一種中低溫中性單寧酶TanXZ7及其基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種中低溫中性單寧酶TanXZ7及其基因和應(yīng)用，其氨基酸堿基序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明的單寧酶TanXZ7最適pH為6.0，在pH3.0～8.0穩(wěn)定性較好；最適溫度為40℃,在25-60℃范圍內(nèi)具有較高的酶活力，且在40℃穩(wěn)定性好；其中低溫中性特性，可使其在食品工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。
【專利說明】—種中低溫中性單寧酶TanXZ7及其基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種中低溫中性單寧酶TanXZ7及其基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]單寧廣泛分布于植物體內(nèi)，包括根，木材，樹皮，水果和葉部。作為植物體內(nèi)的主要次級代謝產(chǎn)物，單寧的含量僅低于纖維素，半纖維素和木質(zhì)素。根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)，可分為可水解的桔酸單寧和鞣花單寧和相對穩(wěn)定的由聚黃烷醇類多酚或原花色素(即羥基黃烷醇類單體)組成的縮合鞣質(zhì)單寧。單寧含有大量的苯環(huán)和酚羥基，易與金屬鏊和，形成更大的多聚體，且可與多糖和蛋白結(jié)合產(chǎn)生收斂和沉降的效果。
[0003]在食品和動物飼料方面，單寧是抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，可以引起茶，飲料，咖啡，酒水等的混濁。而含有單寧的工業(yè)廢水也難以降解，導(dǎo)致水質(zhì)富營養(yǎng)化從而嚴重破壞生態(tài)環(huán)境。而另一方面，作為單寧主要水解產(chǎn)物的沒食子酸是一種附加值高，市場前景廣闊的醫(yī)藥原料，具有抗癌和抗生素的活性。因此對單寧的有效利用和深層開發(fā)已成為目前國內(nèi)外的研究熱點。
[0004]單寧酶的研究始于1780年，主要來源于植物、動物和微生物。植物來源的單寧酶可以從含單寧豐富的水果、葉子、枝干和樹皮中獲得；動物來源的單寧酶可以從動物腸道和瘤胃粘液中提取；微生物來源的單寧酶主要是從細菌和真菌中獲得。由于單寧酶的廣泛應(yīng)用潛力，在動物飼料中可以有效破壞單寧-多糖/蛋白質(zhì)大分子復(fù)合物中的共價交聯(lián)，降低食糜的粘度，改善飼料性 能，降低因粘度增加而引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用；在食品方面起到澄清和改善風(fēng)味的效果；是抗癌藥物和抗生素的主要成份；同時可以改善廢水中單寧的有效降解，因此越來越受到人們的關(guān)注。微生物來源的單寧酶有很長的研究歷史，但進展緩慢，目前已報道了 58株可以產(chǎn)單寧酶的真菌/細菌，25個單寧酶做過性質(zhì)研究，只有3個單寧酶實現(xiàn)了異源表達，I個完成了結(jié)構(gòu)解析。單寧酶的最適PH值在偏酸和中性范圍內(nèi)，極少數(shù)細菌單寧酶在堿性條件下有活性，最適溫度在20-60°C之間。
[0005]食品生產(chǎn)過程中為了不破壞營養(yǎng)，需在中低溫中性條件下利用單寧酶處理，破壞單寧的酯鍵，從而澄清果汁飲料和茶飲品等。因此，所需的單寧酶需要在中性PH和中溫條件下具有高活性。本發(fā)明中TanXZ7最適pH6.0，在pH5.0 - 7.0之間有60%以上的酶活力；最適溫度40°C，在25-60°C具有80%以上的酶活力。該酶具有在低溫條件下高活力的特點，符合在食品工業(yè)中尤其果汁飲料和茶飲品低溫處理的工業(yè)要求。另外，在飼料、醫(yī)藥和廢水處理等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種中低溫中性單寧酶。
[0007]本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述中低溫中性單寧酶的基因。
[0008]本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。[0009]本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0010]本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述中低溫中性單寧酶的基因工程方法。
[0011]本發(fā)明從梭孢菌(Thielavia subthermophila XZ7)中分離得到一種新的中低溫中性單寧酶TanXZ7。
[0012]本發(fā)明提供了一種中低溫中性單寧酶TanXZ7，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]SEQ ID N0.1:
[0014]MPSWLKLTAKALSLSDVCTVSNVQAALPSNGTLLGLNLIPSSVTATMTNSSTSGGMGGGMPMMKRQSSSTQYCAVTVTYTHPGQGDEVNLKYAFPSPSEFKNRFYVGGGGGFSLSSSATGGLSYGAAGGATDAGYDAFDQSYDQVVLYGNGSINWYATHMFGYQALGEMTKIGKYITKGFYGLSNDTKVYTYFEGCSDGGREGMSQVQRWGDEYDGVIAGAPAFRFAQQQVHHVFSSAVEKTLGYLPPPCELDTIVNATIKGCDKLDGREDGVISRTDLCKLNFNMKSIIGQSYYCAEKNSTSLGFGFQKRQQTSGSTTSYQPAQKGTVTKEGVAVAQAIYDGLHNTAGERAYLSWQIGSQLSDANPTYSSESGEWEPNIPSTGGEYVTKFIQLLDLDNLSDLDGVTYDTLVEWMTIGMYRYLDSLQTTLPDLTTFKSSGGKLLHYHGESDPSIPSASSVHYWQSVRSVMYPDVADDKALKDMAKWYQFYLVPGAGHCGSNSLQPGPYPQNNMDIMIDWVENGVQPTRLNATVSS⑶YSGETQMLCQWPTRPLWKKANSFECMTDKKSIEAWTYDFPAFKVPVY
[0015]其中，該酶包括 584個氨基酸，N端無信號肽序列。因此，成熟的中低溫中性單寧酶TanXZ7的理論分子量為66.4kDa。
[0016]本發(fā)明的單寧酶TanXZ7同時具有好的酸堿低高溫適應(yīng)性而在常溫下在酸性的范圍內(nèi)均具有高活性等特性。本發(fā)明的單寧酶，其最適PH值為6.0，在pH3.0-8.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定；最適溫度為40°C，40°C處理Ih酶活基本保持不變，50°C處理Ih后仍可剩余30%以上的酶活。
[0017]本發(fā)明提供了編碼上述中低溫中性單寧酶tanXZ7。具體地，該基因的基因組序列如 SEQ ID N0.2 所示:
[0018]atgccctcctggctcaagctcaccgccaaagccctgtctctgagcgacgtctgcaccgtatcaaacgtgcaggctgcattgccctccaatggcactctgttgggtctcaatctcattccgtcctctgtcacagccacgatgaccaattcctccaccagtggcggcatgggcggcggcatgccaatgatgaaaagacagtcttcctctacccaatactgcgctgtcaccgtcacatatacgcaccctggccagggcgacgaggtcaatctaaagtacgcttttccgagcccttcggaattcaagaaccgtttctatgtcggcggtggaggcggtttctccctctcgtcgtctgccacgggaggtctcagctatggtgccgccggcggggccaccgatgctggatacgacgccttcgaccagtcgtacgaccaggtcgtcctttatggcaacggatccatcaactggtatgccacccacatgttcggctaccaagcactgggcgagatggtagcgagttggagttactactgtgttggaaccatcaggaagaaagatggctgacgtcgttggcagaccaagatcggaaagtacatcaccaagggattctacggactctccaacgacaccaaggtctacacgtacttcgagggctgctctgacggtggacgcgagggcatgagccaggttcagcgctggggcgacgagtacgacggtgtcattgcaggcgccccggccttccgctttgcccagcagcaagtccaccacgtcttctcctccgcagtggaaaaaactctcggctatctcccgcccccctgcgagctcgatacgattgtcaacgccacaatcaagggctgcgataagctcgatggacgcgaggacggcgtcatttctcgcaccgatctttgcaagctcaacttcaacatgaagtcgatcatcggacagtcctactactgcgccgagaagaacagcacttccttgggcttcgggttccagaagcgtcaacagacctcggggagcaccacgagctaccagcctgctcagaagggcactgtcaccaaggagggcgtcgccgtcgctcaggccatttacgatgggctgcacaacaccgccggggagagggcctatctctcgtggcagattgggtcccagctttcggatgcgaacccgacctacagctcggagagcggtgaatgggaaccgaacatcccttcgaccggaggcgaatatgtcaccaagttcatccagctcctcgacctggacaacctgtctgacctggatggcgtcacgtacgacacgctggttgagtggatgacaatcggcatgtaccggtacttggacagccttcagacgaccttgccggatcttaccaccttcaagtcctctggcggaaagctgctccactaccacggcgaatccgaccccagcatcccttctgcttcctcggtgcactactggcagtctgtgcggagcgtcatgtaccctgatgtcgcggatgacaaggctctcaaggacatggccaagtggtatcagttctacctggtcccgggcgcaggccactgtggcagcaactccctccagcccggcccctaccctcagaacaacatggacatcatgattgactgggtggagaacggtgtccagccgacgcgcctcaatgccacggtttcctcgggcgactattccggcgagacccagatgctctgccagtggccgacacgtccgctctggaagaaggctaactcttttgagtgcatgacggacaagaagagtattgaggcctggacttacgacttccccgccttcaaggtgcccgtgtactaa
[0019]本發(fā)明基于PCR的方法分離克隆了單寧酶基因tanXZ7，DNA全序列分析結(jié)果表明，單寧酶TanXZ7結(jié)構(gòu)基因tanXZ7全長1821bp。
[0020]本發(fā)明提供了編碼上述中低溫中性單寧酶tanXZ7的cDNA序列。具體地，該基因的cDNA序列如SEQ ID N0.3所示:
[0021]atgccctcctggctcaagctcaccgccaaagccctgtctctgagcgacgtctgcaccgtatcaaacgtgcaggctgcattgccctcc aatggcactctgttgggtctcaatctcattccgtcctctgtcacagccacgatgaccaattcctccaccagtggcggcatgggcggcggcatgccaatgatgaaaagacagtcttcctctacccaatactgcgctgtcaccgtcacatatacgcaccctggccagggcgacgaggtcaatctaaagtacgcttttccgagcccttcggaattcaagaaccgtttctatgtcggcggtggaggcggtttctccctctcgtcgtctgccacgggaggtctcagctatggtgccgccggcggggccaccgatgctggatacgacgccttcgaccagtcgtacgaccaggtcgtcctttatggcaacggatccatcaactggtatgccacccacatgttcggctaccaagcactgggcgagatgaccaagatcggaaagtacatcaccaagggattctacggactctccaacgacaccaaggtctacacgtacttcgagggctgctctgacggtggacgcgagggcatgagccaggttcagcgctggggcgacgagtacgacggtgtcattgcaggcgccccggccttccgctttgcccagcagcaagtccaccacgtcttctcctccgcagtggaaaaaactctcggctatctcccgcccccctgcgagctcgatacgattgtcaacgccacaatcaagggctgcgataagctcgatggacgcgaggacggcgtcatttctcgcaccgatctttgcaagctcaacttcaacatgaagtcgatcatcggacagtcctactactgcgccgagaagaacagcacttccttgggcttcgggttccagaagcgtcaacagacctcggggagcaccacgagctaccagcctgctcagaagggcactgtcaccaaggagggcgtcgccgtcgctcaggccatttacgatgggctgcacaacaccgccggggagagggcctatctctcgtggcagattgggtcccagctttcggatgcgaacccgacctacagctcggagagcggtgaatgggaaccgaacatcccttcgaccggaggcgaatatgtcaccaagtteatccagctcctcgacctggacaacctgtctgacctggatggcgtcacgtacgacacgctggttgagtggatgacaatcggcatgtaccggtacttggacagccttcagacgaccttgccggatcttaccaccttcaagtcctctggcggaaagctgctccactaccacggcgaatccgaccccagcatcccttctgcttcctcggtgcactactggcagtctgtgcggagcgtcatgtaccctgatgtcgcggatgacaaggctctcaaggacatggccaagtggtatcagttctacctggtcccgggcgcaggccactgtggcagcaactccctccagcccggcccctaccctcagaacaacatggacatcatgattgactgggtggagaacggtgtccagccgacgcgcctcaatgccacggtttcctcgggcgactattccggcgagacccagatgctctgccagtggccgacacgtccgctctggaagaaggctaactcttttgagtgcatgacggacaagaagagtattgaggcctggacttacgacttccccgccttcaaggtgcccgtgtactaa
