專利名稱：：海洋細菌新型低溫堿性蛋白酶mp的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及基因克隆
技術領域：
，特別是涉及海洋細菌新型低溫蛋白酶MP。
背景技術：
：酶制劑產業(yè)經歷了半個多世紀的起步和迅速發(fā)展之后，現已形成一個富有活力的高技術產業(yè)，在洗滌、皮革、食品、飼料、制藥和紡織等工業(yè)領域得到廣泛應用。蛋白酶作為一種酶制劑，其市場占有率已經超過了40%。堿性蛋白酶的應用起源于20世紀60年代，來自地衣芽孢桿菌的Carlsberg絲氨酸蛋白酶首次作為洗滌添加劑被推向市場。由于其不僅能夠水解去除衣物上的奶漬、汗?jié)n、血漬等污物，而且與洗滌劑的相容性較好，因此受到了世界范圍的酶制劑市場的關注。隨著綠色、環(huán)保、節(jié)能理念的深入，無磷和低溫洗滌已成為一個趨勢，它改變了長久以來的洗滌習慣。為了獲得更好的洗滌效果，人們不得不提高洗滌液的堿度，同時在洗滌液中添加氧化劑增強洗滌效果，但已有的天然堿性蛋白酶不能很好的適應現有的應用環(huán)境。因此，許多國家展開了應用蛋白質工程對現有的堿性蛋白酶進行人工改造的研究，同時從自然界中尋找新的堿性抗氧化蛋白酶。傳統(tǒng)上從自然界中篩選得到的抗氧化蛋白酶OSP(OxidatilvelyStableProtease)多數來源于陸地的芽孢桿菌屬菌株，屬于絲氨酸蛋白酶類。海洋環(huán)境不同于陸地，造就的生物具有獨特的代謝途徑和遺傳背景，代謝過程中的酶類在性質、功能上與陸地生物酶有很多不同。歐、美及日本等國每年投入數億美元的資金，用于海洋酶領域的研究與開發(fā)。目前國內外對天然抗氧化蛋白酶的研究大多數停留在描述基本的酶學性質，得到基因序列的少數蛋白酶都是來自芽孢桿菌的絲氨酸蛋白酶，野生型抗氧化蛋白酶的空間結構僅有一例報道，即絲氨酸蛋白酶KP-43，它有N端和C端兩個結構域。N端a/P水解酶結構域是所有枯草芽孢桿菌蛋白酶共有的催化結構域，由ll個a螺旋與10個|3折疊組成，包括了三個保守的催化殘基Asp30、His68和Ser255。催化殘基Ser255和形成氧陰離子洞(oxyanionhole)的殘基均位于第九個a螺旋上。C端由兩個四股反平行P折疊組成jellyroll13桶結構域，C端結構域同酶的抗氧化性無關，與酶自身折疊有關。將正常的KP-43和被過氧化氫氧化的KP-43的晶體比較，空間結構幾乎相同；只有靠近催化殘基Ser255的Met251和Met256被氧化成亞砜。從海洋細菌中分離純化得到一種低溫堿性金屬蛋白酶MP，使用pH范圍為7-11，(TC冰浴中尚能保持一定活性，是一種適應溫度在20-3(TC范圍內活性基本不變的堿性蛋白酶，其活性不被洗衣粉中表面活性劑所抑制，與氧化漂白劑配伍基本穩(wěn)定，這些獨特性能賦予它在加酶洗滌劑工業(yè)、生化試劑以及其它低溫工業(yè)等領域的廣闊應用前旦足。應用表明其抗氧化性能與當今洗滌劑市場上經過蛋白質工程改造過的SiibtilisinCarlsberg(SC)，SubtilisinNovoCBacterialProteaseNagaseBPN'》Alcalase，Esperasean禾口Savinase(SB309)等產品相比還有一定的差距。需要對其進行蛋白質工程改造。定向進化(directedevolution)是近20年發(fā)展起來的一項新的蛋白質改造技術，是達爾文的進化論思想在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和應用。它不需要深入了解蛋白質的結構功能關系，在實驗室條件下人工模擬生物大分子自然進化過程，在體外對基因進行隨機誘變，使基因發(fā)生大量變異，并定向選擇出所需性質的突變體，從而可以在短時間內實現自然界幾百萬年才能完成的進化過程。自定向進化技術問世以來，已多次成功地利用這一技術實現了對一些蛋白質(酶)的改造。