檢測5-httlpr片段多態(tài)性的方法和引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測5-HTTLPR片段多態(tài)性的方法和引物，包括擴(kuò)增5-HTTLPR片段的正、反向引物,其堿基序列為：HTTLPR-F：5’-CAGCACCTAACCCCTAATGT-3’；LPR-R：5’-GCCGGTTGGGCTAGCGTCTA-3’。將PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳顯帶相結(jié)合，可快速、簡單和低成本地檢測與強(qiáng)迫癥相關(guān)聯(lián)的5-HTTLPR片段多態(tài)性。
【專利說明】檢測5-HTTLPR片段多態(tài)性的方法和引物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及檢測5-HTTLPR片段多態(tài)性的方法 和引物。

【背景技術(shù)】
[0002] 強(qiáng)迫癥是一種異質(zhì)性高、病因復(fù)雜的精神障礙，國內(nèi)外對其病因?qū)W的研究至今仍 無定論，不少學(xué)者致力于遺傳學(xué)、精神應(yīng)激與環(huán)境、神經(jīng)內(nèi)分泌以及突觸可塑性方面的研 究，其中遺傳因素起到了重要作用。
[0003] 關(guān)于強(qiáng)迫癥遺傳學(xué)方面的研究結(jié)果也不盡相同，其中研究最多的就是5-HTTLPR 片段多態(tài)性與強(qiáng)迫癥的相關(guān)性。5-HTTLPR是5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體基因連鎖多態(tài)性區(qū)域 (serotonin transporter gene-linked polymorphic region)的簡稱。5-HTTLPR 片段 的多態(tài)性是5-輕色胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（serotonin transporter, 5-HTT)基因的常見多態(tài)性之一。 5-HTTLPR位于5-HTT基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游大約lkb處的啟動(dòng)子區(qū)，為富含GC的20?30bp 重復(fù)元件的重復(fù)序列。5-HTTLPR片段存在44bp片段插入缺失多態(tài)性，影響著5-HTT基因的 轉(zhuǎn)錄活性。5-HTTLPR片段的多態(tài)性產(chǎn)生長片段（L)等位基因和短片段（S)等位基因。L等 位基因的轉(zhuǎn)錄活性比S等位基因高2. 5倍。5-HTTLPR可能通過影響5-HTT基因的轉(zhuǎn)錄活性 和5-HTT蛋白的功能而影響5-羥色胺（serotonin，5-HT)的再攝取速率，使5-HT的功能有 所改變。
[0004] 迄今為止，探討5-HTTLPR片段多態(tài)性和強(qiáng)迫癥之間關(guān)聯(lián)性的研究，存在許多矛 盾之處，周云飛等在漢族人群中對61例強(qiáng)迫癥患者與68名相匹配的正常人進(jìn)行研究，結(jié) 果顯示5-HTTLPR片段多態(tài)性的基因型與對照組差異無顯著性，而L等位基因與強(qiáng)迫癥呈 正相關(guān)，使其患強(qiáng)迫癥的危險(xiǎn)性提高了 1.929倍，是強(qiáng)迫癥的危險(xiǎn)因子。王振等研究認(rèn)為 5-HTILPR與強(qiáng)迫癥無相關(guān)性。Ramoz等通過對352個(gè)家庭的大型隊(duì)列研究，認(rèn)為5-HTTLPR 變異體沒有參與強(qiáng)迫癥。而Baca-Garcia等所做的研究認(rèn)為5-HTTLPR的多態(tài)性中L等 位基因與強(qiáng)迫癥的發(fā)生有關(guān)，McDougle等研究也顯示5-HTTLPR多態(tài)性的L等位基因與 強(qiáng)迫癥呈正相關(guān)，而與選擇性5-輕色胺再攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitors, SSRIs)的療效呈負(fù)相關(guān)。Bengel等則認(rèn)為，強(qiáng)迫癥與5-HTTLPR基因型LL呈 顯著性相關(guān)。另有研究結(jié)果顯示強(qiáng)迫癥患者基因型與等位基因頻率與對照組均有差異，強(qiáng) 迫癥患者LL基因型與非LL基因型的比值比為1.086,說明LL基因型使強(qiáng)迫癥的患病風(fēng)險(xiǎn) 增加了 1.086倍，這與Bengel等的研究一致。在強(qiáng)迫癥患者中，LL基因型的耶魯布朗強(qiáng)迫 量表（Yale-Brown Obsessive Compulsive Scale，YB0CS)分值明顯高于 LS 型與 SS 型，說 明LL基因型與強(qiáng)迫癥的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。
