專利名稱：一種海洋細菌生物農(nóng)藥生產(chǎn)菌株選優(yōu)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥制備技術(shù)，具體是一種海洋細菌生物農(nóng)藥生產(chǎn)菌株選優(yōu)的方法。
現(xiàn)有技術(shù)中，生物農(nóng)藥的制備分為兩種類型。一是農(nóng)用抗菌素(放線菌等產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物)，二是農(nóng)用殺蟲劑(蘇云金桿菌的活性孢子、半孢晶體)。農(nóng)用抗菌素生物農(nóng)藥的制備，常用菌種活化后，進行深層發(fā)酵培養(yǎng)，而后板框過濾除去菌絲體，發(fā)酵液經(jīng)減壓真空濃縮后，制備成品；農(nóng)用殺蟲劑生物農(nóng)藥的制備，菌種活化后，或用深層發(fā)酵法濃縮活性孢子，或用固體發(fā)酵法增殖活性孢子，而后制備成產(chǎn)品，不論那一種生物農(nóng)藥制備方式，其首要問題是生產(chǎn)菌株的選優(yōu)，高產(chǎn)優(yōu)良生產(chǎn)菌株的獲得，是生物農(nóng)藥制備的關(guān)鍵，常規(guī)生產(chǎn)菌株活化，手續(xù)煩瑣，選擇時無明顯標記，傳代活化后仍很難保護優(yōu)良菌株的高產(chǎn)，優(yōu)質(zhì)農(nóng)用抗菌素的特性，因此在生產(chǎn)應(yīng)用時，有時往往會出現(xiàn)發(fā)酵水平的不穩(wěn)定。
為了克服上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單易行，結(jié)果準確可靠，生產(chǎn)成本較低，生產(chǎn)菌株活化復(fù)壯效果好的海洋細菌生物農(nóng)藥生產(chǎn)菌株選優(yōu)的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是在如下兩個常規(guī)步驟中添加NaCl和探針，具體為①在活化培養(yǎng)海洋細菌生物農(nóng)藥優(yōu)良生產(chǎn)菌株的基質(zhì)中添加NaCl和探針，在瓊脂平板上分離活化后，挑選出脫氧核糖核酸高表達特征單菌落純的純培養(yǎng)物，并移接到斜面上培養(yǎng)活化；②在模擬生產(chǎn)用的培養(yǎng)基與發(fā)酵工程工藝的搖瓶發(fā)酵試驗中，再加入NaCl和探針進行調(diào)控；所述NaCl添加量為基質(zhì)的20～40‰；所述探針添加量為基質(zhì)的1～10ppm。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1．操作簡便，結(jié)果準確可靠，高活性生產(chǎn)菌株活化復(fù)壯效率高。采用本發(fā)明，可獲得高活性生產(chǎn)菌種的優(yōu)良菌株，可使海洋細菌生物農(nóng)藥制備的成功率幾乎達到100％，發(fā)酵損失倒罐率有可能降低到1％以下。
2．工作效率高，經(jīng)濟效益大。本發(fā)明應(yīng)用BAC探針技術(shù)選優(yōu)高產(chǎn)菌株的檢出，發(fā)酵工程工藝模擬的調(diào)控試驗，工作效率高，相對經(jīng)濟效益明顯，與常規(guī)方法比較，工作效率提高約200％，經(jīng)濟效益翻一番。
3．應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明原則上可應(yīng)用到各行業(yè)的微生物發(fā)酵工程中有關(guān)制備工序中高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)菌株的選優(yōu)，特別適用于海洋細菌生物農(nóng)藥生產(chǎn)菌株的選優(yōu)。
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