在醫(yī)藥研究方面，Stemmer等以重組13內酰胺酶基因的E.coli為原始菌株進行DNA改組(DNAshufling)，最終得到一株耐頭孢噻月肟(cefotaxime)濃度為640g/mL的突變株，其MIC是原始菌株的32000倍。周政等對來源于Providenceiarettgeri、Escherichiacoli和Kluyveracitrophila的青霉素酰化酶基因進行DNA家族改組，構建了基因嵌合體突變庫，通過一輪重排及篩選，獲得了合成活力提高40%的突變酶。酶是當今許多工業(yè)生產中必不可少的組成部分，可是自然界不能提供我們所需要的所有酶，而定向進化技術為工業(yè)酶的研究成功提供了有效的工具。Maxygen公司運用DNA改組技術創(chuàng)造了600個新的子基因，其中77個可以表達超級酶，即在高、中、低3種pH環(huán)境下，均比自然存在的酶有較好的功能，如抗有機溶劑和抗熱性，具有巨大的商業(yè)價值。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于采用現代克隆技術的PCR、DNAShuffing、RAISE等方法克隆產自海洋細菌YS-80的新型低溫堿性蛋白酶MP的基因。本發(fā)明提供的海洋細菌YS-80的新型低溫堿性蛋白酶MP，特征在于新型低溫堿性蛋白酶MP，N端有17個氨基酸的信號肽序列，中間有保守的Zn2+和Ca2+結合位點，其1482bp的基因序列、492個氨基酸序列。用DNAMAN分析軟件分析所述克隆體的基因序列，其開放閱讀框核酸序列為1443bp，與Pseudomonassp.'TACII18，pap基因相似性為84%，與Pseudomonasfragi堿性金屬蛋白酶aprX部分基因相似性為83%，與Pseudomonasfluorescens蛋白酶prtA基因相似性為70%。海洋細菌YS-80的新型低溫堿性蛋白酶MP基因的克隆體的氨基酸序列，共編碼480個氨基酸，蛋白質分子量計算為48693Dal，與嗜冷蛋白酶PAPRA的相似性為91%，與堿性金屬蛋白酶前體蛋白AprA的相似性為70%，與蛋白酶PrtA的相似性為67%。本發(fā)明提供的海洋細菌YS-80的新型低溫堿性蛋白酶MP基因的克隆為1新型低溫堿性蛋白酶MP的純化將海洋細菌YS-80(分離自深海海泥海洋細菌(YS-80)保藏在中國武漢CCTCC，保藏號為CCTCCNO:M209177,保藏日期為2009年8月17日)的發(fā)酵液5000rpm離心30分鐘，上清液在4t:用65%(wt%)硫酸銨沉淀30分鐘。沉淀的新型低溫堿性蛋白酶MP復溶在去離子水中，分別用10KD和3KD的濾膜抽濾濃縮新型低溫堿性蛋白酶MP。最后將濃縮樣品上Superdex-200分子篩凝膠柱，收集單一的活性峰的新型低溫堿性蛋白酶MP(簡稱蛋白酶MP)，純化后的蛋白酶MP進行SDS-PAGE電泳，分子量大約為646KD，達到了電泳純(見圖l)。以此純度的蛋白酶作為抗原進行Western-blotting實驗。2.部分基因序列的獲取將電泳純的蛋白酶MP測定蛋白N端序列(上海生化所)，根據測定的結果設計兼并引物5F1:GCNAAYGGNACNWSNWSNGCN5R1:NARNGTRTGNCCDATYTCRTG按分子克隆實驗手冊的標準方法提取海洋細菌YS-80的基因組DNA作為模板，PCR擴增蛋白酶MP的900bp基因片段，PCR擴增條件95。C5分鐘，95。C40秒，45°C1分鐘，72t:i分鐘，30個循環(huán)，72t:延伸6分鐘。PCR擴增產物用膠回收試劑盒(購自上海博日公司)回收后，連到PMDT-18載體(Takara公司產品)，轉化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞(Takara公司產品)，涂AP-IPTG-XGAL平板，挑取陽性克隆提質粒，進行測序(上海生化所)。3.用反向PCR克隆蛋白酶MP全基因序列根據已測定的蛋白酶MP的部分基因序列重新設計引物，5F2:GCGTTGCTGGCGTTTCCATAGGCT5R2:TTCTTCTCGCTCCAGTAA按分子克隆實驗手冊的標準方法大量提取海洋細菌YS-80的基因組DNA，用BamHI酶切，膠回收試劑盒回收大約2-3kb的酶切片段，16。