[0005] 許多強(qiáng)迫癥患者常有家族史，甚至他們的父親和/或母親同樣是強(qiáng)迫癥患者，眾 所周知，家庭是社會(huì)支持系統(tǒng)的重要組成部分，這與許多研究結(jié)果一致。已有研究發(fā)現(xiàn)，父 母離異是強(qiáng)迫癥患者的危險(xiǎn)因素，與強(qiáng)迫癥發(fā)病呈負(fù)相關(guān)，然而寇長貴認(rèn)為是否是單親家 庭與強(qiáng)迫癥等神經(jīng)癥的發(fā)病無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，可能與所選對象不同有關(guān)。
[0006] 由于強(qiáng)迫癥的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，遺傳因素在強(qiáng)迫癥的發(fā)病機(jī)制中占有多大比例， 是否與社會(huì)環(huán)境因素相互作用等一系列問題，都需進(jìn)一步研究。
[0007] 目前針對5-HTTLPR多態(tài)性的檢測普遍采用的是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長 度多態(tài)性（PCR-RFLP)法和測序法。RFLP法用PCR擴(kuò)增目的DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物再用特異性內(nèi)切 酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點(diǎn)分 布不同，產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。該方法簡便，結(jié)果容易判定，但是也同時(shí)存在諸多 弊端，①靶片段的擴(kuò)增產(chǎn)物要純，如在非特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物（特別是大片段可能含有限制 性酶切位點(diǎn)）存在下，靶片段的擴(kuò)增產(chǎn)物可能會(huì)發(fā)生不完全酶切或酶切后出現(xiàn)雜帶；②酶 切過程要充分（即底物與酶的比例要合適，消化時(shí)間要保證），才能避免假陰性結(jié)果產(chǎn)生； ③酶切陽性結(jié)果可以確定所檢測的具體序列，陰性結(jié)果僅可說明靶片段的擴(kuò)增產(chǎn)物是非內(nèi) 切酶識別序列，但不能準(zhǔn)確判定具體序列；④酶識別序列如有甲基化的堿基，那么將不會(huì)被 內(nèi)切酶切割。測序法可以比較直觀的判斷5-HTTLPR的多態(tài)性，但是5-HTTLPR的多態(tài)性涉及 大片段堿基的缺失或插入，因而測序可能出現(xiàn)檢測失誤的可能。而本發(fā)明采用PCR擴(kuò)增反 應(yīng)后電泳直接顯帶的方法，可以有效地克服PCR-RFLP法和測序法引起的缺陷，從而快速、 準(zhǔn)確、簡單和低成本地檢測樣品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供檢測5-HTTLPR片段多態(tài)性的引物，其特征在于，包括：擴(kuò) 增5-HTTLPR基因多態(tài)性的正、反向引物；其堿基序列為 ：
[0009] HTTLPR-F ： CAGCACCTAACCCCTAATGT
[0010] HTTLPR-R ：GCCGGTTGGGCTAGCGTCTA
[0011] 進(jìn)一步地，所述正、反向引物的使用濃度比為：HTTLPR-F:HTTLPR-R = 1:1。
[0012] 進(jìn)一步地，所述電泳瓊脂糖使用濃度為：1%
[0013] 進(jìn)一步地，所述正、反向擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：第一階段，95 °C預(yù)變性 lOmin ;第二階段，變性溫度94°C 30sec，退火溫度64°C 90sec，延伸溫度72°C 30sec，循環(huán)35 次；第三階段，72°C lOmin ;第四階段，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增產(chǎn)物在4°C下保存。
[0014] 本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測5-HTTLPR多態(tài)性的方法，其包括如下步驟：
[0015] (1)提取樣品 DNA;
[0016] (2)利用一對擴(kuò)增引物HTTLPR-F和HTTLPR-R對（1)中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增 產(chǎn)物；
[0017] (3)對⑵中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳；
[0018] (4)將⑶中條帶與5-HTTLPR不同多態(tài)性大小進(jìn)行比較，確定多態(tài)性是否存在，其 特征在于，
[0019] HTTLPR-F ： CAGCACCTAACCCCTAATGT
[0020] HTTLPR-R ：GCCGGTTGGGCTAGCGTCTA
[0021] 進(jìn)一步地，步驟（2)的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：第一階段，95°C預(yù)變性lOmin ;第二階段， 變性溫度94°C 30sec，退火溫度64°C 90sec，延伸溫度72°C 30sec，循環(huán)35次；第三階段， 72°C lOmin ;第四階段，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增產(chǎn)物在4°C下保存。