實施例1本發(fā)明可按以下步驟操作1．瓊脂平板稀釋與影印技術(shù)相結(jié)合的定向檢出采用9912海洋細菌1000g培養(yǎng)基制備瓊脂、倒平板(平皿)，冷卻后備用，對保存的生產(chǎn)菌株分別做10-5、10-6、10-7稀釋度的菌懸液，涂平板(平皿)，然后按常規(guī)培養(yǎng)溫度(28℃)進行恒溫培養(yǎng)48h，將培養(yǎng)好的平板(平皿)，選其中出現(xiàn)單菌落數(shù)在50個的平板，添加NaCl40g，添加探針0.01g，應(yīng)用微生物遺傳學(xué)上通用影印技術(shù)，對好菌落在皿中的坐標位置，影印到另一個加有NaCl和探針基質(zhì)的瓊脂平板上，然后再放入到28℃恒溫箱中培養(yǎng)48h，取出，挑選出具有特征性的單菌落(或具有特征性的色澤，或具有特征性的形態(tài)，或具有特征性的透明環(huán))，進行編號，移入斜面中，28℃保溫培養(yǎng)48h后，放冰箱(10℃)中保存?zhèn)溆?，?jīng)驗證達標高產(chǎn)優(yōu)良菌株的檢出率占總量的20％以上；
2．搖瓶試驗采用模擬生產(chǎn)工藝培養(yǎng)基質(zhì)的配方與發(fā)酵條件，在500ml三角瓶中分裝培養(yǎng)基50ml(如用250ml三角瓶中分裝時，則只裝25ml)，這種搖瓶培養(yǎng)基中加有20g NaCl，并添加有0.01g探針基質(zhì)，按常規(guī)搖瓶培養(yǎng)方法工序進行消毒滅菌，在旋轉(zhuǎn)式搖床中保溫培養(yǎng)24h(120～160r.p.m)，取出，發(fā)酵液經(jīng)20000r.p.m冷凍高速離心機離心5分鐘，棄沉淀、取濾液，控海洋細菌生物農(nóng)藥(農(nóng)用抗菌素)測定方法檢測，達標高產(chǎn)生物農(nóng)藥(農(nóng)用抗菌素)的發(fā)酵成功率在90％以上。
在添加NaCl的高滲條件選擇上，由于海洋細菌多生活在20～40‰ NaCl的海水環(huán)境中，故需模擬此特點，以提高優(yōu)良生產(chǎn)菌株的檢出率，若采用小于20‰ NaCl濃度雜菌入選機會就多，采用大于40‰ NaCl濃度，所需檢出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的目的菌株，往往生長不好或不生長，所以高滲條件的選擇十分重要，以選擇20～40‰ NaCl濃度范圍內(nèi)最為理想，探針的添加量以1～10ppm最為理想，這樣的高滲探針的綜合效果就高。
所述探針采用中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所釣取的海洋細菌高產(chǎn)生物農(nóng)藥菌株優(yōu)選用BAC探針。
實施例2本發(fā)明可按以下步驟操作1．瓊脂平板稀釋與影印技術(shù)相結(jié)合的定向檢出采用9601海洋細菌1000g培養(yǎng)基制備瓊脂、倒平板(平皿)，冷卻后備用，對保存的生產(chǎn)菌株分別做10-5、10-6、10-7稀釋度的菌懸液，涂平板(平皿)，然后按常規(guī)培養(yǎng)溫度(28℃)進行恒溫培養(yǎng)48h，將培養(yǎng)好的平板(平皿)，選其中出現(xiàn)單菌落數(shù)在10個的平板，添加NaCl 20g，添加探針0.001g，應(yīng)用微生物遺傳學(xué)上通用影印技術(shù)，對好菌落在皿中的坐標位置，影印到另一個加有NaCl和探針基質(zhì)的瓊脂平板上，然后再放入到28℃恒溫箱中培養(yǎng)48h，取出，挑選出具有特征性的單菌落(或具有特征性的色澤，或具有特征性的形態(tài)，或具有特征性的透明環(huán))，進行編號，移入斜面中，28℃保溫培養(yǎng)48h后，放冰箱(4℃)中保存?zhèn)溆?，?jīng)驗證達標高產(chǎn)優(yōu)良菌株的檢出率占總量的20％以上；2．搖瓶試驗采用模擬生產(chǎn)工藝培養(yǎng)基質(zhì)的配方與發(fā)酵條件，在500ml三角瓶中分裝培養(yǎng)基50ml(如用250ml三角瓶中分裝時，則只裝25ml)，這種搖瓶培養(yǎng)基中加有20g NaCl，并添加有0.01g探針基質(zhì)，按常規(guī)搖瓶培養(yǎng)方法工序進行消毒滅菌，在旋轉(zhuǎn)式搖床中保溫培養(yǎng)24h(120～160r.p.m)，取出，發(fā)酵液經(jīng)20000r.p.m冷凍高速離心機離心5分鐘，棄沉淀、取濾液，控海洋細菌生物農(nóng)藥(農(nóng)用抗菌素)測定方法檢測，達標高產(chǎn)生物農(nóng)藥(農(nóng)用抗菌素)的發(fā)酵成功率在90％以上。