C過夜連接環(huán)化，然后以此為模板，5F2/5R2為引物進行反向PCR擴增出約500bp的條帶，得克隆蛋白酶MP的基因序列。反向PCR擴增條件95°C5分鐘，95。C30秒，45。C-55°C1分鐘，72。C3分鐘，30個循環(huán)，72t:延伸6分鐘。4.序列分析DNA和蛋白序列比對分析及開放閱讀框的定位使用NCBI網站的Blast和ORFFinder工具，信號肽序列分析采用http:〃www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/的SignalP3.0Server分析軟件。蛋白質分類及功能分析使用http:Vmerops.sanger.ac.uk/。5.蛋白酶MP在大腸桿菌中的重組表達①重組表達載體的構建根據克隆的基因序列的ORF框，分別將去掉信號肽序列的起始端和末端添加Ndel、Xhol酶切位點，設計引物，5P1F:CGCGCATATGTCGAAACTTAAAGAG5P1R:CTCGAGCGCGACGATGTCGTAAGTT以蛋白酶MP基因組為模板，PCR擴增其ORF框基因序列?；厥誔CR產物，核酸電泳(見圖2A)連至PMDT-lS克隆載體(Takara公司產品)，分別用Ndel、Xhol酶切(Takara公司產品)，回收插入片段再與經過同樣酶切的PET28蛋白表達載體(Invitrogen公司產品)連接轉化DH5a感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取質粒，再用NdeI、Xhol進行酶切，切出大約1.5kb的基因片段(圖2B)。②重組蛋白的誘導表達將篩選的陽性克隆提取質粒轉化BL21(DE3)菌株(Takara公司產品)，接種于帶有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，200rpm、37。C振蕩培養(yǎng)，待OD600為0.5左右時，加入終濃度為0.4mM的IPTG誘導表達，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5個小時，收集菌體，用8M尿素裂解后進行SDS-PAGE電泳(見圖3)。電泳結果顯示，誘導出分子量大約為46KD的重組蛋白，與通過基因序列推導的蛋白分子量以及野生型菌株純化的蛋白酶分子量基本一致。重組蛋白的鑒定(Western-blotting)①一抗的制備8周大的SPA級Wistar雄性大鼠一只，將純化好的蛋白酶MP約50yg作為抗原，多點皮下注射，進行初次免疫。間隔三周后，加強免疫一次，再間隔兩周，第二次加強免疫。一周后，斷尾取血，檢測效價。②重組蛋白的鑒定用野生型菌株純化的蛋白酶MP注射大鼠，獲得一抗后，用酶聯免疫法檢測抗體效價，大約為1500倍。將重組蛋白、野生型蛋白以及陰性對照絲氨酸蛋白酶DegQ進行SDS-PAGE電泳。蛋白膠分成兩份，其中一份進行考馬斯亮藍染色，另一份轉印硝酸纖維素膜，轉膜條件為4°C，80伏電壓，轉膜3小時。轉膜后用HRP-DAB底物顯色試劑盒顯色(見圖4)。以蛋白酶PS5為抗原獲得的抗體為一抗，HRP標記的羊抗大鼠IgG為二抗，進行Western-blotting鑒定，分別以純化的蛋白酶MP作為陽性對照，絲氨酸蛋白酶DegQ作為陰性對照，結果顯示，重組蛋白與野生型純化的蛋白獲得的抗體進行了特異性結合，而陰性對照沒有雜交條帶，說明通過基因序列設計引物表達的重組蛋白與野生型菌株表達的蛋白是同一個蛋白。該新型低溫堿性蛋白酶MP的酶制劑在洗滌、醫(yī)藥及食品等領域具有廣泛應用前途。圖1原料海洋蛋白酶MP純化后達到電泳純圖。其中1:蛋白Marker;2:純化的蛋白酶MP。圖2A海洋蛋白酶MPORF框PCR產物進行核酸電泳圖。圖2B重組表達載體酶切后基因片段核酸電泳圖。箭頭所指處均為海洋蛋白酶MP基因。圖3重組表達蛋白聚丙烯酰胺電泳圖。