一種乳腺癌體外三維細(xì)胞模型的建立及其在藥物耐藥機(jī)制、逆轉(zhuǎn)劑篩選研究中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種乳腺癌體外三維細(xì)胞模型的建立及其在藥物耐藥機(jī)制、逆轉(zhuǎn)劑篩選研究中的應(yīng)用。運(yùn)用“3D no base and embedded”方法將一定量的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞種植在Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室上，通過培養(yǎng)形成厚度約為40μm，層數(shù)達(dá)到10～12層的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的三維多層細(xì)胞模型。在MCF-7多層細(xì)胞模型上單用及聯(lián)用P-GP抑制劑LY335979對化療藥物阿霉素的轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)及攝取行為考察證明其在培養(yǎng)過程中發(fā)生耐藥現(xiàn)象；并將其應(yīng)用于阿霉素耐藥逆轉(zhuǎn)劑人參皂苷20(S)-Rh2的篩選。
【專利說明】一種乳腺癌體外三維細(xì)胞模型的建立及其在藥物耐藥機(jī)制、逆轉(zhuǎn)劑篩選研究中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及腫瘤體外模型【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種乳腺癌體外三維細(xì)胞模型的建立及其在藥物耐藥機(jī)制、逆轉(zhuǎn)劑篩選研究中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]單層細(xì)胞模型作為現(xiàn)今主流的體外研究模型，卻存在著與在體實(shí)體瘤很大的差異，直接導(dǎo)致了藥物篩選與預(yù)測的失敗。三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是介于單層細(xì)胞培養(yǎng)與動物實(shí)驗(yàn)之間的一種技術(shù)，可用于研究細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)之間的相互作用及腫瘤微環(huán)境對于細(xì)胞分化、增殖、凋亡及基因表達(dá)的影響。它與傳統(tǒng)的二維平面細(xì)胞培養(yǎng)相比，能夠更真實(shí)的模擬實(shí)體瘤的結(jié)構(gòu)，彌補(bǔ)了體外細(xì)胞培養(yǎng)與在體研究的差異。
[0003]現(xiàn)有的三維細(xì)胞模型包括多層細(xì)胞模型(multicellular layers, MCL)及多球體細(xì)胞模型(multicellular spheroid, MCS)。常用的培養(yǎng)方法包括自發(fā)性細(xì)胞聚集、基質(zhì)涂布培養(yǎng)、轉(zhuǎn)瓶法、支架輔助培養(yǎng)法、旋轉(zhuǎn)細(xì)胞生物反應(yīng)器等。多層細(xì)胞模型與球體細(xì)胞模型相比，能夠直接定量的測定藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)行為而不受藥物需要熒光標(biāo)記的限制等優(yōu)點(diǎn)。運(yùn)用三維多層細(xì)胞模型來研究藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)、分布特征，為新藥篩選、抗腫瘤藥物的新機(jī)制研究提供指導(dǎo)作用。
[0004]多藥耐藥(MDR)往往是導(dǎo)致臨床化療治療失敗的主要原因之一。MDR有兩種不同的表型，一種是對第一次化療就產(chǎn)生耐藥，稱天然性耐藥(Natural resistance)或稱內(nèi)源性耐藥(Intrinsic resistance);另一種是在化療過程中產(chǎn)生耐藥,故稱獲得性耐藥(Aquired resistance)。與單層細(xì)胞相比,腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)形成多細(xì)胞三維模型時,往往表現(xiàn)的更為耐藥，此現(xiàn)象又被稱為“多細(xì)胞耐藥(Mult1-cellular resistance)”。這一現(xiàn)象發(fā)生的機(jī)制是多方面的，包括藥物轉(zhuǎn)運(yùn)外排泵的高表達(dá)而導(dǎo)致細(xì)胞動力學(xué)改變；細(xì)胞周期的改變；抗凋亡作用；一些生長因子及蛋白的高表達(dá)；缺氧或PH值低等腫瘤微環(huán)境的改變。
[0005]近年來國內(nèi)外對天然藥物逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的研究取得了一定的進(jìn)展，一些植物多酚、黃酮、萜類等成分都具有逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的功效。中藥逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥具有毒副作用小，作用靶點(diǎn)多，在逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的同時，往往還具有直接抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能等多種活性，更能從多角度綜合治療腫瘤，提高化療的整體治療水平。因此，從傳統(tǒng)中藥中篩選出活性成分開發(fā)成腫瘤化療增敏劑，具有很好的臨床開發(fā)前景。人參皂苷20 (S)-Rh2是由日本學(xué)者Kitagawa在1983年首次從紅參中分離得到并確定分子式的，含量極低，提取率僅為
