一種穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素10的細(xì)胞系及復(fù)合制劑及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素10的細(xì)胞系及復(fù)合制劑及應(yīng)用，雞防御素10由猴胎腎細(xì)胞MARC145/Gal-10,CCTCC NO：C2014208表達(dá)得到。同時(shí)，本發(fā)明還公開了一種由雞防御素8和雞防御素10混合制得的復(fù)合制劑，其中的雞防御素8由猴胎腎細(xì)胞MARC145/Gal-8CCTCC NO：C2014207表達(dá)得到。本發(fā)明公開的細(xì)胞系蛋白表達(dá)量高，傳代穩(wěn)定，無論是作為單一制劑還是作為復(fù)合制劑，都具有廣譜抗菌性，安全性好，可作為替代傳統(tǒng)的抗生素進(jìn)行使用。CCTCC NO:C201420720141107CCTCC NO:C201420820141107
【專利說明】一種穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素10的細(xì)胞系及復(fù)合制劑及應(yīng) 用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素10的 細(xì)胞系及復(fù)合制劑及應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 我國是禽類產(chǎn)品出口大國，養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展不僅關(guān)系到廣大養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)利 益，還關(guān)系到國民的身體健康。然而，由于抗生素的濫用，導(dǎo)致檢測(cè)出藥物殘留量超標(biāo)，嚴(yán)重 威脅食品安全問題，同時(shí)也產(chǎn)生了大量的耐藥菌株，這給養(yǎng)禽業(yè)的疾病防控和治療工作帶 來了嚴(yán)重的阻礙。為了養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展，我們亟需尋找到一種新的途徑或者新的方法，防 止耐藥性的出現(xiàn)和食品安全等問題。因此尋找和開發(fā)無耐藥性的新型抗菌藥物具有非常重 要的現(xiàn)實(shí)意義（Miyasaki，1998)。
[0003] 防御素（defensin)又名嗜中性多肽（Neutrophil Peptides, NP)，是一類對(duì)抗外 源性病源茵的防御性肽類活性物質(zhì)，是生物機(jī)體免疫系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，在動(dòng)物、植 物、昆蟲體內(nèi)廣泛存在，具有廣譜抗菌功能（Tang，1999)。研究表明，各種防御素對(duì)革蘭氏 陰性菌、革蘭氏陽性菌、分枝桿菌、霉菌、真菌、囊膜病毒及腫瘤細(xì)胞有不同程度的抑制作用 (Salz man，2003)。Gallinacin是廣泛存在于雞體內(nèi)的一種β-防御素，在雞防御系統(tǒng)中有 重要作用，具有很強(qiáng)的抗細(xì)菌活性和廣泛的抗菌譜，提示我們可以將其開發(fā)為一種新的抗 微生物制劑。因此，雞防御素的成功獲取能帶來極大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。但雞體內(nèi)天然防御 素表達(dá)量低、分子小，分離困難，化學(xué)合成防御素成本又太高，所以利用基因工程技術(shù)重 組表達(dá)外源基因已成為獲取目標(biāo)蛋白的有效途徑之一（Chen，2001)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是在于提供了一種穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素10(Gallinacin-10,本發(fā) 明或稱Gal-10)的細(xì)胞系，該細(xì)胞系已于2014年11月7日送往中國典型培養(yǎng)物保藏中心 進(jìn)行保藏，分類命名：猴胎腎細(xì)胞MARC145/Gal-10,保藏編號(hào)：CCTCC NO :C2014208。地址： 中國武漢武漢大學(xué)。
[0005] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了猴胎腎細(xì)胞MARC145/Gal-10細(xì)胞系表達(dá)的重組 雞防御素10,該防御素具有顯著的抗菌活性，安全性好。
[0006] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種雞防御素復(fù)合制劑，該制劑是由雞防御 素8和雞防御素10混合制得，所述的雞防御素8由猴胎腎細(xì)胞MARC145/Gal-8 (CCTCC NO :C2014207)細(xì)胞系表達(dá)得到，雞防御素10由猴胎腎細(xì)胞MARC145/Gal-10(CCTCC NO : C2014208)細(xì)胞系表達(dá)得到。