其中1:蛋白Marker;2:誘導表達的重組蛋白；3:誘導表達的空載體。圖4免疫印跡雜交電泳圖及聚丙烯酰胺電泳圖。其中1:蛋白Marker;2:陽性對照(野生菌純化蛋白)；3:重組表達蛋白；4:陰性對照(絲氨酸蛋白酶DegQ)。具體實施例方式根據電泳純的海洋蛋白酶MP樣品測定蛋白N端序列(上海生化所)，結果設計兼并引物5F1:GCNAAYGGNACNWSNWSNGCN5R1:NARNGTRTGNCCDATYTCRTG按分子克隆實驗手冊的標準方法提取海洋細菌YS-80的基因組DNA作為模板，PCR擴增海洋蛋白酶MP的約900bp基因片段，PCR條件95°C5分鐘，95。C40秒，45。Cl分鐘，72。Cl分鐘，30個循環(huán)，72。C延伸6分鐘。PCR擴增產物用膠回收試劑盒回收后，連到PMDT-18載體(Takara公司產品)，轉化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞(Takara公司產品)，涂AP-IPTG-XGAL平板，挑取陽性克隆提質粒測序(上海生工)。根據已測定的PCR擴增海洋蛋白酶MP的部分基因序列重新設計引物，5F2:GCGTTGCTGGCGTTTCCATAGGCT5R2:TTCTTCTCGCTCCAGTAA按分子克隆實驗手冊的標準方法大量提取海洋細菌YS-80的基因組DNA，用BamHI酶切，膠回收試劑盒回收大約2-3kb的酶切片段，16。C過夜連接環(huán)化，然后以此為模板，5F2/5R2為引物進行PCR擴增出約500bp的條帶，與已知序列拼接獲得1482bp的基因序列。PCR條件95°C5分鐘，95。C30秒，45。C-55°C1分鐘，72。C3分鐘，30個循環(huán)，72t:延伸6分鐘。DNA和蛋白序列比對分析及開放閱讀框的定位使用NCBI網站的Blast和ORFFinder工具，信號肽序列分析采用http:〃www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/的SignalP3.0Server分析軟件。蛋白質分類及功能分析使用http:Vmerops.sanger.ac.uk/。根據克隆的基因序列的ORF框，分別將去掉信號肽序列的起始端和末端添加Ndel、Xhol酶切位點，設計引物，5P1F:CGCGCATATGTCGAAACTTAAAGAG5P1R:CTCGAGCGCGACGATGTCGTAAGTT以海洋蛋白酶MP基因組為模板，PCR擴增其ORF框基因序列。回收PCR產物，連至PMDT-18克隆載體，分別用NdeI、Xhol酶切，再與經過同樣酶切的PET28表達載體連接轉化，篩選陽性克隆。將篩選的陽性克隆提取質粒轉化BL21(DE3)菌株，接種于帶有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，200rpm、37。C振蕩培養(yǎng)，待OD600為0.5左右時，加入終濃度為0.4mM的IPTG誘導表達，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5個小時，收集菌體，用8M尿素裂解，跑SDS-PAGE膠。重組蛋白的鑒定(Western-blotting)—抗的制備從青島市動檢所購買8周大的SPA級Wistar雄性大鼠一只，將純化好的海洋蛋白酶MP約50iig作為抗原，多點皮下注射，進行初次免疫。間隔三周后，加強免疫一次，再間隔兩周，第二次加強免疫。一周后，斷尾取血，檢測效價。蛋白質印跡實驗重組蛋白經SDS-PAGE電泳后，一半進行考馬斯亮藍染色，另一半轉印至硝酸纖維素膜，轉膜條件為4°C，80伏電壓，轉膜3小時。以海洋蛋白酶MP為抗原獲得的抗體為一抗，HRP標記的羊抗大鼠IgG為二抗，進行Western-blotting鑒定，分別以純化的海洋蛋白酶MP作為陽性對照，絲氨酸蛋白酶DegQ作為陰性對照。實驗結果顯示，重組蛋白與野生型純化的蛋白獲得的抗體進行了特異性結合，而陰性對照沒有雜交條帶，說明我們通過基因序列設計引物表達的重組蛋白與野生型菌株表達的蛋白是同一個蛋白。