專利名稱：人nk/t細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種細(xì)胞系，尤其涉及一株人NK/T細(xì)胞系ZQNK-29。
背景技術(shù)：
30年以前，科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞里有自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell，NK)的存在，是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，由于NK細(xì)胞的殺傷活性無MHC限制，不依賴抗體，因此稱為自然殺傷活性。NK細(xì)胞不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。從那時(shí)開始，科學(xué)家們就研究自然殺傷細(xì)胞的具體功能，建立了自然殺傷細(xì)胞激活其他白細(xì)胞(如T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)以及針對各種感染激活免疫應(yīng)答的理論。

NK細(xì)胞一直被認(rèn)為是機(jī)體殺死癌細(xì)胞和感染性病原的最佳武器，研究人員嘗試通過不同的途徑來提高NK的抗腫瘤作用，但是NK細(xì)胞的純化及體外大量擴(kuò)增在技術(shù)上存在一定的難度，因此有許多人試圖建立NK細(xì)胞系用同種異體NK細(xì)胞進(jìn)行腫瘤生物治療，國外科學(xué)家們相繼建立了永生化的NK細(xì)胞系HANK1、KHYG-I、NK-92、NKL、NK-Y、PLT-2、、M0TN、IMC-U SNK-6和SNT-8-1和YT、ΝΚ3. 3等，又采用IL-2基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立了 IL-2/NK-92、IL-2/NKL和IL-2/NK3. 3等轉(zhuǎn)基因NK細(xì)胞系。尤其是ΝΚ-92的建立，促進(jìn)了其在腫瘤過繼免疫治療中的應(yīng)用研究，并為深入研究NK細(xì)胞的特征、功能，進(jìn)一步揭示它在免疫系統(tǒng)中的確切作用，提供了有利的研究材料。中國專利200910077749. 5公開了一種自然殺傷細(xì)胞，該自然殺傷細(xì)胞為保藏編號為CGMCC NO. 2901的人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞。本發(fā)明的NKG細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷力強(qiáng)，在體內(nèi)存活能力強(qiáng)，質(zhì)量穩(wěn)定，抗腫瘤反應(yīng)強(qiáng)。中國專利03152968. 2公開了一種白細(xì)胞介素-15基因修飾的自然殺傷細(xì)胞株，該細(xì)胞株表型為CD56強(qiáng)陽性，CD16和CD3均為陰性，其形態(tài)為分散的、半貼壁生長狀態(tài)。其制備方法是將IL-15的cDNA編碼區(qū)插入pcDNA3真核表達(dá)載體，構(gòu)建分泌型重組真核表達(dá)載體pcDNA3/IL-15 ;利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NK-92細(xì)胞；在篩選培養(yǎng)基中加入Geneticin (G418)進(jìn)行篩選；有限稀釋克隆化細(xì)胞，以IL-15的依賴細(xì)胞株測定克隆細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-15的活性，從中挑選出表達(dá)IL-15的陽性細(xì)胞克?。粚⒃摽寺≡?0 100活性單位的IL-15的完全a -MEM培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增，得到具有臨床應(yīng)用價(jià)值的工程細(xì)胞株。中國專利申請201010507100. 5公開了人一種干擾素-alpha基因修飾的自然殺傷細(xì)胞株，是將人干擾素-alpha基因轉(zhuǎn)染入自然殺傷細(xì)胞株NKL細(xì)胞，構(gòu)建成的穩(wěn)定分泌、表達(dá)人干擾素-alpha的細(xì)胞株。該細(xì)胞株經(jīng)RT-PCR及ELISA檢測鑒定能夠在胞內(nèi)表達(dá)，并將合成的IFN-α分泌到胞外培養(yǎng)上清中。該細(xì)胞株能夠有效殺傷肝癌細(xì)胞，這種抗腫瘤效應(yīng)與NKL-IFNa細(xì)胞IFN-Y、Granzyme、TNF-a和Perforin基因和蛋白的表達(dá)水平提高相關(guān)，并且修飾后的NKL細(xì)胞株對外界刺激更加敏感。