[0022] 本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測5-HTTLPR多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，所述 試劑盒包括樣品DNA抽提試劑；無水乙醇；檢測體系PCR反應(yīng)液、測序體系反應(yīng)液、陽性對 照品、陰性對照品和空白對照品，其中檢測體系PCR反應(yīng)液包括一對擴(kuò)增產(chǎn)物HTTLPR-F和 HTTLPR-R，其特征在于：
[0023] HTTLPR-F ： CAGCACCTAACCCCTAATGT
[0024] HTTLPR-R :GCCGGTTGGGCTAGCGTCTA。
[0025] 進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括HTTLPR的參考序列大小。
[0026] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明設(shè)計(jì)了擴(kuò)增5-HTTLPR片段的正、反向引物，構(gòu)建出穩(wěn) 定的PCR擴(kuò)增體系，通過調(diào)整正、反向引物的濃度、退火溫度等反應(yīng)條件，可使擴(kuò)增效率達(dá) 到最佳，同時(shí)在5-HTTLPR片段的進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，能夠富集正、反向引物與樣品DNA模板正確配 對后大規(guī)模擴(kuò)增出的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，提高擴(kuò)增特異性。再者，鑒于5-HTTLPR的S等位基 因是由于L等位基因的兩個(gè)不連續(xù)的區(qū)域分別缺失長22bp的DNA序列所產(chǎn)生的，利用諸如 Sanger測序之類的傳統(tǒng)測序法檢測5-HTTLPR的多態(tài)性不能準(zhǔn)確給出結(jié)果，而本發(fā)明采用 PCR擴(kuò)增反應(yīng)后電泳直接顯帶的方法，在相同條件下，對待檢樣品DNA和含有LS雜合基因型 的陽性對照品進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)和瓊脂糖凝膠電泳，從而獲得樣品擴(kuò)增產(chǎn)物和對照品擴(kuò)增 產(chǎn)物的電泳圖，根據(jù)電泳圖中的條帶分布就可確定5-HTTLPR片段的多態(tài)性，具有直觀、操 作簡單和成本低等優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為16例樣品的5-HTTLPR片段擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。
[0028] 圖2為83號樣品Sanger測序圖。
[0029] 圖3為82號樣品Sanger測序圖。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實(shí)施例中未說明 的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編 的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] 檢測5-HTTLPR片段多態(tài)性的引物，該引物包括擴(kuò)增5-HTTLPR片段的正向引物 HTTLPR-F和反向引物HTTLPR-R，其堿基序列為：
[0033] HTTLPR-F :5, -CAGCACCTAACCCCTAATGT-3，
[0034] HTTLPR-R : 5，-GCCGGTTGGGCTAGCGTCTA-3，。
[0035] 在檢測中，利用上述正、反向引物對和陽性對照品和待檢樣品中的5-HTTLPR 片段進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，然后瓊脂糖凝膠電泳顯帶，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性條 帶。當(dāng)5-HTTLPR片段為LL純合基因型時(shí)，只有一條擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶，其大小為529bp ; 當(dāng)5-HTTLPR片段為SS純合基因型時(shí)，只有一條擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶，其大小為529bp ;當(dāng) 5-HTTLPR片段為LS雜合基因型時(shí)，有兩條擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶，其大小分別為529bp和485bp。
[0036] 一種檢測5-HTTLPR片段多態(tài)性的試劑盒，包括樣品DNA抽提試劑；檢測體系PCR 反應(yīng)液；瓊脂糖凝膠電泳體系試劑；陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。
[0037] 樣品DNA抽提試劑：可以選擇業(yè)內(nèi)技術(shù)人員熟知的提取試劑進(jìn)行DNA抽提，也可使 用生物技術(shù)公司開發(fā)的試劑盒（如天根生化科技（北京）有限公司的DNA提取試劑盒）來 進(jìn)打DNA抽提。