實施例3本發(fā)明可按以下步驟操作1．瓊脂平板稀釋與影印技術(shù)相結(jié)合的定向檢出采用9602海洋細菌1000g培養(yǎng)基制備瓊脂、倒平板(平皿)，冷卻后備用，對保存的生產(chǎn)菌株分別做10-5、10-6、10-7稀釋度的菌懸液，涂平板(平皿)，然后按常規(guī)培養(yǎng)溫度(28℃)進行恒溫培養(yǎng)48h，將培養(yǎng)好的平板(平皿)，選其中出現(xiàn)單菌落數(shù)在30個的平板，添加NaCl 30g，添加探針0.005g，應(yīng)用微生物遺傳學(xué)上通用影印技術(shù)，對好菌落在皿中的坐標位置，影印到另一個加有NaCl和探針基質(zhì)的瓊脂平板上，然后再放入到28℃恒溫箱中培養(yǎng)48h，取出，挑選出具有特征性的單菌落(或具有特征性的色澤，或具有特征性的形態(tài)，或具有特征性的透明環(huán))，進行編號，移入斜面中，28℃保溫培養(yǎng)48h后，放冰箱(2℃)中保存?zhèn)溆?，?jīng)驗證達標高產(chǎn)優(yōu)良菌株的檢出率占總量的20％以上；2．搖瓶試驗采用模擬生產(chǎn)工藝培養(yǎng)基質(zhì)的配方與發(fā)酵條件，在500ml三角瓶中分裝培養(yǎng)基50ml(如用250ml三角瓶中分裝時，則只裝25ml)，這種搖瓶培養(yǎng)基中加20g Nacl，并添加有0.01g探針基質(zhì)，按常規(guī)搖瓶培養(yǎng)方法工序進行消毒滅菌，在旋轉(zhuǎn)式搖床中保溫培養(yǎng)24h(120～160r.p.m)，取出，發(fā)酵液經(jīng)20000r.p.m冷凍高速離心機離心5分鐘，棄沉淀、取濾液，控海洋細菌生物農(nóng)藥(農(nóng)用抗菌素)測定方法檢測，達標高產(chǎn)生物農(nóng)藥(農(nóng)用抗菌素)的發(fā)酵成功率在90％以上。
權(quán)利要求
1．一種海洋細菌生物農(nóng)藥生產(chǎn)菌株選優(yōu)的方法，其特征在于在如下兩個常規(guī)步驟中添加NaCl和探針，具體為①在活化培養(yǎng)海洋細菌生物農(nóng)藥優(yōu)良生產(chǎn)菌株的基質(zhì)中添加NaCl和探針，在瓊脂平板上分離活化后，挑選出脫氧核糖核酸高表達特征單菌落純的純培養(yǎng)物，并移接到斜面上培養(yǎng)活化；②在模擬生產(chǎn)用的培養(yǎng)基與發(fā)酵工程工藝的搖瓶發(fā)酵試驗中，再加入NaCl和探針進行調(diào)控。
2．按照權(quán)利要求1所述海洋細菌生物農(nóng)藥生產(chǎn)菌株選優(yōu)的方法，其特征在于所述NaCl添加量為基質(zhì)的20～40‰。
3．按照權(quán)利要求1所述海洋細菌生物農(nóng)藥生產(chǎn)菌株選優(yōu)的方法，其特征在于所述探針添加量為基質(zhì)的1～10ppm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海洋細菌生物農(nóng)藥生產(chǎn)菌株選優(yōu)的方法。是在如下兩個常規(guī)步驟中添加Nacl和探針,具體為①在活化培養(yǎng)海洋細菌生物農(nóng)藥優(yōu)良生產(chǎn)菌株的基質(zhì)中添加NaCl和探針,在瓊脂平板上分離活化后,挑選出脫氧核糖核酸高表達特征單菌落純的純培養(yǎng)物,并移接到斜面上培養(yǎng)活化;②在模擬生產(chǎn)用的培養(yǎng)基與發(fā)酵工程工藝的搖瓶發(fā)酵試驗中,再加入NaCl和探針進行調(diào)控;NaCl添加量為基質(zhì)的20～40%;探針添加量為基質(zhì)的1—10ppm。本發(fā)明操作簡單,結(jié)果準確,成本低,菌株活化復(fù)壯效果好。
文檔編號A01N63/00GK1301812SQ9912268
公開日2001年7月4日 申請日期1999年12月29日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月29日
發(fā)明者王書錦, 薛德林, 胡江春, 馬成新, 劉全永 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所