上述專利公開的NK細(xì)胞在抗腫瘤方面雖然取得了一定進(jìn)展，但是由于NK細(xì)胞的純化及體外大量擴(kuò)增在技術(shù)上存在一定的難度，而國內(nèi)僅見一株保藏編號為CGMCCNO. 2901的人自然殺傷細(xì)胞NKG細(xì)胞，未見有人NK/T細(xì)胞系建立的報(bào)道。因此，建立并提供更合適于國人的NK/T細(xì)胞系，對自然殺傷細(xì)胞的抗腫瘤的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究有其更重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株能長期在體外傳代培養(yǎng)，可以大量擴(kuò)增的人NK/T細(xì)胞系。一株人NK/T細(xì)胞系，命名為人NK/T細(xì)胞系ZQNK-29，于2012年06月12日保藏在位于武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC N0:C201278。本發(fā)明人NK/T細(xì)胞系可長期傳代，大量擴(kuò)增，并具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，為研究者深入開展自然殺傷細(xì)胞抗腫瘤作用機(jī)制及臨床過繼免疫治療提供新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>

圖I為本發(fā)明ZQNK-29細(xì)胞系光鏡下活細(xì)胞形態(tài)(10 X )，細(xì)胞呈透亮圓形的淋巴細(xì)胞，生長旺盛。圖2本發(fā)明20^(-29細(xì)胞系!^染色后的細(xì)胞形態(tài)(40 X )，細(xì)胞呈圓形，核漿比例小，核仁較明顯，核膜清晰，核分裂像多見。圖3為本發(fā)明ZQNK-29細(xì)胞系透射電鏡下的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞核大呈腎形核，細(xì)胞表面有微絨毛。圖4為本發(fā)明ZQNK-29細(xì)胞系掃描電鏡下的細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞表面有許多凸起。圖5為本發(fā)明ZQNK-29細(xì)胞系細(xì)胞周期分析結(jié)果。圖6為本發(fā)明ZQNK-29細(xì)胞系細(xì)胞生長曲線圖。圖7為本發(fā)明ZQNK-29細(xì)胞系染色體核型分布圖，染色體眾數(shù)46條，表現(xiàn)為2倍體細(xì)胞，但有部分異常核型。圖8為本發(fā)明ZQNK-29細(xì)胞，在體外抗5種腫瘤細(xì)胞的抑制曲線，(a)效靶比為25 1，(b)效靶比為 50 I。圖9為ZQNK-29細(xì)胞和人肺癌A549細(xì)胞接種裸鼠實(shí)驗(yàn)圖，(a)ZQNK_29細(xì)胞接種裸鼠皮下第13天未見明顯腫塊；(b)ZQNK-29細(xì)胞接種裸鼠皮下第25天未見明顯腫塊；(c)人肺癌A549細(xì)胞接種裸鼠皮下第25天的腫塊；(d)人肺癌A549細(xì)胞接種裸鼠皮下第45天的腫塊；(e)人肺癌A549加ZQNK-29細(xì)胞7天可見腫塊；(f)人肺癌A549加ZQNK-29細(xì)胞15天后腫塊消失。
具體實(shí)施例方式( 一 ) ZQNK-29細(xì)胞系的建立I. I標(biāo)本的來源取自一名患有鼻部血管中心性NK/T細(xì)胞淋巴瘤男性患者的外周血10ml，肝素抗凝。并經(jīng)患者同意、家屬知情。I. 2外周血單個核細(xì)胞的分離無菌抽取患者外周血10ml，其中2ml采取常規(guī)方法，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行了 T細(xì)胞免疫亞群測定，其結(jié)果為CD25 = 60%、CD19 = 1%、CD4 = 13%、CD8 = 3%、CD56 = 81%,⑶3 = 16%,⑶44 = 71%。剩下8ml外周血用等量的無菌Hank’ s溶液稀釋后混勻，用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行密度梯度離心，2000轉(zhuǎn)/分，20分鐘離心，室溫20度。吸取中界層面的單個核細(xì)胞，經(jīng)Hank’s液洗2遍，1500轉(zhuǎn)/分，10分鐘，室溫20度。加新鮮完全的1640培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液5ml分裝置30ml塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。I. 3細(xì)胞的分離純化細(xì)胞培養(yǎng)96小時(shí)后，鏡下觀察可見透亮而生長旺盛的淋巴細(xì)胞，用⑶56陰性免疫磁珠(Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway)進(jìn)行NK細(xì)胞分離純化,將純化后的細(xì)胞,加新鮮完全1640培養(yǎng)液混勻,傳代置30ml塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)，再用同樣的培養(yǎng)條件培養(yǎng)。