一種魚類腦組織總rna的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種魚類腦組織總RNA的提取方法，具體為：將魚類腦組織經(jīng)液氮速凍，Trizol裂解液處理后低溫高速離心，經(jīng)硫酸銨、氯仿-正丁醇萃取后，加入異丙醇-醋酸鈉混合，混合液經(jīng)RNA純化吸附柱吸附純化后，進行DNA酶處理，經(jīng)洗滌而獲得魚類腦組織總RNA。本發(fā)明所述提取方法，可避免魚腦組織中的脂類（磷脂、糖脂和膽固醇）和蛋白質(zhì)等對RNA提取的影響，獲得純度穩(wěn)定、完整性好、重復性高、無污染的RNA分離純化方法。
【專利說明】一種魚類腦組織總RNA的提取方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及魚類總RNA的提取，具體地說，涉及一種魚類腦組織總RNA的提取方 法。

【背景技術】
[0002] 總RNA分離純化技術是分子生物學研究技術的基礎，從組織中提取純度穩(wěn)定、完 整性好、重復性高、無污染的總RNA的分離純化方法，是決定后續(xù)實驗結(jié)果質(zhì)量的關鍵，一 些特定的部位使用通用的RNA分離純化方法，往往不能滿足要求，需要相應的處理與提取 制備方法。
[0003] 魚類腦組織結(jié)構(gòu)類型基本相同，不同種類成分含量上略有差異，但大體上相近，主 要成分是脂類（磷脂、糖脂、膽固醇）和蛋白質(zhì)，采用常規(guī)RNA分離純化方法，在抽提的過程 中脂類不易去除，且易形成蛋白污染，魚腦組織單位細胞RNA含量相對較少，采樣和操作過 程中極易造成RNA降解而使提取失敗。諸多問題，使魚類腦組織總RNA難以穩(wěn)定的分離和 純化。
[0004] 目前，有針對性的分離純化魚腦組織總RNA的方法較少，用傳統(tǒng)方法提取的魚腦 組織總RNA含量少、穩(wěn)定性差、容易污染，無法滿足后續(xù)實驗的要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種適用于魚類腦組織總 RNA的提取方法。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0007] -種魚類腦組織總RNA的提取方法，具體為：將魚類腦組織經(jīng)液氮速凍，Trizol裂 解液處理后低溫高速離心，經(jīng)硫酸銨、氯仿-正丁醇萃取后，加入異丙醇-醋酸鈉混合，混合 液經(jīng)RNA純化吸附柱吸附純化后，進行DNA酶處理，經(jīng)洗滌而獲得魚類腦組織總RNA。
[0008] 進一步地，所述Trizol裂解液使用前加入β -巰基乙醇和/或8-羥基喹啉，使其 在所述Trizol裂解液中的體積濃度分別為1. 0-2. 5%和0. 10-0. 15%。由于Trizol裂解 液本身含有〇. 10%的8-羥基喹啉，因此也可不再加入8-羥基喹啉。但為了更好的抑制內(nèi) 源RNA酶活性，減少RNA的降解，還可有效的排除核蛋白、色素等物質(zhì)的干擾，在Trizol裂 解液使用前加入〇. 05% 8-羥基喹啉，使其在Trizol裂解液中的體積濃度達到0. 15%。
[0009] 進一步地，所述氯仿-正丁醇混合液使用量為1/4 Trizol體積。
[0010] 進一步地，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿與正丁醇的體積比為24:1。
[0011] 作為優(yōu)選，所述硫酸銨的使用濃度為4mol/L。，
[0012] 進一步地，經(jīng)異丙醇-醋酸鈉沉淀時，異丙醇與醋酸鈉的體積比為4:1。
[0013] 進一步地，所述吸附純化具體為：將混合有異丙醇-醋酸鈉的混合液加入RNA純化 吸附柱，離心后經(jīng)乙醇離心洗脫除雜，再經(jīng)RNase-free水離心洗脫得到純化后的RNA溶液。
[0014] 進一步地，DNA酶處理后，對DNA酶進行滅活。
[0015] 進一步地，所述提取方法具體包括以下步驟：
[0016] 1)取魚腦組織，無菌RNase-free水清洗后放入液氮中速凍，超低溫凍存；