[0007] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了猴胎腎細(xì)胞MARC145/Gal_10細(xì)胞系在制備抑菌 藥物中的應(yīng)用，包括在制備生物防腐劑，生物抑菌劑中的應(yīng)用，還包括用于制備家禽生物藥 品中的應(yīng)用，特別是在制備雞細(xì)菌感染性疾病藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供了一種雞防御素復(fù)合制劑在制備抑菌藥物中的應(yīng) 用，包括在制備生物防腐劑，生物抑菌劑中的應(yīng)用，還包括用于制備家禽生物藥品中的應(yīng) 用，特別是在制備雞細(xì)菌感染性疾病藥物中的應(yīng)用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0010] 一種能穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素8的細(xì)胞系，其制備方法如下：
[0011] ⑴從15日齡的仔雞體內(nèi)采集新鮮的雞腎組織，提取雞組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄的cDNA 產(chǎn)物用DNase I 37 °C處理20min以去除基因組DNA污染；
[0012] (2)根據(jù)雞防御素8基因序列，PCR擴(kuò)增雞防御素8,設(shè)計(jì)引物如下：
[0013] P8-1 :5' CGGAATTCATGAAGATCCTTTACCTTCTCTTGG 3'
[0014] P8-2 :5, CGGGATCCTTAGTCGTACACAGTCCGGCA 3，
[0015] (3)用EcoR I和BamH I雙酶切雞防御素8和pIRES2-EGFP，將防御素8基因連接 到載體PIRES2-EGFP，獲得重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-GAL-8,用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
[0016] (4)將復(fù)蘇后傳代3次的marc-145細(xì)胞以胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的高 糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)成5 X IO5個(gè)/mL的密度，接種于若干個(gè)直徑為35mm的培養(yǎng)皿中，于37°C、 5%0)2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2411。待細(xì)胞融合至70%?80%時(shí)，按照1^?(^6(^ &1^1^2000 操作說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作，對(duì)照組不加脂質(zhì)體。6h后更換有血清、無雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，開始用600 μ g/mL的G418進(jìn)行篩選，直至絕大部分細(xì)胞死 亡，維持篩選6周。將獲得的細(xì)胞采用極限稀釋法傳至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。每孔大約1個(gè)細(xì) 胞，交替使用常規(guī)培養(yǎng)基和G^S^OOug/mL)培養(yǎng)基培養(yǎng)單個(gè)細(xì)胞，至其長(zhǎng)出單個(gè)克隆。在 熒光顯微鏡下挑選出最優(yōu)的細(xì)胞克隆繼續(xù)培養(yǎng)，并不斷擴(kuò)繁至建立新的細(xì)胞系，得到穩(wěn)定 轉(zhuǎn)染PIRES2-EGFP-GAL-8的細(xì)胞系，該細(xì)胞系已于2014年11月7日送往中國典型培養(yǎng)物保 藏中心進(jìn)行保藏，分類命名：猴胎腎細(xì)胞MARC145/Gal-8,保藏編號(hào)：CCTCC N0:C2014207。 地址：中國武漢武漢大學(xué)。
[0017] 具有以下特征：（1)從形態(tài)上觀察，猴胎腎細(xì)胞MARC145/Gal-8形態(tài)比較規(guī)則， 呈近圓形，細(xì)胞折光性強(qiáng)，胞質(zhì)飽滿，核質(zhì)清晰；（2)細(xì)胞易于消化、貼壁和傳代，最適在含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，細(xì)胞倍增時(shí)間為32h ; (3)能高效表達(dá)雞防御素8,具 有較好的抑菌活性，抑菌譜廣泛；(4)細(xì)胞傳代50次以上，仍可以穩(wěn)定遺傳 Gal-8基因，穩(wěn) 定表達(dá)出雞防御素8。
[0018] 一種能穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素10的細(xì)胞系，其制備方法同表達(dá)雞防御素10的細(xì) 胞系，僅引物不同，具體如下：
[0019] P10-1 :5, CGGAATTCATGAAGATCCTCTGCCTGC 3，
[0020] P10-2 :5, CGGGATCCTTACTGCGCCGGAATCT 3，
[0021] Marcl45/pIRES2-EGFP-GAL-10細(xì)胞系已于2014年11月7日送往中國典型培 養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，分類命名：猴胎腎細(xì)胞MARC145/Gal-10,保藏編號(hào)：CCTCC NO: C2014208。地址：中國武漢武漢大學(xué)。
[0022] 它具有以下特征：（1)從形態(tài)上觀察，猴胎腎細(xì)胞MARC145/Gal_10形態(tài)規(guī)則、整 齊，細(xì)胞連接緊密，呈圓形，細(xì)胞折光性強(qiáng)，胞質(zhì)飽滿，核質(zhì)清晰；(2)細(xì)胞易于消化、貼壁和 傳代，最適在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，細(xì)胞倍增時(shí)間為30. 5h ; (3)能高效表 達(dá)雞防御素10,具有較好的抑菌活性，抑菌譜廣泛；(4)細(xì)胞傳代50次以上，仍可以穩(wěn)定遺 傳 Gal-IO基因，穩(wěn)定表達(dá)出雞防御素10。