1.4EBV細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后，取出生長旺盛的淋巴細(xì)胞，將細(xì)胞傳代置24孔板中，每孔細(xì)胞中加EBV 2滴進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，2天后取出24孔培養(yǎng)板在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，大部分孔內(nèi)細(xì)胞生長良好，可見細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞形態(tài)以透亮圓形、大小不等的淋巴細(xì)胞散在生長為主。一周以后，在鏡下觀察，可見其中有幾個孔內(nèi)細(xì)胞生長特別旺盛，有細(xì)胞重疊生長現(xiàn)象，周邊有許多透亮圓形、大小不等的淋巴細(xì)胞密集生長，有的凝聚成葡萄串樣生長。仔細(xì)挑選出幾個細(xì)胞生長特別旺盛的孔，將孔內(nèi)細(xì)胞輕輕吹打，將細(xì)胞傳代置30ml塑料瓶中培養(yǎng)，隨后細(xì)胞生長狀況好，且生長速率快，2-3天可以傳代一次，該細(xì)胞已連續(xù)穩(wěn)定生長2年以上，經(jīng)液氮凍存后復(fù)蘇，細(xì)胞狀態(tài)好，存活率達(dá)95%以上，將該細(xì)胞命名為ZQNK-29細(xì)胞系。該細(xì)胞系于2012年06月12日保藏在位于武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC N0:C201278。ZQNK-29細(xì)胞培養(yǎng)所用完全的1640培養(yǎng)液1640培養(yǎng)液(南美洲Hyclon產(chǎn)品)，內(nèi)含10%胎牛血清(南美洲Hyclon產(chǎn)品)、植物血凝素PHA(廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所)20ug/ml、rIL-II (北京四環(huán)生物制藥有限公司)800U/ml并加適量雙抗(南美洲Hyclon產(chǎn)品)。⑶56陰性免疫磁珠分選方法0)56細(xì)胞陰性免疫磁珠(Dynal Biotech ASA, Oslo,Norway)分選方法,得到純化的NK細(xì)胞，具體操作步驟如下I)取IOOul磁珠懸液，加lOOulHank’ s液，混勻置磁架上放置I分鐘，去上清，再加IOOul Hank，s液，混勻待用；2)收集離心后的細(xì)胞，制成約IX 108/100ul MNC，加40 ul熱滅活的胎牛血清；3)加40ul CD56抗體，混勻，2_8°C孵育20分鐘；4)加2ml Hank’s液清洗細(xì)胞，傾斜試管數(shù)次混勻混合物，4°C，300g,離心8分鐘，去上清液；5)加900ulHank’ s液，重新混勻細(xì)胞，加IOOul預(yù)洗過的磁珠，4°C孵育10分鐘，伴輕輕的傾斜和旋轉(zhuǎn)；6)用TIP頭輕輕的吹打5次重新混勻有磁珠結(jié)合的細(xì)胞，再加500ul Hank’ s液增加總體積，重新混勻有磁珠結(jié)合的細(xì)胞，置于磁架上2分鐘，移出上清置另一管磁珠中，新管里加有50ul預(yù)洗的磁珠；7)4°C孵育10分鐘，輕輕的傾斜和旋轉(zhuǎn)，置磁架上2分鐘，移出上清液，分裝到24孔培養(yǎng)板中，每孔加2ml培養(yǎng)液。
EBV制備的方法EBV液來自B958細(xì)胞株(上海細(xì)胞生物研究所提供)。提取時(shí)先復(fù)蘇并培養(yǎng)B958細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞處于指數(shù)生長期時(shí)，收集全部細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融3次，再轉(zhuǎn)移至離心管中，3000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，將上清液用O. 22 μ m濾膜過濾后分裝，_80°C保存?zhèn)溆谩?二)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察2. I光鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察2. I. I培養(yǎng)的活細(xì)胞形態(tài)取傳代培養(yǎng)的細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下(日本Olympus MT_2倒置顯微鏡)觀察活細(xì)胞生長情況。