專利名稱：：利用PhotobacteriumleiognathiYL菌株檢測環(huán)境污染物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種微生物，特別是涉及一株可用于環(huán)境污染物檢測的海洋發(fā)光細菌Photobacteriumleiognathi菌株。
背景技術：
：據(jù)本發(fā)明人通過查閱資料、文獻檢索所知，目前已知的海洋發(fā)光細菌只有三屬，分別是弧菌屬(Vibrio),明亮發(fā)光菌屬(Photobacterium)，及希瓦氏菌屬(Shewanella)，陸地上則有異短桿菌屬(Xenorhabdus)。在有氧的自然環(huán)境下，發(fā)光細菌可產生熒光素酶(LE)，催化黃素單核苷酸(FMNH2)及長鏈脂肪醛類發(fā)生氧化反應，而發(fā)出藍綠色的熒光。目前在我國應用較廣的是明亮發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)，利用明亮發(fā)光桿菌進行環(huán)境污染物檢測的研究有所報道。而除了明亮發(fā)光桿菌以外，均沒有利用其他種屬的發(fā)光細菌進行環(huán)境污染物檢測的報道。本發(fā)明中涉及的菌種鰒發(fā)光桿菌(Photobacteriumleiognathi)與明亮發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)為同屬異種，在菌體形態(tài)特征、生理生化特征及16SrDNA序列上二者均有很大差異。但該菌株PhotobacteriumleiognathiYL表現(xiàn)出穩(wěn)定的發(fā)光性能，對環(huán)境污染物敏感，作為環(huán)境污染物的指示菌，可以用于環(huán)境污染物的檢測。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一株來源于海洋環(huán)境的發(fā)光細菌菌株PhotobacteriumleiognathiYL(鰒發(fā)光桿菌YL)以及利用該菌株進行環(huán)境污染物的定量檢測。本發(fā)明分離純化出一株來源于海洋環(huán)境的發(fā)光細菌YL，該菌種為革蘭氏陰性菌，桿狀(附圖1)。結合16SrDNA測序結果構建的系統(tǒng)發(fā)育樹(附圖2)和生理生化結果(表1)，發(fā)光細菌YL被鑒定為鰒發(fā)光桿菌(Photobacteriumleiognathi)。該菌株于2006年12月27日委托中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏號為M206139。該菌株的16SrDNA基因序列已經提交GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫，存取號為EF017227。該菌株具有發(fā)光特性，能夠用來檢測環(huán)境污染物。該菌株具有生長快、發(fā)光性能穩(wěn)定、對營養(yǎng)要求低、對環(huán)境污染物敏感等特點，熒光掃描確定該發(fā)光細菌的發(fā)光強度在474nm形成最大峰。多種受試環(huán)境污染物的濃度與污染物對該菌株PhotobacteriumleiognathiYL發(fā)光強度抑制率呈正比，能夠實現(xiàn)對受試環(huán)境污染物的定量檢測。利用本菌株檢測環(huán)境污染物具有成本低、操作簡便、靈敏度高等特點，能夠滿足多種污染物的快速檢測的需要。附圖1發(fā)光細菌YL掃描電鏡照片。附圖2根據(jù)細菌16SrDNA序列分析結果構建的系統(tǒng)發(fā)育樹，括號內為該菌株在GenBank中的收錄號，分支上的數(shù)字代表置信度。附圖3發(fā)光細菌YL的發(fā)光光譜圖。附圖4Zn"濃度與發(fā)光細菌YL發(fā)光抑制率的線性關系圖。附圖5Cu"濃度與發(fā)光細菌YL發(fā)光抑制率的線性關系圖。附圖6Pb2—濃度與發(fā)光細菌YL發(fā)光抑制率的線性關系圖。附圖7氯霉素濃度與發(fā)光細菌YL發(fā)光抑制率的線性關系圖。具體實施方式實施例1從青島近海捕得常見海產品，包括魷魚、對蟲下、黃魚、黑頭魚、安康魚等。將各種水產品分割成小塊置于固體培養(yǎng)基平板內，在隔水式恒溫培養(yǎng)箱25t:恒溫培養(yǎng)10h，暗室觀察發(fā)光情況。標記發(fā)光的菌落，進行平板劃線培養(yǎng)。經過多次分離純化，得到發(fā)光細菌YL。實施例2取發(fā)光細菌YL單菌落接種于100ml液體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基組成蛋白胨5g、酵母膏l(xiāng)g、FeP040.lg、NaCl20g、甘油3ml、蒸餾水1000ml)，27。C搖床培養(yǎng)8hr使菌體達到對數(shù)生長末期。取5ml不同濃度的重金屬鋅溶液加入到5ml菌液中，27。C搖床培養(yǎng)反應20min。反應完畢后，于微弱發(fā)光測量儀中測量發(fā)光值，測量時間為50s，結果取平均值。從測定結果可知抑制率和Zn"濃度成正比(圖4)，因而在進行食品或環(huán)境中該種污染物的測定時，可根據(jù)抑制率推測出污染物的含量。