序列表<110>中國水產科學研究院黃海水產研究所<120>海洋細菌新型低溫堿性蛋白酶MP<160>290072]<210>10073]<211>14820074]<212>DNA0075]<213>海洋細菌YS-800076]<400>10077]gctaaacaaggaactgtttacatgtcgaaacttaaagagaaagcagcgctgtccgtcaac300078]ccgacgtttgcggccaacggcaccagttctgccttcacccaggtggataacttcagtcat1200079]ttctatgaccgcggtaatcacctggtcaatggcaagccatcgtttacggtcgatcaggcc1800080]gctgaccaactgacccgcagtggcgccagttggtacgacctcaatggcgacggtgtgatc2400081]aatttgtcctacaccttcctcacgtctccaccgccgggctatgcctcccgtggtctgggc3000082]actttcagctcgttctccgggctgcaaaaggaacaggccaagctgtcgctggagtcgtgg3600083]gccgatgtggccaaagtgaccttcactgaaggcccggcggcacggggtgacgatggtcac4200084]atgaccttcgccaacttcagcgccagcaacggcggggctgcgtttgcctacctgccgaac■0085]agctcgcgcaaaggcgagtcgtggtacctgatcaacaaggactacgatgtcaacaaaacc5400086]ccgggggaaggcaactacggtcgtcagaccctgacccacgagatcggtcacaccctgggc6000087]ctgtcacaccccggcgactacaacgccggtaatggcaacccgagctaccgtgatgccgtg6600088]tatggcgaagacacccgtgcttacagtgtcatgagttactggagcgagaagaacaccggc7200089]caagtgttcaccaagaccggggaaggcgcctatgcgtcggcaccactgctcgatgacatt7800090]gctgcggtgcagaagctgtacggcgcgaacatggaaacccgcgccggtgacaccgtttat8400091]gggttcaactccacggctgaccgcgactactacagcgccacttcggccaccgacaagttg9000092]attttttcggtgtgggatggcggcggcaatgacacgctggacttctcgggtttcagccag9600093]aaccagaaaatcaacctggccgccggttcgttctctgacgtgggcgggatgaccggtaac10200094]gtgtcgatcgctcaaggcgtgaccatcgaaaacgccatcgggggttcgggtaacgacctg10800095]ttgctgggcaacgcggcctccaacatcctcaagggtggtgccgggaacgacatcatctac11400096]ggcggtggcggggcagacaagctgtggggcgggagcggttcggacacgtttgtttaccgt12000097]gaagtgtctgattcgacccccaaggcggccgataccctcatggatttccagaccgggctc12600098]gacaaaatcgacctcaccgggattactcatctcagtgggttgaatttcgtcaatgcgttc13200099]accggtcaggcaggtgatgcggtcgtcagctacaaccaggccagcaatgctggctcgctg13800100]caagtggacttcagcggacacggcgtagccgatttcctgatcaccaccgtcgggcaagtg14400101]gcaacttacgacatcgtcgcgtaaggctgtcggtaaacgggc14820102]<210>20103]<211>4920104]<212>PRT0105]<213>海洋細菌YS-800106]<400>20107]AKQGTVYMSKLKEKAALSVNPTFAANGTSSAFTQVDNFSHFYDRGNHLVNGKPSFTVDQA60ADQLTRSGASWYDLNGDGVINLSYTFLTSPPPGYASRGLGTFSSFSGLQKEQAKLSLESW120ADVAKVTFTEGPAARGDDGHMTFANFSASNGGAAFAYLPNSSRKGESWYLINKDYDVNKT180PGEGNYGRQTLTHEIGHTLGLSHPGDYNAGNGNPSYRDAVYGEDTRAYSVMSYWSEKNTG240QVFTKTGEGAYASAPLLDDIAAVQKLYGANMETRAGDTVYGFNSTADRDYYSATSATDKL300IFSVWDGGGNDTLDFSGFSQNQKINLAAGSFSDVGGMTGNVSIAQGVTIENAIGGSGNDL360IXGNAASNILKGGAGNDIIYGGGGADKLWGGSGSDTFVYREVSDSTPKAADTLMDFQTGL420DKIDLTGITHLSGLNFVNAFTGQAGDAVVSYNQASNAGSLQVDFSGHGVADFLITTVGQV■ATYDIVAGCRTG492SequenceDescription-1權利要求海洋細菌新型低溫堿性蛋白酶MP，特征在于該新型低溫堿性蛋白酶MP，N端有17個氨基酸的信號肽序列，中間有保守的Zn2+和Ca2+結合位點，1482bp的基因序列為1GCTAAACAAGGAACTGTTTACATGTCGAAACTTAAAGAGAAAGCA4546GCGCTGTCCGTCAACCCGACGTTTGCGGCCAACGGCACCAGTTCT9091GCCTTCACCCAGGTGGATAACTTCAGTCATTTCTATGACCGCGGT135136AATCACCTGGTCAATGGCAAGCCATCGTTTACGGTCGATCAGGCC180181GCTGACCAACTGACCCGCAGTGGCGCCAGTTGGTACGACCTCAAT225226GGCGACGGTGTGATCAATTTGTCCTACACCTTCCTCACGTCTCCA270271CCGCCGGGCTATGCCTCCCGTGGTCTGGGCACTTTCAGCTCGTTC315316TCCGGGCTGCAAAAGGAACAGGCCAAGCTGTCGCTGGAGTCGTGG360361GCCGATGTGGCCAAAGTGACCTTCACTGAAGGCCCGGCGGCACGG405406GGTGACGATGGTCACATGACCTTCGCCAACTTCAGCGCCAGCAAC450451GGCGGGGCTGCGTTTGCCTACCTGCCGAACAGCTCGCGCAAAGGC495496GAGTCGTGGTACCTGATCAACAAGGACTACGATGTCAACAAAACC540541CCGGGGGAAGGCAACTACGGTCGTCAGACCCTGACCCACGAGATC585586GGTCACACCCTGGGCCTGTCACACCCCGGCGACTACAACGCCGGT630631AATGGCAACCCGAGCTACCGTGATGCCGTGTATGGCGAAGACACC675676CGTGCTTACAGTGTCATGAGTTACTGGAGCGAGAAGAACACCGGC720721CAAGTGTTCACCAAGACCGGGGAAGGCGCCTATGCGTCGGCACCA765766CTGCTCGATGACATTGCTGCGGTGCAGAAGCTGTACGGCGCGAAC810811ATGAAACCCGCGCCGGTGACACCGTTTATGGGTTCAACTCCACG855856