圖I為第50代細(xì)胞光學(xué)形態(tài)圖片，可見細(xì)胞生長旺盛，背景清晰，雜質(zhì)少見，以透亮的中等大小的淋巴細(xì)胞為主，有的成單細(xì)胞生長，有的細(xì)胞相互凝集成大小不等 的細(xì)胞團(tuán)樣生長，2-3天可以傳代。2. I. 2H. E染色后的細(xì)胞形態(tài)收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分，15分鐘的離心，去上清液，用沉淀細(xì)胞進(jìn)行石蠟包膜，切片后H. E染色及光鏡觀察，如圖2所示，培養(yǎng)細(xì)胞大小一致，細(xì)胞核大，核仁較明顯，染色質(zhì)散在部分有凝聚，核膜清晰，較規(guī)則，部分見多核，并見較多核分裂像分別為多極核分裂像(Y型)。2. 2電鏡下的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察2. 2. I透射電鏡下細(xì)胞形態(tài)的觀察收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，Hank’s液洗二遍,最后一遍1500轉(zhuǎn)/分，離心7分鐘,棄去上清液，加入2. 5%的戊二醛，樣品在2. 5%的戊二醛溶液中4°C固定過夜，然后按下列步驟處理樣品(I)倒掉固定液，用O. 1M，pH7. O的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15min ；(2)用I %的鋨酸溶液固定樣品l_2h ；(3)倒掉固定液，用O. 1M，pH7. O的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15min ；(4)用梯度濃度(包括50%，70%，80%，90%和95%五種濃度)的乙醇溶液對樣品進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15min，再用100%的乙醇處理一次，每次20min ;最后過度到純丙酮處理20min ；(5)用包埋劑與丙酮的混合液(V/V = 1/1)處理樣品Ih ；(6)用包埋劑與丙酮的混合液(V/V = 3/1)處理樣品3h ；(7)純包埋劑處理樣品過夜；將經(jīng)過滲透處理的樣品包埋起來，70°C加熱過夜，即得到包埋好的樣品。樣品在Reichert超薄切片機(jī)中切片，獲得70_90nm的切片，該切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15min，即可在日本JEOL公司的JEM-1230型透射電鏡下觀察。透射電鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果如圖3所示，超微結(jié)構(gòu)形態(tài)特征細(xì)胞呈圓形，中等大小，核較大，核漿比例小，核大多呈圓形或卵圓形，核膜完整，有的核膜有凹陷呈腎形核，或多個凹陷，有的核膜可見長短不一的凸起或多個凸起，一個或多個核仁清楚可見；核染色質(zhì)有的均勻分布，有的聚集濃密，分布不均，有的靠近核膜；核分裂較多見，細(xì)胞表面有較多突起、微絨毛豐富。如圖4所示，細(xì)胞內(nèi)各細(xì)胞器清楚，有較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、分泌顆粒，核漿和中間微絲也比較豐富，胞漿有大量游離核糖體，Go I gi體、胞內(nèi)微絲、分泌泡和致密顆粒，有核染色質(zhì)邊聚現(xiàn)象，有的可見線粒體腫大、密度降低、間隙加寬。2. 2. 2掃描電鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，Hank’s液洗二遍，最后一遍1500轉(zhuǎn)/分，離心7分鐘，棄去上清液，加入2. 5%的戊二醛，樣品在2. 5%的戊二醛溶液中4°C固定過夜，然后按下列步驟處理樣品
(I)倒掉固定液，用O. 1M，pH7. O的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15分鐘；用I %的鋨酸溶液固定樣品l_2h ；(2)倒掉固定液，用O. 1M，pH7. O的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15分鐘；用梯度濃度(包括50%，70%，80%，90%和95%五種濃度)的乙醇溶液對樣品進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15min，再用100%的乙醇處理兩次，每次20分鐘；(3)用乙醇與醋酸異戊酯的混合液(V/V = 1/1)處理樣品30min，再用純醋酸異戊酯處理樣品1-2小時(shí)；(4)臨界點(diǎn)干燥；(5)鍍膜，觀察。處理好的樣品在荷蘭Philips公司的XL30型環(huán)境掃描電鏡中觀察。