[0023] 雞防御素10在制備抑菌藥物中的應(yīng)用，包括在制備生物防腐劑，生物抑菌劑中的 應(yīng)用，所述的雞防御素10在作為生物防腐劑或抑菌劑時(shí)，將其涂布在需防腐或抑菌的物體 表面即可還包括用于制備家禽生物藥品中的應(yīng)用，特別是在制備治療雞細(xì)菌感染性疾病藥 物中的應(yīng)用，將其制備成各類具有抑菌作用的劑型，直接用于家禽即可。
[0024] -種雞防御素復(fù)合制劑在在制備抑菌藥物中的應(yīng)用方面中的應(yīng)用，包括在制備生 物防腐劑，生物抑菌劑中的應(yīng)用，所述的復(fù)合制劑在作為生物防腐劑或抑菌劑時(shí)，將其涂布 在需防腐或抑菌的物體表面即可。復(fù)合制劑還包括用于制備家禽生物藥品中的應(yīng)用，特別 是在制備治療雞細(xì)菌感染性疾病藥物中的應(yīng)用，將其制備成各類具有抑菌作用的劑型，直 接用于家禽即可。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)：
[0026] (1)本發(fā)明提供的真核表達(dá)載體PIRES2-EGFP-GAL-10可以表達(dá)重組雞防御素10 和綠色熒光蛋白，其優(yōu)點(diǎn)是可對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果進(jìn)行直觀、及時(shí)的觀察和檢測(cè)；能高效表達(dá)重組雞 防御素10,蛋白獲取方法簡(jiǎn)單，成本低。
[0027] (2)本發(fā)明提供的重組雞防御素10具有顯著的抗菌活性，安全性好，提供了一種 新的雞疾病防治中的抗菌藥物的方法及其在獸用生物制品中的應(yīng)用。
[0028] (3)將本發(fā)明制備雞防御素10和雞防御素8混合后，發(fā)現(xiàn)其抑菌效果明顯比單一 防御素的抑菌效果好。這提示我們可以將兩種甚至多種防御素聯(lián)合起來，生產(chǎn)復(fù)合防御素 制劑，從而提高抗菌活性和擴(kuò)大抗菌譜，達(dá)到更好的抑菌效果，安全性好，從而替代傳統(tǒng)的 抗生素。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1為一種重組表達(dá)質(zhì)粒重組質(zhì)粒PCR鑒定示意圖。
[0030] M，DL2000marker ;1，PIRES2-EGFP-GAL-10 ;2, PIRES2-EGFP-GAL-8。
[0031] 圖2為一種重組表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定示意圖。
[0032] M，DL2000marker ;1，EC0RI 和 BamHI 雙酶切重組質(zhì)粒 PIRES2-EGFP-GAL-8 ; 2, ECORI 和 Bam HI 雙酶切重組質(zhì)粒 PIRES2-EGFP-GAL-10。
[0033] 圖3為一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染雞防御素基因的marcl45細(xì)胞示意圖。
[0034] A，B :未轉(zhuǎn)染的Marc-145細(xì)胞；A' ：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GAL-8基因的marcl45細(xì)胞；B' ：穩(wěn) 定轉(zhuǎn)染GAL-10基因的marcl45細(xì)胞。
[0035] 圖4為一種PIRES2-EGFP-GAL-8重組質(zhì)粒PCR穩(wěn)定性檢測(cè)示意圖。
[0036] M，DL2000marker ;1，連續(xù)培養(yǎng)10代重組質(zhì)粒；2,連續(xù)培養(yǎng)30代重組質(zhì)粒；3,連續(xù) 培養(yǎng)50代重組質(zhì)粒。
[0037] 圖5為一種PIRES2-EGFP-GAL-10重組質(zhì)粒PCR穩(wěn)定性檢測(cè)示意圖
[0038] M，DL2000marker ; 1，連續(xù)培養(yǎng)10代重組質(zhì)粒；2,連續(xù)培養(yǎng)30代重組質(zhì)粒；3,連續(xù) 培養(yǎng)50代重組質(zhì)粒。
[0039] 圖6為一種GAL-8蛋白表達(dá)的Western Blot鑒定示意圖。
[0040] 1，連續(xù)培養(yǎng)10代重組蛋白；2,連續(xù)培養(yǎng)30代重組蛋白；3,連續(xù)培養(yǎng)50代重組蛋 白。
[0041] 圖7為一種GAL-10蛋白表達(dá)的Western Blot鑒定示意圖。
[0042] 1，連續(xù)培養(yǎng)10代重組蛋白；2,連續(xù)培養(yǎng)30代重組蛋白；3,連續(xù)培養(yǎng)50代重組蛋 白。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。在實(shí)施例中涉及的所有培 養(yǎng)基和分子生物學(xué)操作方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本實(shí)驗(yàn)所涉及的分子生物學(xué)方法為 常規(guī)方法，為本領(lǐng)域人員所熟悉。本發(fā)明中未詳細(xì)闡述的請(qǐng)參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》J.薩 姆布魯克，D.W.拉塞爾等主編。
[0044] 實(shí)施例1 :