[0017] 2)將凍存樣本轉(zhuǎn)入含有Trizol裂解液的RNase-free EP管中，勻漿后置于冰中， 超聲破碎，離心，取上清；
[0018] 3)加入硫酸銨溶液，振蕩搖勻，離心，取上清；
[0019] 4)加入氯仿和正丁醇混合液，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置，離心，取 上清；
[0020] 5)加入與步驟4)混合液等體積的異丙醇-醋酸鈉混合液，振蕩搖勻；
[0021] 6)吸取步驟5)得到的混合液至RNA純化吸附柱中吸附，離心，棄廢液；
[0022] 7)向純化吸附柱中加入預冷的乙醇，離心，棄廢液；重復一次；
[0023] 8)再次離心除雜棄廢物后，將吸附柱晾干；
[0024] 9)向吸附柱中加入RNase-free水,離心，棄吸附柱；
[0025] 10)力卩入 RNase-free DNase 緩沖液、RNase-free DNA 酶、RNA 酶抑制劑和 RNase-free水，處理40_50min，得到DNA酶處理液；
[0026] 11)加入乙二胺四乙酸加熱處理，隨后依次加入RNase-free水、醋酸鈉和預冷的 無水乙醇,混勻后放置15-25min,離心,棄上清；
[0027] 12)用預冷的乙醇洗滌沉淀，離心，棄上清，室溫封閉靜置5-10min，晾干，加入 RNase-free水或0· 5%的SDS溶液充分溶解，-80°C保存。
[0028] 更進一步地，所述提取方法具體包括以下步驟：
[0029] 1)用手術工具取60_80mg魚腦組織，無菌RNase-free水清洗后迅速放入液氮中速 凍，_80°C超低溫凍存；
[0030] 2)將凍存樣本迅速轉(zhuǎn)入含有Iml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用 RNase-free電動勻漿器勻漿，將EP管放置于冰中，超聲破碎8-10s，間隔15-20s，超聲破碎 8-10s，17000-19000g 4°C離心 lOmin，取上清；
[0031] 3)加入500μ I 4mol/L硫酸銨溶液，振蕩搖勻，5000-7000g 4°C離心3-5min，吸上 清液至離心管B中；所述硫酸銨溶液的pH = 5. 5 ;
[0032] 4)加入氯仿和正丁醇混合液350_400μ 1，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜 置5min，12000g 4°C離心lOmin，取上清；所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿與正丁醇的體積 比為24:1 ;
[0033] 5)加入與步驟4)混合液等體積的異丙醇-醋酸鈉混合液，振蕩搖勻-20°C放置 60min;所述異丙醇-醋酸鈉混合液中異丙醇與醋酸鈉的體積比為4:1，醋酸鈉濃度2mol/L， 所述醋酸鈉溶液的pH = 5. 2 ;
[0034] 6)吸取步驟5)得到的混合液700 μ 1至RNA純化吸附柱中，12000g4°C離心lmin， 倒掉收集管中廢液；
[0035] 7)向純化吸附柱中加入500 μ I RNase-free 75 %的已預冷乙醇，靜置Imin, 12000g 4°C離心lmin，倒掉收集管中廢液；重復一次；
[0036] 8) 12000g 4°C離心2min，將吸附柱置于潔凈RNase-free離心管中，室溫封閉靜置 5-lOmin,瞭干；
[0037] 9)向吸附柱中加入20-22 μ L RNase-free水，室溫封閉靜置2min，12000g 4°C離 心lmin，棄吸附柱；
[0038] 10)加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 緩沖液、2 μ 1 的 RNase-free DNA 酶、1 μ 1 的 RNA酶抑制劑和22 μ I RNase-free水，37°C處理40-50min，得到DNA酶處理液；
[0039] 11)加入2. 5 μ 1濃度為0· 5mol/L乙二胺四乙酸，混勻78-82°C加熱處理3min，隨 后依次加入RNase-free水47. 5 μ 1、10 μ 1濃度為3. 5mol/L醋酸鈉和250 μ 1已預冷的無 水乙醇，混勻后-80°C放置15-25min，12000g 4°C離心lOmin，棄上清；