如圖5所示，細(xì)胞呈圓形，細(xì)胞表面有大小不等的圓球狀凸起，有的細(xì)胞表面有叢狀或密集的短小微絨毛突起，有的細(xì)胞凝聚在一起生長，核分裂多見。(三)細(xì)胞倍體及細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的細(xì)胞，將細(xì)胞收集于IOml離心管中，1000轉(zhuǎn)/分，離心5min離心，棄去上清，制成lX105/ml細(xì)胞懸液,再用Hank’ s液清洗一遍,棄去上清,將離心沉淀的細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)器上，邊旋轉(zhuǎn)，邊緩慢滴加75%的冷酒精2ml固定，放4°C冰箱過夜待測。取固定后的細(xì)胞IOOul于另一流式上樣管中，并加適量PBS液混勻，1000rpm/5min離心，去除酒精。再用PBS液清洗一遍，棄去上清，用CycleTESTPLUS DNA Reagent Kit (美國B. D公司產(chǎn)品)制備樣本加250ul A液(胰酶緩沖液)輕輕混勻室溫放置lOmin，再加200ul B液(胰酶和RNA酶抑制劑)輕輕混勻，室溫放置10分鐘，最后加200ul預(yù)冷C液(碘化丙酊)染色，避光冷藏10分鐘。FCM上樣測試。實(shí)驗(yàn)經(jīng)3次重復(fù)，進(jìn)行結(jié)果分析。結(jié)果ZQNK-29屬于二倍體細(xì)胞。66. 6%細(xì)胞處于Gl期(有絲分裂前期)，6. 46%細(xì)胞處于G2期(有絲分裂后期)，26. 94%細(xì)胞處于S期(DNA合成期)。(四)細(xì)胞生長曲線及細(xì)胞群體倍增時(shí)間的測定取對數(shù)生長期的傳代細(xì)胞，收集于IOml離心管中，1000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄上清液，用Hank’ s液洗一次，1000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄上清液，加1640培養(yǎng)液，內(nèi)含10%胎牛血清，rIL-II (北京四環(huán)生物制藥有限公司)800 υ /ml,以及適量雙抗(南美洲Hyclon產(chǎn)品)。定量用臺盼蘭活細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，細(xì)胞總數(shù)為I. 1X107，用培養(yǎng)液加至22ml，制成5. O XlOVml的細(xì)胞懸液，取Iml細(xì)胞懸液于30ml培養(yǎng)瓶中，再加4ml新鮮培養(yǎng)液，共分裝22個培養(yǎng)瓶，置于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)以后，每天取2瓶細(xì)胞，用臺盼蘭活細(xì)胞計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，直至細(xì)胞數(shù)下降為止。細(xì)胞群體倍增時(shí)間(DT)計(jì)算公式DT(h) = tXlg2/ (LgNt-IgNo) t代表細(xì)胞處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)時(shí)間，No及Nt分別代表對數(shù)生長期的起始和終止的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞群體倍增時(shí)間的結(jié)果表2-3-1 ZQNK-29細(xì)胞生長情況
權(quán)利要求
1.一株人NK/T細(xì)胞系，其特征在于，命名為人NK/T細(xì)胞系ZQNK-29，保藏編號為CCTCCNO C201278o
全文摘要
本發(fā)明公開了一株人NK/T細(xì)胞系，命名為人NK/T細(xì)胞系ZQNK-29，于2012年06月12日保藏在位于武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC C201278。本發(fā)明人NK/T細(xì)胞系可長期傳代，大量擴(kuò)增，并具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，為研究者深入開展自然殺傷細(xì)胞抗腫瘤作用機(jī)制及臨床過繼免疫治療提供新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br> 文檔編號C12R1/91GK102876632SQ20121039480
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者錢麗娟, 顧琳慧, 牟瀚舟, 凌志強(qiáng), 馮建國, 杜靈彬, 凌雨田, 姜志明, 孫文勇, 孔祥鳴, 朱赤紅, 許沈華, 蘇丹, 毛偉敏 申請人:浙江省腫瘤醫(yī)院