專利名稱：一種小鼠高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明利用一種新型的乳腺癌細(xì)胞(腹水型)建立了一種高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì) 胞系，屬于動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳腺癌是一種嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤，對(duì)乳腺癌進(jìn)行研究需要建立 便于體內(nèi)研究的乳癌動(dòng)物模型和體外研究的乳癌細(xì)胞系。細(xì)胞系作為體外研究 的媒介，在腫瘤生物學(xué)特性研究中起著至關(guān)重要的作用。高轉(zhuǎn)移乳癌細(xì)胞系的 建立是研究腫瘤轉(zhuǎn)移的重要手段。目前國(guó)內(nèi)保存的乳腺癌細(xì)胞系不下十種，大
部分是人的乳腺癌細(xì)胞系，小鼠乳腺癌細(xì)胞系較少，目前我們常常使用的TA2 小鼠乳腺癌細(xì)胞系(BCS)肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率在80%左右，其他臟器基本不發(fā)生轉(zhuǎn)移。 這使得對(duì)于乳腺癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究變得困難。
為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明建立了一種具有高度轉(zhuǎn)移特性的乳腺癌細(xì)胞系， 該系細(xì)胞具有極高的轉(zhuǎn)移率，不僅能轉(zhuǎn)移到肺臟，而且還能轉(zhuǎn)移至肝臟、脾臟、 腎臟、骨骼等多個(gè)器官。其遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移率達(dá)到了 100%。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所釆用的技術(shù)方案取TA2自發(fā)性乳腺癌小鼠胸腔血，腹腔注射到 正常TA2小鼠腹腔內(nèi)，十五天后，待小鼠腹部膨隆，抽取其腹腔內(nèi)腹水傳代注 射到正常TA2腹腔內(nèi)來(lái)常規(guī)保存腹水瘤細(xì)胞。大約傳代25代以后，做腹水瘤細(xì)
胞的原代培養(yǎng)，建立小鼠高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系。
利用此乳腺癌細(xì)胞系在價(jià)格相對(duì)低廉的小鼠身上進(jìn)行乳腺癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制 的研究，技術(shù)成熟、省時(shí)省力，且節(jié)約資金；獲得的高轉(zhuǎn)移傾向細(xì)胞株可用于 篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物；通過(guò)配對(duì)細(xì)胞的比較，可用于篩選腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和相關(guān)蛋白；可用于研究胂瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)病機(jī)理。


圖1自血循環(huán)抽取瘤細(xì)胞栓子
圖2肝臟和脾臟轉(zhuǎn)移 圖3肺轉(zhuǎn)移灶
具體實(shí)施例方式
第一代腹水型乳腺癌的建立TA2自發(fā)瘤小鼠7只，乙醚麻醉后，在超凈臺(tái) 內(nèi)，75%酒精消毒皮膚，逐層解剖胸腔組織，暴露心臟，用無(wú)菌lml空針(事 先在其內(nèi)吸取0. lml肝素)吸取心臟內(nèi)血液，分別注射到正常TA2雌性小鼠腹 腔，大約三個(gè)月后，3只TA2小鼠腹部明顯膨隆。在超凈臺(tái)內(nèi)，將其斷頸處死， 大頭針固定，75%酒精消毒皮膚，逐層解剖各層組織，發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)有大量腹水， 用無(wú)菌5ml注射器抽取血性腹水，注射到另一只正常TA2小鼠左下肢鼠蹊部， 解剖此小鼠發(fā)現(xiàn)其膈肌組織異常，疑似有轉(zhuǎn)移取其膈肌組織一塊接種另一只正 常TA2左下鼠蹊部。
腹水瘤傳代過(guò)程依次取以下各傳代小鼠的腹腔腹水傳代(操作步驟同上), 以常規(guī)保存瘤細(xì)胞。腹腔肝脾轉(zhuǎn)移灶也依次正常TA2鼠鼷部接種傳代。
腹水內(nèi)腫瘤細(xì)胞原代培養(yǎng)在無(wú)菌操作間內(nèi)，將85%淋巴細(xì)胞分離液 (8. 5mll00。/。淋巴細(xì)胞分離液加入1. 5ml PRMI1640)加入一個(gè)50ml離心管中， 另取一個(gè)50ml離心管，加入10ml淋巴細(xì)胞分離液，將10ml 85%淋巴細(xì)胞分離 液緩慢加入100%淋巴細(xì)胞分離液中，再緩慢加入約5.5ml的小鼠腹水，此時(shí)可 見(jiàn)三層分離的液面，2000轉(zhuǎn)/分，離心20min,離心后可明顯見(jiàn)到分層，最低層是紅細(xì)胞，上一層為白細(xì)胞，在液面的最上段可見(jiàn)一圈明顯的白色細(xì)胞帶，即