[0040] 12)用75%已預冷的乙醇洗滌沉淀，12000g 4°C離心5min，棄上清，室溫封閉靜置 5-10min，晾干，加入RNase-free水或0· 5%的SDS溶液20-30 μ 1充分溶解，-80°C保存。
[0041] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0042] 本發(fā)明提供一種魚類腦組織總RNA的提取方法，可避免魚腦組織中的脂類（磷脂、 糖脂和膽固醇）和蛋白質(zhì)等對RNA提取的影響，獲得純度穩(wěn)定、完整性好、重復性高、無污染 的RNA分離純化方法。
[0043] 本發(fā)明通過在Trizol中加入2.5%的β-巰基乙醇和0.05%的8-羥基喹啉，可 在裂解過程中有效抑制內(nèi)源RNA酶活性，減少RNA的降解，還可有效的排除核蛋白、色素等 物質(zhì)的干擾。Trizol中加入β -巰基乙醇和8-羥基喹啉，用來抑制RNA酶活性，本申請根 據(jù)實驗發(fā)現(xiàn)，在處理富含RNA酶的組織時，Trizol加入2. 5%的β -巰基乙醇和0. 05%的 8-羥基喹啉協(xié)同作用效果最好，可有效的抑制內(nèi)源性RNA酶，并有效排除核蛋白和色素等 的干擾。
[0044] 本發(fā)明將冷凍樣本在Trizol中勻漿后，使用超聲破碎進行處理，能夠更好的裂解 細胞，使RNA充分游離到液相中。液氮研磨法破碎樣本，由于液氮極易揮發(fā)，研磨過程中要 不斷的向研缽中加入液氮，耗費時間長，操作不方便，有安全隱患，而對凍存樣本進行電動 勻漿，勻漿后再使用超聲破碎，細胞破碎速度快，勻漿徹底，操作簡單安全，縮短了處理時 間，有效減少RNA的降解。
[0045] 本發(fā)明在Trizol裂解液處理后，將離心力增加至17000-19000g，可有效沉降破碎 細胞壁、雜質(zhì)等。
[0046] 本發(fā)明在Trizol處理液中加入4mol/L硫酸銨，可使蛋白脫水沉淀，有效去除提取 過程中的蛋白污染。針對組織中蛋白含量較高，加入硫酸銨沉淀蛋白一次，硫酸銨沉淀蛋白 的效率一般大于85%，降低蛋白對后續(xù)實驗的影響，再進行氯仿正丁醇抽提，可以充分去除 蛋白。
[0047] 本發(fā)明使用氯仿與正丁醇混合液（24:1)，可提高蛋白、DNA和RNA的分離效果，保 證RNA的純度和完整性。常規(guī)提取過程中，抽提時使用氯仿或氯仿異戊醇混合物，使用量約 為1/5 Trizol體積，改用氯仿與正丁醇混合物，比例為24:1，使用量增加至1/4體積可以有 效提高處理效率，利于水相、蛋白相和有機相的分離，且異戊醇的毒性較大，改用正丁醇可 降低毒性，保護操作人員。
[0048] 本發(fā)明將常規(guī)方法中的異丙醇沉淀步驟改為使用異丙醇-醋酸鈉混合液（異丙 醇：醋酸鈉=4:1)沉淀，處理條件為-20°C放置60min，，沉淀RNA。在加入異丙醇同時加 入醋酸鈉，沉淀RNA的同時溶解多糖類物質(zhì)，使它們有效分離。醋酸鈉等高鹽溶液可在提 取過程中加入，用于去除多糖和析出RNA，一般加入的體積為10%，濃度一般為3mol/L(終 濃度0. 3mol/L)，處理條件一般為-20°C放置3小時，本申請根據(jù)實驗發(fā)現(xiàn)在加入異丙醇階 段，醋酸鈉加入量增加至20%且濃度降低至2111〇1/1(終濃度0.4111〇1/1)，處理條件為-201： 放置60min，可提高沉淀并溶解多糖類物質(zhì)的效率，而DNA酶處理階段醋酸鈉濃度也增加至 3. 5mol/L，可有效析出RNA。
[0049] 本發(fā)明使用RNA純化吸附柱進行吸附和洗脫，可有效縮短提取時間，有效減少RNA 的降解。
[0050] 本發(fā)明利用純化吸附柱處理混合液，RNA容易富集于吸附膜上，可有效的提高總 RNA產(chǎn)量。傳統(tǒng)方法中，異丙醇處理，離心后的沉淀為總RNA，本發(fā)明將異丙醇-醋酸鈉處理 液加入純化吸附柱，離心后，RNA富集于吸附膜上，而殘留的蛋白和脂肪等被有效的分離，從 而達到純化RNA的目的，同時提高了產(chǎn)量，且使用吸附柱時間短，可減少RNA的降解。