[0045] 一種能穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素的細(xì)胞系，通過以下步驟篩選得到：
[0046] (1)雞腎組織總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
[0047] 從15日齡的仔雞體內(nèi)采集新鮮的雞腎組織，按照TRIzoL Reagent試劑盒（GIBC0 公司）并按其說明書提取雞組織總RNA。反轉(zhuǎn)錄的cDNA產(chǎn)物用DNase I 37°C處理20min 以去除基因組DNA污染。
[0048] (2)雞防御素8基因的制備：
[0049] 根據(jù)GeneBank中已經(jīng)發(fā)表的雞防御素8基因的序列：GeneBank :NM_001001781. 1 設(shè)計(jì)引物，
[0050] Ρ8-1 :5' CGGAATTCATGAAGATCCTTTACCTTCTCTTGG 3'
[0051] Ρ8-2 :5' CGGGATCCTTAGTCGTACACAGTCCGGCA 3'
[0052] 以步驟（1)中的cDNA為模板進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系為：20ymol/L的引物各lyL， 2.5mmol/L 的 dNTPs 5yL，10Xbuffer 5yL，2.5U/yL 的 rTaq DNA 聚合酶 lyL，加 CldH2O 至50μ L。反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s，56°C退火40s，72°C延伸45s，共30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，得到雞防御素8基因，其序列為SEQ ID NO. 1所示。
[0053] (3)雞防御素10基因的制備：
[0054] 根據(jù)GeneBank中已經(jīng)發(fā)表的雞防御素10基因的序列：NM_001001609. 1，設(shè)計(jì)引 物：
[0055] P10-1 :5, CGGAATTCATGAAGATCCTCTGCCTGC 3，
[0056] P10-2 :5' CGGGATCCTTACTGCGCCGGAATCT 3'。
[0057] 以步驟（1)中的cDNA為模板進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系為：20ymol/L的引物各lyL， 2.5mmol/L 的 dNTPs 5yL，10Xbuffer 5yL，2.5U/yL 的 rTaq DNA 聚合酶 lyL，加 ddH20 至5(^1^。反應(yīng)程序：941：預(yù)變性41^11;941：變性3〇8,561：退火4〇8,721：延伸458，共30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，得到雞防御素10基因，其序列為SEQ ID NO. 2所示。
[0058] (4)真核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0059] 1)真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-GAL-8的構(gòu)建：
[0060] 用限制性內(nèi)切酶EcoR I、BamH I雙酶切載體pIRES2-EGFP和純化的GAL-8PCR產(chǎn) 物。酶切體系如下：
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 一種穩(wěn)定高效表達(dá)雞防御素10的細(xì)胞系，其特征在于：猴胎腎細(xì)胞MARC145/ Gal-10,保藏編號(hào)：CCTCC NO. C2014208。
2. 權(quán)利要求1所述細(xì)胞系表達(dá)的雞防御素10。
3. 權(quán)利要求1所述細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
4. 一種含有權(quán)利要求2所述的雞防御素或權(quán)利要求3所述的細(xì)胞培養(yǎng)上清液的復(fù)合制 劑。
5. -種雞防御素復(fù)合制劑，該制劑包含有雞防御素8和雞防御素10混合制得，所述的 雞防御素8由猴胎腎細(xì)胞MARC145/Gal-8 CCTCC NO. C2014207表達(dá)得到，雞防御素10由 猴胎腎細(xì)胞 MARC145/Gal-10 CCTCC NO. C2014208 表達(dá)得到。
6. 權(quán)利要求1所述的細(xì)胞系或權(quán)利要求2所述的雞防御素10或權(quán)利要求5所述的復(fù) 合制劑在制備抑菌藥物中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為在制備生物防腐劑中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為在制備家禽抗菌生物制品中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為在制備雞細(xì)菌感染性疾病藥物中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】A01P1/00GK104388390SQ201410653521
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】周莉, 譚本忠, 錢運(yùn)國, 高其雙, 陳志華, 彭霞, 盧順, 童偉文, 陶弼菲 申請(qǐng)人:武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所