GCTGACCGCGACTACTACAGCGCCACTTCGGCCACCGACAAGTTG900901ATTTTTTCGGTGTGGGATGGCGGCGGCAATGACACGCTGGACTTC945946TCGGGTTTCAGCCAGAACCAGAAAATCAACCTGGCCGCCGGTTCG990991TTCTCTGACGTGGGCGGGATGACCGGTAACGTGTCGATCGCTCAA10351036GGCGTGACCATCGAAAACGCCATCGGGGGTTCGGGTAACGACCTG10801081TTGCTGGGCAACGCGGCCTCCAACATCCTCAAGGGTGGTGCCGGG11251126AACGACATCATCTACGGCGGTGGCGGGGCAGACAAGCTGTGGGGC11701171GGGAGCGGTTCGGACACGTTTGTTTACCGTGAAGTGTCTGATTCG12151216ACCCCCAAGGCGGCCGATACCCTCATGGATTTCCAGACCGGGCTC12601261GACAAAATCGACCTCACCGGGATTACTCATCTCAGTGGGTTGAAT13051306TTCGTCAATGCGTTCACCGGTCAGGCAGGTGATGCGGTCGTCAGC13501351TACAACCAGGCCAGCAATGCTGGCTCGCTGCAAGTGGACTTCAGC13951396GGACACGGCGTAGCCGATTTCCTGATCACCACCGTCGGGCAAGTG14401441GCAACTTACGACATCGTCGCGTAAGGCTGTCGGTAAACGGGC1482氨基酸序列1AKQGTVYMSKLKEKA1516ALSVNPTFAANGTSS3031AFTQVDNFSHFYDRG4546NHLVNGKPSFTVDQA6061ADQLTRSGASWYDLN7576GDGVINLSYTFLTSP9091PPGYASRGLGTFSSF105106SGLQKEQAKLSLESW120121ADVAKVTFTEGPAAR135136GDDGHMTFANFSASN150151GGAAFAYLPNSSRKG165166ESWYLINKDYDVNKT180181PGEGNYGRQTLTHEI195196GHTLGLSHPGDYNAG210211NGNPSYRDAVYGEDT225226RAYSVMSYWSEKNTG240241QVFTKTGEGAYASAP255256LLDDIAAVQKLYGAN270271METRAGDTVYGFNST285286ADRDYYSATSATDKL300301IFSVWDGGGNDTLDF315316SGFSQNQKINLAAGS330331FSDVGGMTGNVSIAQ345346GVTIENAIGGSGNDL360361LLGNAASNILKGGAG375376NDIIYGGGGADKLWG390391GSGSDTFVYREVSDS405406TPKAADTLMDFQTGL420421DKIDLTGITHLSGLN435436FVNAFTGQAGDAVVS450451YNQASNAGSLQVDFS465466GHGVADFLITTVGQV480481ATYDIVA＊GCR＊TG全文摘要本發(fā)明涉及海洋細菌新型低溫堿性蛋白酶MP，通過現代克隆技術PCR、DNAShuffing、RAISE等方法克隆產自海洋細菌新型低溫堿性蛋白酶的基因序列，其N端有17個氨基酸的信號肽序列，中間有保守的Zn2+和Ca2+結合位點，1482bp的基因序列，該新型低溫堿性蛋白酶MP，在洗滌、醫(yī)藥等領域有廣泛應用前途。文檔編號C12N9/52GK101691565SQ20091017730公開日2010年4月7日申請日期2009年9月29日優(yōu)先權日2009年9月29日發(fā)明者劉均忠,孫謐,王偉,王芳,郝建華申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所