[0051] 本發(fā)明采用75%乙醇清洗吸附膜，并在洗脫過程中將離心力增加至12000g，可提 高清洗效果，有效去除殘留的蛋白和脂肪。
[0052] 本發(fā)明引入DNA酶處理步驟，在DNA處理前，已經(jīng)通過氯仿正丁醇分離，可去掉部 分DNA片段，但并不徹底，加入DNA酶處理步驟，將消化時間延長至40-50min，可提高DNA酶 處理效率，更徹底的去除基因組DNA污染。DNA酶的失活使用78-82°C熱處理3min，使DNA 酶失活更加徹底，利于后續(xù)的分離與純化，相對于氯仿抽提法，縮短了處理時間，有效減少 RNA在純化中的降解。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0053] 圖1為本發(fā)明所述方法提取的魚類腦組織總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0054] 圖2為本發(fā)明所述方法提取的魚類腦組織總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，對β -actin基因進 行PCR擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0055] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0056] 實施例1
[0057] 1.用手術工具取60mg魚腦組織，無菌RNase-free (無 RNA酶）水清洗后迅速放入 液氮中速凍，超低溫（_80°C )凍存。
[0058] 2.將凍存樣本迅速轉(zhuǎn)入含有Iml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用 RNase-free電動勻漿器勻漿，將EP管放置于冰中，超聲破碎8s，間隔15s，超聲破碎8s， 17000g 4°C離心lOmin，吸上清至離心管A中。
[0059] 注：Trizol裂解液（TRIzol的主要成分是苯酚，還包含異硫氰酸胍、十二烷基肌氨 酸鈉、醋酸鈉等，Life technologies公司），Trizol裂解液使用前加入25 μ 1 β -巰基乙醇 和0. 5 μ 1的8-羥基喹啉。
[0060] 3.向離心管A中加入500μ I 4mol/L硫酸銨（ΡΗ5. 5)，振蕩搖勻，5000g 4°C離心 3min，吸上清液至離心管B中。
[0061] 4.向離心管B中加入氯仿和正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=24:1) 350μ 1 (混合 液體積的1/4)，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置5min，12000g 4°C離心lOmin，吸 取上清液至離心管C中。
[0062] 5.向離心管C中加入上清等體積的異丙醇醋酸鈉混合液（異丙醇：醋酸鈉=4:1， 醋酸鈉濃度2mol/L)，振蕩搖勻-20°C放置60min。
[0063] 6.吸取混合液700 μ 1至RNA純化吸附柱中（EZ-10 Spin Column總RNA純化吸附 柱，吸附柱置于廢液收集管中，B. B. I公司），12000g4°C離心lmin，倒掉收集管中廢液。
[0064] 7.向純化吸附柱中加入500 μ I RNase-free 75 %的已預冷乙醇，靜置Imin, 12000g 4°C離心lmin，倒掉收集管中廢液。
[0065] 8.重復上述步驟，向純化吸附柱中加入500 μ I RNase-free 75%的已預冷乙醇， 靜置lmin，12000g 4°C離心lmin，倒掉收集管中廢液。
[0066] 9. 12000g 4°C離心2min，將吸附柱置于RNase-free離心管D中，室溫封閉靜置 5-lOmin,瞭干。
[0067] 10.向吸附柱中加入2(^1^8似86-仕66水，室溫封閉靜置211^11，1200(^41：離心 lmin，棄吸附柱。