實施例3取發(fā)光細菌YL單菌落接種于100ml液體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基組成蛋白胨5g、酵母膏l(xiāng)g、FeP040.lg、NaCl20g、甘油3ml、蒸餾水1000ml)，27。C搖床培養(yǎng)8hr使菌體達到對數(shù)生長末期。取5ml不同濃度的重金屬銅溶液加入到5ml菌液中，27。C搖床培養(yǎng)反應20min。反應完畢后，于微弱發(fā)光測量儀中測量發(fā)光值，測量時間為50s，結果取平均值。從測定結果可知抑制率和Cu2+的濃度成正比(圖5)，因而在進行食品或環(huán)境中該種污染物的測定時，可根據(jù)抑制率推測出污染物的含量。實施例4取發(fā)光細菌YL單菌落接種于100ml液體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基組成蛋白胨5g、酵母膏l(xiāng)g、FeP040.lg、NaCl20g、甘油3ml、蒸餾水1000ml)，27。C搖床培養(yǎng)8hr使菌體達到對數(shù)生長末期。取5ml不同濃度的重金屬鉛溶液加入到5ml菌液中，27。C搖床培養(yǎng)反應20min。反應完畢后，于微弱發(fā)光測量儀中測量發(fā)光值，測量時間為50s，結果取平均值。從測定結果可知抑制率和Pb2+的濃度成正比(圖6)，因而在進行食品或環(huán)境中該種污染物的測定時，可根據(jù)抑制率推測出污染物的含量。實施例5取發(fā)光細菌YL單菌落接種于100ml液體培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基組成蛋白胨5g、酵母膏l(xiāng)g、FeP040.lg、NaCl20g、甘油3ml、蒸餾水1000ml)，27。C搖床培養(yǎng)6hr使菌體達到對數(shù)生長初期。取5ml不同濃度的氯霉素溶液加入到5ml菌液中，27。C搖床培養(yǎng)反應20min。反應完畢后，于微弱發(fā)光測量儀中測量發(fā)光值，測量時間為50s，結果取平均值。從測定結果可知抑制率和氯霉素的濃度成正比(圖6)，因而在進行食品或環(huán)境中該種污染物的測定時，可根據(jù)抑制率推測出污染物的含量。表1YL與其他相近菌種的生理生化特征比較<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>[OO31]注"+"表示所有菌株為正反應，"-"表示所有的菌株為負反應，數(shù)值說明正反應菌株的百分數(shù)。"+"表示直的桿菌，"-"表示彎的桿菌。+++++++++10+++90+—+—++++75+++—++—++++++1050—++'98++++++++++++++—+++++++25_+—_++—55——47_—+—一++—+++++—9$+—++30+++形成3—羥基丁酮和/或二乙酰生長在4'C30°C35°C>40°C形成淀粉酶明膠酶脂酶幾丁質酶海藻酸酶利用D—核糖L一阿拉伯糖D—葡萄糖D—甘露糖D—半乳糖D-果糖蔗糖海藻糖麥芽糖纖維二糖水楊苷酸甘露醇甘油甘氨酸L一亮氨酸L一絲氨酸L一蘇氨酸琥珀酸+++一III++I+I++++Il+ll+lIII1+1糖酸酸酸酸萄乙丙己壬葡權利要求一種能定量檢測環(huán)境污染物的鰒發(fā)光細菌PhotobacteriumleiognathiYL菌株，其保藏號為CCTCCM206139。2.權利要求1所述的菌株在環(huán)境污染物檢測中的應用。全文摘要本發(fā)明的目的是提供一株來源于海洋環(huán)境的鰒發(fā)光細菌PhotobacteriumleiognathiYL以及利用該菌株進行環(huán)境污染物的定量檢測。本發(fā)明分離純化出一株來源于海洋環(huán)境的發(fā)光細菌YL，該菌種為革蘭氏陰性菌，桿狀。結合根據(jù)16SrDNA測序結果構建的系統(tǒng)發(fā)育樹和生理生化結果，發(fā)光細菌YL被鑒定為鰒發(fā)光桿菌(Photobacteriumleiognathi)。保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為M206139。該發(fā)光細菌的16SrDNA基因序列已經提交GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫，存取號為EF017227。該菌株具有生長快、發(fā)光性能穩(wěn)定、對營養(yǎng)要求低、對環(huán)境污染物敏感等特點，熒光掃描確定該發(fā)光細菌的發(fā)光強度在474nm形成最大峰。發(fā)光強度抑制率與多種受試環(huán)境污染物的濃度呈正比，能夠實現(xiàn)對受試環(huán)境污染物的定量檢測。利用本菌株檢測環(huán)境污染物具有成本低、操作簡便、靈敏度高等特點，能夠滿足污染物的快速檢測的需要。文檔編號C12R1/01GK101712936SQ20081015762公開日2010年5月26日申請日期2008年10月6日優(yōu)先權日2008年10月6日發(fā)明者朱蘭蘭,林洪,王亞群,王靜雪申請人:中國海洋大學