[0022]本發(fā)明提供了編碼上述中低溫中性單寧酶tanXZ7的內(nèi)含子序列。具體地，該基因的內(nèi)含子序列如SEQ ID N0.4所示:
[0023]gtagcgagttggagttactactgtgttggaaccatcaggaagaaagatggctgacgtcgttggcag
[0024]本發(fā)明基于PCR的方法分離克隆了單寧酶基因tanXZ7的cDNA序列，cDNA全序列分析結(jié)果表明，單寧酶TanXZ7結(jié)構(gòu)基因tanXZ7全長1755bp，無信號肽編碼序列。[0025]成熟蛋白理論分子量為66.4kDa，將單寧酶基因tanXZ7序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對，確定TanXZ7是一種新的單寧酶。
[0026]本發(fā)明提供了包含上述中低溫酸性單寧酶基因tanXZ7的重組載體，選為pPIC-tanXZ7。將本發(fā)明的單寧酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將本發(fā)明的單寧酶基因插入到質(zhì)粒PPIC9上的SpeI和NotI限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達質(zhì)粒pPIC-tanXZ7。
[0027]本發(fā)明還提供了包含上述中低溫酸性單寧酶基因tanXZ7的重組菌株，優(yōu)選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌，優(yōu)選為重組菌株GS115/tanXZ7。
[0028]本發(fā)明還提供了一種制備中低溫中性單寧酶TanXZ7的方法，包括以下步驟:
[0029]I)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；
[0030]2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組單寧酶表達；
[0031]3)回收并純化所表達的單寧酶TanXZ7。
[0032]其中，優(yōu)選所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞，優(yōu)選將重組酵母表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞(Pichia pastoris GS115)，得到重組菌株GS115/tanXZ7。
[0033]本發(fā)明還提供了上述中低溫酸性單寧酶TanXZ7的應(yīng)用。 [0034]本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、適合于在食品、飼料、醫(yī)藥和廢水處理中應(yīng)用新的單寧酶TanXZ7。本發(fā)明的單寧酶TanXZ7最適pH為6.0，最適溫度40°C，在25~60°C都有較高的酶活性；其耐中低溫特性，可使其在需求中低溫環(huán)境的工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用。本單寧酶可應(yīng)用于飼料工業(yè)，有效降低粘度，消除或降低因粘度增加而引起的抗?fàn)I養(yǎng)作用。在食品工業(yè)中，可降解單寧，有效提高茶、咖啡、果汁飲料的澄清效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1重組單寧酶的最適pH。
[0036]圖2重組單寧酶的pH穩(wěn)定性。
[0037]圖3重組單寧酶的最適溫度。
[0038]圖4重組單寧酶的熱穩(wěn)定性。
【具體實施方式】
[0039]試驗材料和試劑
[0040]1、菌株及載體:本發(fā)明從梭孢菌(Thielaviasubthermophila)中分離得到一種新的中低溫中性單寧酶TanXZ7。畢赤酵母表達載體pPIC9及菌株GS115購自于Invitrogen公司。
[0041]2、酶類及其它生化試劑:內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。單寧酸購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。
[0042]3、培養(yǎng)基:
[0043](I)Thielavia subthermophila XZ7CGMCC6544培養(yǎng)基為單寧酶篩選培養(yǎng)基(TAA):0.3%硝酸鈉，0.1 %磷酸氫二鉀，0.05%氯化鉀，0.05%硫酸鎂，1.5%瓊脂粉，I %單寧酸。
[0044](2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB(1 %蛋白胨、0.5%酵母提取物、I % NaCl，pH自然)。
[0045](3) BMGY 培養(yǎng)基:1 %酵母提取物，2 % 蛋白胨，1.34% YNB, 0.00004% Biotin, I %甘油(V/V)。
[0046]⑷BMMY培養(yǎng)基:除以0.5 %甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同，pH自然。