[0068] 11.向離心管 D 中加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 緩沖液（IOXDNase I Buffer， 寶生物公司）、2μ 1 的 RNase-free DNA 酶（5υ/μ I RNase-free Recombinant DNase I，寶 生物公司）、1 μ I的RNA酶抑制劑（40U/μ I Recombinant RNase Inhibitor，寶生物公司） 和 22 μ I RNase-free 水，37°C處理 40-50min，得到 DNA 酶處理液。
[0069] 12.向DNA酶處理液中加入2. 5 μ 1濃度為0. 5 mol/L EDTA，混勻78°C加熱處理 3min，隨后依次加入 RNase-free 水 47. 5 μ 1、10 μ 1 濃度為 3. 5mol/L RNase-free 醋酸納和 250μ 1已預冷的無水乙醇，混勻后-80°C放置15-25min，12000g 4°C離心10min，棄上清。
[0070] 13.用75%已預冷的乙醇洗滌沉淀，12000g 4°C離心10min，棄上清，室溫封閉靜 置5min，晾干，加入RNase-free水或0· 5%的SDS溶液20 μ 1充分溶解，-80°C保存。
[0071] 實施例2
[0072] 1.用手術工具取80mg魚腦組織，無菌RNase-free (無 RNA酶）水清洗后迅速放入 液氮中速凍，超低溫（_80°C )凍存。
[0073] 2.將凍存樣本迅速轉(zhuǎn)入含有Iml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用 RNase-free電動勻漿器勻漿，將EP管放置于冰中，超聲破碎10s，間隔20s，超聲破碎10s， 19000g 4°C離心10min，吸上清至離心管A中。
[0074] 注：Trizol裂解液（TRIzol的主要成分是苯酚，還包含異硫氰酸胍、十二烷基肌氨 酸鈉、醋酸鈉等，Life technologies公司），Trizol裂解液使用前加入25 μ 1 β -巰基乙醇 和0. 5 μ 1的8-羥基喹啉。
[0075] 3.向離心管A中加入500μ I 4mol/L硫酸銨（ΡΗ5. 5)，振蕩搖勻，7000g 4°C離心 5min，吸上清液至離心管B中。
[0076] 4.向離心管B中加入氯仿和正丁醇混合液（氯仿：正丁醇=24:1)400 μ 1 (混合 液體積的1/4)，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置5min，12000g 4°C離心10min，吸 取上清液至離心管C中。
[0077] 5.向離心管C中加入上清等體積的異丙醇醋酸鈉混合液（異丙醇：醋酸鈉=4:1， 醋酸鈉濃度2mol/L)，振蕩搖勻-20°C放置60min。
[0078] 6.吸取混合液700 μ 1至RNA純化吸附柱中（EZ-10 Spin Column總RNA純化吸附 柱，吸附柱置于廢液收集管中，B. B. I公司），12000g4°C離心lmin，倒掉收集管中廢液。
[0079] 7.向純化吸附柱中加入500 μ I RNase-free 75 %的已預冷乙醇，靜置Imin, 12000g 4°C離心lmin，倒掉收集管中廢液。
[0080] 8.重復上述步驟，向純化吸附柱中加入500 μ I RNase-free 75%的已預冷乙醇， 靜置lmin，12000g 4°C離心lmin，倒掉收集管中廢液。
[0081] 9. 12000g 4°C離心2min，將吸附柱置于RNase-free離心管D中，室溫封閉靜置 IOmin,瞭干。
[0082] 10.向吸附柱中加入22 4 1^尺似86-仕66水，室溫封閉靜置21^11，1200(^41：離心 lmin，棄吸附柱。
[0083] 11.向離心管 D 中加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 緩沖液（IOXDNase I Buffer， 寶生物公司）、2μ 1 的 RNase-free DNA 酶（5υ/μ I RNase-free Recombinant DNase I，寶 生物公司）、I μ I的RNA酶抑制劑（40U/ μ I Recombinant RNase Inhibitor，寶生物公司） 和 22 μ I RNase-free 水，37°C處理 40-50min，得到 DNA 酶處理液。
