全球肝癌高發(fā)區(qū)，每年約20萬(wàn)人死于肝癌，占全球肝癌死亡人數(shù)的一半左右?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)肝癌進(jìn)行科學(xué)研究一百多年，雖然取得了不少成績(jī)，但肝癌人群的總體5年生存率至今仍只有3％左右，而提高肝癌預(yù)后的最大障礙是其極高的侵襲和轉(zhuǎn)移率，即使是根治性手術(shù)切除，仍有50％的病人會(huì)在5年內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。因此，深入研究肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的內(nèi)在機(jī)制及其相應(yīng)的干預(yù)治療，已成為進(jìn)一步改善肝癌預(yù)后的關(guān)鍵。為此目的，必須建立適宜的人肝癌研究模型。目前普遍應(yīng)用的人腫瘤轉(zhuǎn)移模型，是將人腫瘤接種于免疫缺陷動(dòng)物，主要是指在裸小鼠體內(nèi)形成的人癌裸小鼠轉(zhuǎn)移模型，和能在免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移的人腫瘤細(xì)胞系。復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所曾建立了人肝細(xì)胞癌裸小鼠模型(腫瘤1986，610-13)、高轉(zhuǎn)移人肝細(xì)胞癌裸小鼠模型(Int J Cancer 1996，66239-243)、高轉(zhuǎn)移人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系(Br JCancer 1999，81814-21)，不同轉(zhuǎn)移潛能的人肝癌細(xì)胞克隆株(WorldJ Gastroenterol 2001，7630-636)。這些為研究肝癌轉(zhuǎn)移提供了可貴的實(shí)驗(yàn)材料。然而，縱觀國(guó)內(nèi)外的人肝癌模型，均無(wú)法早期發(fā)現(xiàn)肝癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及對(duì)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行示蹤，也無(wú)法實(shí)時(shí)觀察腫瘤的生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及與之密切相關(guān)的腫瘤血管形成等情況，在評(píng)估藥物或其他干預(yù)治療的效果上也較為困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立穩(wěn)定表達(dá)自發(fā)性綠色熒光的高、低轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系。
本發(fā)明采用從高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系，(MHCC97，Br J Cancer 1999，81814-21)中分出的高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系MHCC97-H、和低轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系MHCC97-L(World J Gastroenterol 2001，7630-636)為母細(xì)胞，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法(DOSPER轉(zhuǎn)染試劑，Cat.No.1811169，羅氏公司，德國(guó))將pIRES2-EGFP質(zhì)粒(PT3267-5，Clontech公司，美國(guó))，分別轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞株中，經(jīng)新霉素(G418)體外連續(xù)篩選，得到可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞克隆，按常規(guī)方法分別擴(kuò)增建系，得綠色熒光高、低轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系，分別命名為MHCC97-HG(保藏號(hào)CGMCC No1063)和MHCC97-LG(保藏號(hào)CGMCC No1062)。
經(jīng)體內(nèi)外熒光表達(dá)檢測(cè)、基本生物學(xué)特性及體內(nèi)外轉(zhuǎn)移能力系列實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，本發(fā)明的細(xì)胞系具有以下特點(diǎn)1.在體外常規(guī)培養(yǎng)下，MHCC97-HG與MHCC97-LG細(xì)胞均能穩(wěn)定發(fā)出綠色熒光，激發(fā)波長(zhǎng)530nm，種植到裸鼠皮下及肝臟原位后，肝臟原位腫瘤及其轉(zhuǎn)移灶均可在活體熒光顯微鏡下觀察到發(fā)出的綠色熒光。
2.MHCC97-HG與MHCC97-LG的一般生物學(xué)特性基本一致，細(xì)胞均呈多邊形上皮樣，貼壁生長(zhǎng)，接觸性生長(zhǎng)抑制喪失，亞三倍體核型，染色體數(shù)目50-58條，在裸鼠皮下及肝臟原位均可成瘤。
3.MHCC97-HG與MHCC97-LG的侵襲、轉(zhuǎn)移能力有明顯差別，MHCC97-HG細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力較MHCC97-LG顯著增高，其S期細(xì)胞的比例提高了7.5％；細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加快，細(xì)胞倍增時(shí)間縮短4小時(shí)；浸潤(rùn)、遷徙能力是后者的2-4倍；種植于肝臟原位后出現(xiàn)100％的肝內(nèi)和肺轉(zhuǎn)移，而MHCC97-LG僅為10-30％，轉(zhuǎn)移率提高3倍以上，發(fā)生肝內(nèi)及肺轉(zhuǎn)移時(shí)間早，轉(zhuǎn)移灶大且數(shù)目多；腫瘤血管形成活躍，新生血管數(shù)明顯增多。
結(jié)果表明，本發(fā)明人肝癌細(xì)胞系穩(wěn)定整合綠色熒光蛋白基因，可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光，種植到裸鼠皮下或肝臟原位種植后，可容易地在活體熒光顯微鏡下觀察到腫瘤組織及腫瘤轉(zhuǎn)移灶發(fā)出的綠色熒光；因其母細(xì)胞取自同一個(gè)肝癌病人的腫瘤組織，故遺傳背景高度相似，但MHCC97-HG比MHCC97-LG轉(zhuǎn)移能力卻明顯為高，且較之其母細(xì)胞MHCC97-H顯示出更高的轉(zhuǎn)移能力，為人肝癌的基因比較研究提供了依據(jù)。本發(fā)明帶自發(fā)熒光的人肝癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，在肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、腫瘤血管形成及抗轉(zhuǎn)移藥物篩選等肝癌基礎(chǔ)及臨床研究方面有著廣闊的應(yīng)用前景。


圖1是熒光顯微鏡下MHCC97-HG和MHCC97-LG細(xì)胞及其原位腫瘤可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光。
圖2是體外侵襲實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中，左側(cè)均為MHCC97-HG，右側(cè)MHCC97-LG，A、B為Borden小室，箭頭示穿膜細(xì)胞，光鏡，200×；C、D為肺HE染色，箭頭所示為肺轉(zhuǎn)移灶，光鏡，200×；E、F為肺冰凍切片，箭頭所示為肺轉(zhuǎn)移灶，光鏡及熒光顯微鏡，200×。
圖3是腫瘤微血管密度檢測(cè)及肝臟原位荷瘤裸鼠腹部皮膚窗活體觀察腫瘤血管形成及腫瘤轉(zhuǎn)移結(jié)果，其中，A/BMHCC97-HG/MHCC97-LG，抗CD31免疫熒光染色，箭頭所示為腫瘤血管，熒光顯微鏡，200×；C活體觀察腫瘤血管形成，箭頭所示為腫瘤血管；D活體觀察腫瘤轉(zhuǎn)移，箭頭所示為肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶，活體熒光顯微鏡，80×。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1建立綠色熒光高、低轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系。
1.將MHCC97-H及MHCC97-L細(xì)胞按3×105細(xì)胞/每孔分別加入六孔板，每孔加2ml含10％FCS(Hyclone，Utah，USA)的DMEM培養(yǎng)液(GIBCOBRL，Grand Island，NY，USA)，孵育至細(xì)胞有60～80％匯聚；2.轉(zhuǎn)染當(dāng)天更換1ml DMEM(加5％FCS)培養(yǎng)液，37℃孵育1h；3.準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染液溶液A1.5ug的pIRES2-EGFP(PT3267-5，ClontechLaboratories Inc.，Palo Alto，CA，USA)質(zhì)粒DNA用HBS緩沖液稀釋至50ul(30ug/ml)/每孔；溶液B6ulDOSPER(Cat.No.1811169，Roche Molecular Biochemical s，Germany)用HBS緩沖液稀釋至50ul(120ug/ml)/每孔；混合A液與B液，輕柔振蕩，15～25℃孵育15min；4.每孔逐滴加入轉(zhuǎn)染液，邊振蕩混勻；37℃孵育6h；5.吸出培養(yǎng)液，每孔加2～3ml新鮮DMEM(加10％FCS)培養(yǎng)液，37℃常規(guī)培養(yǎng)24h。
6.G418篩選在培養(yǎng)液中加入G418，起始濃度450ng/ml，在3周時(shí)間內(nèi)濃度逐漸遞增到800ng/ml，直到細(xì)胞逐漸單克隆化，取殘余克隆分別擴(kuò)增培養(yǎng)，選取熒光顯微鏡下發(fā)光強(qiáng)度最高的兩個(gè)克隆分別命名為MHCC97-HG(源自MHCC97-H)及MHCC97-LG(源自MHCC97-L)。
7.在無(wú)G418篩選壓力下常規(guī)培養(yǎng)36天后鑒定其熒光細(xì)胞百分率及其他一般生物學(xué)特性。常規(guī)凍存后復(fù)蘇成活良好，熒光強(qiáng)度穩(wěn)定。
8.取MHCC97-HG及MHCC97-LG細(xì)胞各5×106/0.2毫升接種于裸小鼠皮下。裸小鼠為BALB/C-nu/nu，雄性，4-6周齡，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，無(wú)特殊病原體環(huán)境下飼養(yǎng)。2周后皮下瘤生長(zhǎng)至直徑約1.0cm，取皮下瘤切成直徑1mm的瘤組織小塊原位接種于裸鼠肝臟，5周后取出腫瘤，觀察結(jié)果表明，原位腫瘤及轉(zhuǎn)移灶有綠色熒光。
表1是細(xì)胞基本特性比較，表2是原位腫瘤自發(fā)性轉(zhuǎn)移能力比較。
表1.