0.001%。20 (S)-Rh2具有達(dá)瑪烷結(jié)構(gòu)，屬于原人參二醇型皂苷。前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明人參皂苷20(S)-Rh2為外排轉(zhuǎn)運(yùn)體P-GP的非競爭性抑制劑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是建立一種人乳腺癌三維細(xì)胞模型，證明其在培養(yǎng)過程中發(fā)生耐藥，基于該模型對抗腫瘤藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)進(jìn)行研究，并將其應(yīng)用于耐藥逆轉(zhuǎn)劑的篩選。運(yùn)用“3D no base and embedded”方法將一定量的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞種植在Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室上，通過培養(yǎng)形成厚度約為40 μ m，層數(shù)達(dá)到10?12層的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的三維多層細(xì)胞模型。在MCF-7單層細(xì)胞上，單用阿霉素組及聯(lián)用P-GP特異性抑制劑LY335979組的轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)曲線及阿霉素的藥物攝取量并沒有差異。而在MCF-7多層細(xì)胞上，聯(lián)用P-GP特異性抑制劑LY335979組轉(zhuǎn)運(yùn)曲線明顯低于單用阿霉素組，并且多層細(xì)胞對于阿霉素的攝取量顯著性減少并被LY335979有效逆轉(zhuǎn)。上述結(jié)果證明多層細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生耐藥。進(jìn)一步，將構(gòu)建的MCF-7多層細(xì)胞運(yùn)用于阿霉素耐藥逆轉(zhuǎn)劑人參皂苷20(S)-Rh2的篩選，聯(lián)用20(S)-Rh2組與單用阿霉素組相比，轉(zhuǎn)運(yùn)曲線明顯降低且對阿霉素的攝取量顯著性增加。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1 ;人參皂苷20(S)_Rh2的結(jié)構(gòu)式。
[0008]圖2 ；A, MCF-7單層細(xì)胞HE染色形態(tài)圖。B，MCF-7多層細(xì)胞HE染色形態(tài)圖。
[0009]圖3 ;A，阿霉素聯(lián)用LY335979在MCF-7單層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)曲線。B，阿霉素聯(lián)用LY335979在MCF-7多層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)曲線。C，阿霉素聯(lián)用LY335979在MCF-7單層細(xì)胞及多層細(xì)胞上的攝取。
[0010]圖4 ;A，阿霉素聯(lián)用人參皂苷Rh2在MCF-7多層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)曲線。B，阿霉素聯(lián)用人參皂苷20 (S)-Rh2在MCF-7多層細(xì)胞上的攝取。

【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1:構(gòu)建乳腺癌MCF-7三維多層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型
[0012]實(shí)驗(yàn)材料:
[0013]人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞由天津血液病研究所提供，于37°C，5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%小牛血清(PAA)的RPMI1640 (Gibeo)。胎牛血清(Fetal bovineserum)購于 Hyclone (Logan, Utah, USA);膜蛋白酶(Trypsin)購于 Amersco (Solon,Oh1, USA);青霉素、鏈霉素購于南京生興生物工程公司(江蘇)；Matrigel購于BDB1sciences (USA), Millicell 細(xì)胞培養(yǎng)小室購于 Millipore (Merck Millipore, USA).鹽酸阿霉素粉末(純度> 99% )購于南京盛林化工(江蘇)；LY335979購于SelleckChemicals(USA);人參皂苷20 (S)-Rh2 (純度> 98% )購自吉林大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室(吉林，中國)。
[0014]實(shí)驗(yàn)方法:
[0015]MCF-7細(xì)胞消化、計數(shù)，用含6% Matrigel的預(yù)冷無血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。以2*105 cells/孔的密度接種于24孔Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室中。冰上靜置30min后放入37°C ,5% CO2的孵箱中培養(yǎng)4h。待膠液凝固后，內(nèi)外室分別補(bǔ)加400ul及600ul 10%含血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)十天，并隔天換液。
[0016]實(shí)施例2:構(gòu)建乳腺癌MCF-7單層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型
[0017]實(shí)驗(yàn)材料:同實(shí)施例一
[0018]實(shí)驗(yàn)方法:
[0019]MCF-7細(xì)胞消化、計數(shù)，用10 %含血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。以2*105cells/孔的密度、400ul的體積接種于24孔Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室內(nèi)室中。外室補(bǔ)加600ull0%含血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞形成致密單層，并隔天換液。
[0020]實(shí)施例3:轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)及攝取實(shí)驗(yàn)[0021 ] 實(shí)驗(yàn)材料:同實(shí)施例一
[0022]實(shí)驗(yàn)方法:
[0023]1.MCF-7多層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型及單層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型構(gòu)建方法同實(shí)施例1及實(shí)施例2中的實(shí)驗(yàn)方法
[0024]2.轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)實(shí)驗(yàn)
[0025]Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室輔助培養(yǎng)的MCF-7多層細(xì)胞及單層細(xì)胞培養(yǎng)成熟后，細(xì)胞培養(yǎng)小室用PBS液清洗兩次。上、下室分別加入400ul、600ul Hank’s平衡鹽溶液(HBSS) 37 °C平衡lOmin。分為三組進(jìn)行預(yù)給藥:0.1 % DMSO組；LY335979 (I μ M)組及20(S)-Rh2(10yM)，37°C溫孵lh。撤去上室的預(yù)給液后，上室分三組進(jìn)行給藥=ADR(1yM)單用組，ADR(1yM)與 LY335979 (I μ M)聯(lián)用組及 ADR (10 μ Μ)與 20 (S)-Rh2 (10 μ Μ)聯(lián)用組給藥體積均為400111。371:搖床溫孵不同時間(15，30，45，60，9011^11)，取下室耶55液100111，并及時補(bǔ)齊下室體積，保持轉(zhuǎn)運(yùn)過程中下室體積不改變。采用直接沉淀蛋白法提取樣品，用LC-MS/MS(AB Science, USA)進(jìn)行濃度測定。
[0026]3.攝取實(shí)驗(yàn)
[0027]轉(zhuǎn)運(yùn)終點(diǎn)(90min)時，取出Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室的中層插片，用Iml超純水刮取細(xì)胞，反復(fù)凍融三次，定量取出lOOul，采用直接沉淀蛋白法提取樣品，用LC-MS/MS(ABScience, USA)進(jìn)行濃度測定。并用Bradford法定蛋白進(jìn)行蛋白校準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1.一種體外人乳腺癌MCF-7三維多層細(xì)胞模型，其特征在于:運(yùn)用“3D no base andembedded”方法將一定量的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞種植在Millicell細(xì)胞培養(yǎng)小室上，通過十天的培養(yǎng)形成厚度約為40 μ m，層數(shù)達(dá)到10?12層的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的三維多層細(xì)胞模型。
2.如權(quán)利要求1所述的體外人乳腺癌MCF-7三維多層細(xì)胞模型對抗腫瘤藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)及攝取行為的評價，其特征在于:多層細(xì)胞在培養(yǎng)過程中發(fā)生耐藥。
3.如權(quán)利要求2所述的體外人乳腺癌MCF-7三維多層細(xì)胞模型的轉(zhuǎn)運(yùn)動力學(xué)及攝取研究在抗腫瘤藥物耐藥逆轉(zhuǎn)劑篩選的應(yīng)用，其特征在于:聯(lián)用耐藥逆轉(zhuǎn)劑組與單用抗腫瘤藥物組相比，轉(zhuǎn)運(yùn)曲線明顯降低且對抗腫瘤藥物的攝取量顯著性增加。
【文檔編號】C12Q1/02GK104232584SQ201410471270
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】王廣基, 張經(jīng)緯, 魯萌, 周芳 申請人:中國藥科大學(xué)