[0084] 12.向DNA酶處理液中加入2. 5 μ 1濃度為0. 5 mol/L EDTA，混勻82°C加熱處理 3min，隨后依次加入 RNase-free 水 47. 5 μ 1、10 μ 1 濃度為 3. 5mol/L RNase-free 醋酸納和 250μ 1已預冷的無水乙醇，混勻后-80°C放置15-25min，12000g 4°C離心10min，棄上清。
[0085] 13.用75%已預冷的乙醇洗滌沉淀，12000g 4°C離心10min，棄上清，室溫封閉靜 置10min，晾干，加入RNase-free水或0· 5%的SDS溶液30 μ 1充分溶解，-80°C保存。
[0086] 本發(fā)明提取并純化獲得的魚腦組織總RNA的瓊脂糖凝膠電泳如圖1所示，28s條帶 亮度是18s亮度的二倍，同時測得的魚腦總RNA濃度為200-300ng/μ 1，同時吸光度0D260/ 0D280的比值穩(wěn)定在1. 8-2. 0之間，說明獲得的總RNA純度高、完整性佳、無 DNA和蛋白污 染。
[0087] 本發(fā)明提取后的魚腦組織總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，對β-actin基因進行了 PCR擴增， 瓊脂糖電泳凝膠檢測結(jié)果如圖2 :電泳條帶完整、清晰、特異性好，說明此總RNA能滿足后續(xù) 的RT-PCR、Real Time RT-PCR、Northern blot、體外翻譯和分子克隆等多種下游實驗。 [0088] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【權利要求】
1. 一種魚類腦組織總RNA的提取方法，其特征在于，將魚類腦組織經(jīng)液氮速凍，Trizol 裂解液處理后低溫高速離心，經(jīng)硫酸銨、氯仿-正丁醇萃取后，加入異丙醇-醋酸鈉混合，混 合液經(jīng)RNA純化吸附柱吸附純化后，進行DNA酶處理，經(jīng)洗滌而獲得魚類腦組織總RNA。
2. 根據(jù)權利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述Trizol裂解液使用前加入 β -巰基乙醇和8-羥基喹啉，使其在所述Trizol裂解液中的體積濃度分別為1. 0-2. 5%和 0· 10-0. 15%。
3. 根據(jù)權利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿-正丁醇混合液使用量為 1/4 Trizol 體積。
4. 根據(jù)權利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述氯仿-正丁醇混合液中氯仿與正 丁醇的體積比為24:1。
5. 根據(jù)權利要求1-4任一項所述的提取方法，其特征在于，所述硫酸銨的使用濃度為 4mol/L〇
6. 根據(jù)權利要求5所述的提取方法，其特征在于，經(jīng)異丙醇-醋酸鈉沉淀時，異丙醇與 醋酸鈉的體積比為4:1。
7. 根據(jù)權利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述吸附純化為：將混合有異丙 醇-醋酸鈉的混合液加入RNA純化吸附柱，離心后經(jīng)乙醇離心洗脫除雜，再經(jīng)RNase-free 水離心洗脫得到純化后的RNA溶液。
8. 根據(jù)權利要求5所述的提取方法，其特征在于，DNA酶處理后，對DNA酶進行滅活。