為瘤細(xì)胞。將此細(xì)胞帶用吸管吸出加入到含40mlPRMI1640的離心管中，1000轉(zhuǎn) /分,離心10min,離心后棄去上清，另取一50ml離心管，加入15mlPRMI1640, 2ml胎牛血清，0.5ffll雙抗，經(jīng)濾器過(guò)濾到離心后含瘤細(xì)胞的離心管中，吹打， 再將其吸入培養(yǎng)瓶中，C02孵育。
權(quán)利要求
1. 將一只TA2自發(fā)瘤小鼠乙醚麻醉后，解剖胸腔組織，暴露心臟，用無(wú)菌1ml空針自小鼠抽取心臟內(nèi)血液，大約1ml左右，獲取瘤細(xì)胞栓子。將這1ml血液注射到另一只正常TA2雌性小鼠腹腔中，60-90天后該小鼠的腹部明顯膨隆。在超凈臺(tái)內(nèi)，將其斷頸處死，該小鼠腹腔內(nèi)有大量腹水(約10ml左右)，腹壁具有粟粒大小的結(jié)節(jié)，抽取血性腹水接種到一只正常TA2小鼠腹腔內(nèi)進(jìn)行保重傳代。打開(kāi)腹腔以后小鼠腹腔內(nèi)有明顯的腹水，小鼠的肝臟和脾臟出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶。經(jīng)過(guò)大約25次左右的傳代，目前建立的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系HMBC腫瘤傳代成功率達(dá)100％，肺臟、肝臟、脾臟、腸系膜和腎臟等轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)率達(dá)100％，腹水產(chǎn)生率100％。該瘤株的保存在正常TA2小鼠腹腔內(nèi)傳代即可，用無(wú)菌1ml空針抽取其腹腔內(nèi)腹水，注射到一只正常TA2小鼠的腹腔內(nèi)(約注射0.1ml)即可。目前該瘤株已經(jīng)傳代了28次。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系建立方法，自血循環(huán)中抽取瘤細(xì) 胞栓子重新接種成瘤，目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)使用該方法建立腫瘤細(xì)胞系的文獻(xiàn)報(bào)道。 小鼠腹水瘤制作模型成功一方面可能同循環(huán)血中是否具有腫瘤栓子有關(guān)，另一 方面可能同抽取循環(huán)血的量有關(guān)。才艮據(jù)權(quán)力要求1所述的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系 建立方法，高轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞系建立成功幾率極高。整體操作筒便，對(duì)操作環(huán)境 要求較低，所使用的耗材較少，整體操作經(jīng)濟(jì)便宜，肺瘤傳代較為方便。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系建立方法，經(jīng)過(guò)大約25次左右 的傳代，目前建立的高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系HMBC腫瘤傳代成功率達(dá)100M,肺臟、 肝臟、脾臟、腸系膜和腎臟等轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)率達(dá)100%，腹水產(chǎn)生率100%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的常規(guī)瘤細(xì)胞保種方法，其特征是腹水傳代時(shí)為腹腔接 種，注射手法要正確，確保腹水注射到小鼠腹腔內(nèi)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的常規(guī)瘤細(xì)施保種方法，其特征是傳代小鼠要密切關(guān)注其腹水生長(zhǎng)情況，否則會(huì)因腹水生長(zhǎng)迅速而使小鼠死亡。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種小鼠高轉(zhuǎn)移乳腺癌細(xì)胞系及其建立方法。采用TA2小鼠自發(fā)性乳腺癌細(xì)胞作為源細(xì)胞，提取TA2自發(fā)瘤小鼠血循環(huán)內(nèi)高轉(zhuǎn)移的瘤細(xì)胞栓子，接種到正常小鼠腹腔內(nèi)，再經(jīng)過(guò)25代左右的傳代，篩選出的具有高度轉(zhuǎn)移特性的乳腺癌細(xì)胞系。該系細(xì)胞具有極高的轉(zhuǎn)移率，不僅能轉(zhuǎn)移到肺臟，而且還能轉(zhuǎn)移至肝臟、脾臟、腎臟、骨骼等多個(gè)器官。其遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移率達(dá)到了100％。
文檔編號(hào)C12N5/09GK101412986SQ200710059939
公開(kāi)日2009年4月22日 申請(qǐng)日期2007年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月19日
發(fā)明者孫保存, 張丹芳, 張?jiān)娢? 巖 李, 趙秀蘭 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院