[0038] 檢測體系PCR反應(yīng)液包括：2XPCR Buffer ;2mM dNTPs ;?υ/μ 1 DNA聚合酶（如K0D FXDNA聚合酶、Taq DNA聚合酶等）；擴(kuò)增5-HTTLPR片段的正、反向引物HTTLPR-F(lOym)、 HTTLPR-R(lOym)。
[0039] 瓊脂糖凝膠電泳體系試劑包括：6X上樣緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNA molecular weight marker)、50XTAE電泳緩沖液貯存液、1XTAE電泳緩沖液工作液、1 %瓊脂糖和 10mg/mL溴乙錠（EB)溶液。
[0040] 6X上樣緩沖液：0· 25%溴酚蘭、40% (W/V)蔗糖水溶液，4°C保存。
[0041] DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)：由 100bp、250bp、500bp、750bp、1500bp 和 2000bp 大小的 DNA 片 段組成。
[0042] 50 X TAE 電泳緩沖液貯存液：稱取 242g Tris，37. 2g Na2EDTA · H20,在 ddH20 中攪 拌溶解，然后加入57. lml冰醋酸，充分?jǐn)嚢韬笥胐dH20定容至1000ml。
[0043] 1 X TAE電泳緩沖液工作液：取10ml 50 X TAE電泳緩沖液貯存液加入到490ml ddH20 中。
[0044] 1%瓊脂糖：lg瓊脂糖用lOOmllXTAE沸水浴溶解。
[0045] 10mg/mL溴乙錠溶液：在100ml ddH20中加入lg溴乙錠，磁力攪拌數(shù)小時(shí)以確保其 完全溶解，然后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫。
[0046] 檢測體系PCR反應(yīng)液試劑配制如下：
[0047]

【權(quán)利要求】
1. 檢測5-HTTLPR片段多態(tài)性的引物，其特征在于，所述引物包括擴(kuò)增5-HTTLPR片段的 正、反向引物，其堿基序列為： HTTLPR-F :5' -CAGCACCTAACCCCTAATGT-3' HTTLPR-R :5' -GCCGGTTGGGCTAGCGTCTA-3'。
2. 如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述正、反向引物的使用濃度比為： HTTLPR-F : HTTLPR-R=1:1。
3. 如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，5-HTTLPR片段多態(tài)性選自LL純合基因型、 LS雜合基因型和SS純合基因型。
4. 如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述正、反向擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)條件為： 第一階段，95 °C預(yù)變性lOmin;第二階段，變性溫度94 °C 30sec，退火溫度58 °C 90sec， 延伸溫度72 °C 3〇sec，循環(huán)35次；第三階段，72 °C lOmin;第四階段，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增 產(chǎn)物在4 °C下保存。
5. -種檢測5-HTTLPR片段多態(tài)性的方法，其包括如下步驟： (1)提取樣品DNA ; (2 )利用正、反向引物HTTLPR-F和HTTLPR-R對（1)中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物； (3) 對（2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，獲得電泳圖； (4) 根據(jù)所述電泳圖中的條帶分布，確定5-HTTLPR片段的多態(tài)性，其特征在于， HTTLPR-F :5' -CAGCACCTAACCCCTAATGT-3' HTTLPR-R :5' -GCCGGTTGGGCTAGCGTCTA-3'。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（2)的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：第一階段，95 °C預(yù)變性lOmin;第二階段，變性溫度94 °C 30sec，退火溫度64 °C 90sec，延伸溫度72 °C 3〇sec，循環(huán)35次；第三階段，72 °C lOmin;第四階段，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增產(chǎn)物在4 °C 下保存。
7. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在瓊脂糖凝膠電泳中，所述瓊脂糖濃度為 1%〇
【文檔編號】C12Q1/68GK104120177SQ201410258375
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】王淑一, 周曉犢 申請人:杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司