[0047]說明:以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。
[0048]實施例1Thielavia subthermophila XZ7單寧酶編碼基因tanXZ7的克隆
[0049]菌株Thielavia subthermophila XZ7采自寧夏自治區(qū)沙漠地區(qū)植被根部沙子,能夠在45°C正常生長，而在20°C下不能生長，是一株典型的嗜熱真菌。
[0050]提取梭抱菌Thielavia subthermophila XZ7 基因組 DNA:
[0051]將液體培養(yǎng)3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入液氮使其預(yù)冷，將菌體置于研缽中充分研磨成白色粉末狀，將白色粉末轉(zhuǎn)入50mL離心管中,加入22.5mL65°C預(yù)熱的CTAB溶液(用前加入2%的巰基乙醇)和2.5mL20% SDS溶液，65°C水浴鍋裂解2h，每隔IOmin顛倒混勻一次，在4°C下12000rpm離心15min。取上清于氯仿/異戊醇(24:1)中抽提除去雜蛋白，再取上清加入0.6倍體積異丙醇，于-20°C靜置30min后，4°C下12000rpm離心10min。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量已滅菌的去離子水溶解，加入2 μ L RNase A酶，37°C水浴消化30min以去除RNA，置于_20°C備用。
[0052]根據(jù)單寧酶基因的保守(YY(L)PPPCEL和VTYDTLV)序列設(shè)計合成了簡并引物TanF, Tan R
[0053]Tan F:5’-TACTACCCNCCNCCNTGYGA-3’ ；
[0054]Tan R:5’-GTGTCGTANGTNACRTTRTC-3’ 。
[0055]以梭抱菌Thielavia subthermophila XZ7CGMCC6544 基因組 DNA 為模板進行 PCR擴增。PCR反應(yīng)參數(shù)為:95°C變性5min ;然后94°C變性30sec，48°C退火30sec，72°C延伸lmin，30個循環(huán)后72°C保溫lOmin。得到一段約497bp片段，將該片段回收后與pEASY_T3載體相連送三博生物技術(shù)有限公司測序。
[0056]根據(jù)測序得到的核苷酸序列，設(shè)計上游和下游各兩套TAIL-PCR特異性引物:設(shè)計方向為需要擴增的未知區(qū)域方向，XZ7-F2/R2的位置設(shè)計在XZ7-F1/R1的內(nèi)側(cè)。每兩個引物之間的距離是60~IOObp，引物長度一般22~30nt，退火溫度在60~65°C。并將它們分別命名為XZ7-F1，XZ7-F2 (上游特異性引物)，XZ7-R1, XZ7-R2 (下游特異性引物)見表1。
[0057] 表1.單寧酶TanXZ7TAIL_PCR特異性引物
[0058]
【權(quán)利要求】
1.一種中溫中性單寧酶TanXZ7，其特征在于，其氨基酸堿基序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種中溫中性單寧酶TanXZ7，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的中溫中性單寧酶TanXZ7。
3.如權(quán)利要求2所述的中溫中性單寧酶TanXZ7，其特征在于，其堿基序列如SEQIDN0.2 或 SEQ ID N0.3 所示。
4.包含權(quán)利要求2所述高溫中溫中性單寧酶TanXZ7的重組載體。
5.包含權(quán)利要求2所述中溫中性單寧酶TanXZ7的重組載體pPIC_tanXZ7。
6.包含權(quán)利要求2所述中溫中性單寧酶TanXZ7的重組菌株。
7.一種制備中溫中性單寧酶TanXZ7的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)用權(quán)利要求4的重組載 體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株； 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組單寧酶表達； 3)回收并純化所表達的中溫中性單寧酶TanXZ7。
8.權(quán)利要求1所述中溫中性單寧酶TanXZ7的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述中溫中性單寧酶TanXZ7在食品工業(yè)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/18GK104004725SQ201410258209
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】姚斌, 馬銳, 張三燕, 石鵬君, 黃火清, 柏映國, 羅會穎, 王亞茹, 楊培龍, 孟昆 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所