MHCC97-HG MHCC97-LG36天熒光細(xì)胞百分率 99.6％ 99.5％中期染色體數(shù)(主要范圍/比例) 52-58(57％)50-56(59％)細(xì)胞周期(G0-G1/S/G2-M，％) 68.5/22/9.577/14.5/8.5細(xì)胞倍增時(shí)間(h) 32.0 36.1運(yùn)動(dòng)/侵襲能力(穿膜細(xì)胞數(shù)/HP)48.8/58.2 24.9/12.1表2.
MHCC97-HG MHCC97-LG35天后原位腫瘤大小(cm) 1.47±0.20 1.00±0.18a腹壁侵犯8/10 3/10b血性腹水2/10 0/10肝內(nèi)轉(zhuǎn)移10/10 1/10b橫膈轉(zhuǎn)移6/10 1/10b局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 9/10 2/10b肺轉(zhuǎn)移 10/10 3/10b
權(quán)利要求
1.可自發(fā)綠色熒光能轉(zhuǎn)移的人肝癌細(xì)胞系(CGMCC No1063，1062)，其特征是能穩(wěn)定發(fā)出綠色熒光，細(xì)胞呈多邊形上皮樣，貼壁生長(zhǎng)，接觸性生長(zhǎng)抑制喪失，亞三倍體核型，染色體數(shù)目50-58條，在裸鼠皮下及肝臟原位可成瘤，肝內(nèi)和肺轉(zhuǎn)移率高，轉(zhuǎn)移時(shí)間早，轉(zhuǎn)移灶大且數(shù)目多，腫瘤血管形成活躍。
2.按權(quán)利要求1所述的可自發(fā)綠色熒光能轉(zhuǎn)移的人肝癌細(xì)胞系，其特征是包括綠色熒光高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系，命名為MHCC97-HG(CGMCCNo1063)和綠色熒光低轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系，命名為MHCC97-LG(CGMCCNo1062)。
3.權(quán)利要求1所述的人肝癌細(xì)胞系，其特征是通過(guò)下述方法建立，采用從高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系中分出的高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系MHCC97-H和低轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系MHCC97-L為母細(xì)胞，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pIRES2-EGFP質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞株，經(jīng)新霉素體外連續(xù)篩選，得到可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞克隆，按常規(guī)方法分別擴(kuò)增建系。
4.權(quán)利要求1所述的人肝癌細(xì)胞系，其特征是在體外常規(guī)培養(yǎng)下，MHCC97-HG與MHCC97-LG細(xì)胞均激發(fā)波長(zhǎng)530nm，種植后，可觀察活體發(fā)出的綠色熒光。
5.權(quán)利要求1所述的人肝癌細(xì)胞系，其特征是所述MHCC97-HG與MHCC97-LG的一般生物學(xué)特性基本一致。
6.權(quán)利要求1所述的人肝癌細(xì)胞系，其特征是其中MHCC97-HG細(xì)胞其S期細(xì)胞比例提高7.5％，細(xì)胞倍增時(shí)間縮短4小時(shí)，肝臟原位種植100％肝內(nèi)和肺轉(zhuǎn)移。
全文摘要
本發(fā)明屬微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，具體涉及可自發(fā)綠色熒光，具轉(zhuǎn)移能力的人肝癌細(xì)胞系。本發(fā)明從高轉(zhuǎn)移人肝癌細(xì)胞系中分出高、低轉(zhuǎn)移母細(xì)胞，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pIRES2－EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上述細(xì)胞株，經(jīng)新霉素體外連續(xù)篩選，得到可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光的高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，命名為MHCC97－HG(CGMCC No1063)和MHCC97－LG(CGMCC No1062)，本發(fā)明人肝癌細(xì)胞系種植后，可容易地在活體熒光顯微鏡下觀察腫瘤組織及腫瘤轉(zhuǎn)移灶，為人肝癌的基因比較研究提供了依據(jù)，在肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、腫瘤血管形成及抗轉(zhuǎn)移藥物篩選等肝癌基礎(chǔ)及臨床研究方面有著廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61L27/38GK1546655SQ20031010929
公開(kāi)日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月11日
發(fā)明者徐泱, 孫惠川, 湯釗猷, 徐 泱 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院