9. 根據(jù)權利要求5所述的提取方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 取魚腦組織，無菌RNase-free水清洗后放入液氮中速凍，超低溫凍存； 2) 將凍存樣本轉(zhuǎn)入含有Trizol裂解液的RNase-free EP管中，勻漿后置于冰中，超聲 破碎，離心，取上清； 3) 加入硫酸銨溶液，振蕩搖勻，離心，取上清； 4) 加入氯仿和正丁醇混合液，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置，離心，取上 清； 5) 加入與步驟4)混合液等體積的異丙醇-醋酸鈉混合液，振蕩搖勻； 6) 吸取步驟5)得到的混合液至RNA純化吸附柱中吸附，離心，棄廢液； 7) 向純化吸附柱中加入預冷的乙醇，離心，棄廢液；重復一次； 8) 再次離心除雜棄廢物后，將吸附柱晾干； 9) 向吸附柱中加入RNase-free 7jC，離心，棄吸附柱； 10) 加入 RNase-free DNase 緩沖液、RNase-free DNA 酶、RNA 酶抑制劑和 RNase-free 水，處理40-50min，得到DNA酶處理液； 11) 加入乙二胺四乙酸加熱處理，隨后依次加入RNase-free水、醋酸鈉和預冷的無水 乙醇，混勻后放置15-25min，離心，棄上清； 12) 用預冷的乙醇洗滌沉淀，離心，棄上清，室溫封閉靜置5-10min，晾干，加入 RNase-free水或0· 5%的SDS溶液充分溶解，-80°C保存。
10. 根據(jù)權利要求5所述的提取方法，其特征在于，包括以下步驟： 1)用手術工具取60_80mg魚腦組織，無菌RNase-free水清洗后迅速放入液氮中速 凍，-80°C超低溫凍存； 2) 將凍存樣本迅速轉(zhuǎn)入含有Iml Trizol裂解液的RNase-free EP管中，使用 RNase-free電動勻漿器勻漿，將EP管放置于冰中，超聲破碎8-10s，間隔15-20s，超聲破碎 8-10s，17000-19000g 4°C離心 lOmin，取上清； 3) 加入500μ1 4mol/L硫酸銨溶液，振蕩搖勻，5000-7000g 4°C離心3-5min，吸上清液 至離心管B中；所述硫酸銨溶液的pH = 5. 5 ; 4) 加入氯仿和正丁醇混合液350-400μ 1，振蕩搖勻至均勻的乳白狀絮狀，室溫靜置 5min，12000g 4°C離心lOmin，取上清；所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿與正丁醇的體積比 為 24:1 ; 5) 加入與步驟4)混合液等體積的異丙醇-醋酸鈉混合液，振蕩搖勻-20°C放置60min ; 所述異丙醇-醋酸鈉混合液中異丙醇與醋酸鈉的體積比為4:1，醋酸鈉濃度2mol/L，所述醋 酸鈉溶液的pH = 5. 2 ; 6) 吸取步驟5)得到的混合液700μ 1至RNA純化吸附柱中，12000g4°C離心lmin，倒掉 收集管中廢液； 7) 向純化吸附柱中加入500μ1 RNase-free 75%的已預冷乙醇，靜置lmin，12000g 4°C離心lmin，倒掉收集管中廢液；重復一次； 8) 12000g 4°C離心2min，將吸附柱置于潔凈RNase-free離心管中，室溫封閉靜置 5-lOmin,瞭干； 9) 向吸附柱中加入20-22以1^尺似86-仕66水，室溫封閉靜置21^11，1200(^41：離心 lmin，棄吸附柱； 10) 加入 5 μ 1 的 RNase-free DNase 緩沖液、2 μ 1 的 RNase-free DNA 酶、1 μ 1 的 RNA 酶抑制劑和22 μ I RNase-free水，37°C處理40-50min，得到DNA酶處理液； 11) 加入2. 5 μ 1濃度為0· 5mol/L乙二胺四乙酸，混勻78-82°C加熱處理3min，隨后依 次加入RNase-free水47. 5 μ 1、10 μ 1濃度為3. 5mol/L醋酸鈉和250 μ 1已預冷的無水乙 醇，混勻后_80°C放置15-25min，12000g 4°C離心lOmin，棄上清； 12) 用75%已預冷的乙醇洗滌沉淀，12000g 4°C離心5min，棄上清，室溫封閉靜置 5-10min，晾干，加入RNase-free水或0· 5%的SDS溶液20-30 μ 1充分溶解，-80°C保存。
【文檔編號】C12N15/10GK104212795SQ201410503432
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月26日 優(yōu)先權日:2014年9月26日
【發(fā)明者】楊曉飛, 徐紹剛, 李文通, 袁丁, 楊貴強, 馬峻峰 申請人:北京市水產(chǎn)科學研究所