一種溶藻弧菌、副溶血性弧菌及創(chuàng)傷弧菌多重降落pcr檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[cool] 本發(fā)明涉及一種可快速特異檢測(cè)溶藻弧菌(⑶、副溶血性弧菌m及創(chuàng)傷弧菌m的多重降落PCR試劑盒及方法，具體是一種可快速特異檢測(cè)溶藻弧菌(?)、副溶血性弧菌m及創(chuàng)傷弧菌m的多重降落PCR試劑盒和使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]弧菌是一類可引起腸道感染的細(xì)菌，它會(huì)引發(fā)腸胃炎和霍亂等疾病?；【鷮?gòu)V泛分布河口、海灣、近岸海域的海水和海洋動(dòng)物體內(nèi)。同時(shí)也是引起海水養(yǎng)殖動(dòng)物細(xì)菌性疾病的最重要的病原菌之一，大量的研究和生產(chǎn)實(shí)踐表明，弧菌病就是由弧菌屬細(xì)菌引起的一類細(xì)菌性疾病，流行廣，發(fā)病率高。主要的病原弧菌有溶藻弧菌(吻)、副溶血性弧菌m及創(chuàng)傷弧菌m等十多種弧菌。
[0003]溶藻弧菌海水中常見嗜鹽性弧菌，1973年開始明確對(duì)人類致病，易污染食物，引起腹瀉及創(chuàng)傷部位感染。
[0004]副溶血性弧菌是一種海洋細(xì)菌，主要來(lái)源于魚、蝦、蟹、貝類和海藻等海產(chǎn)品。進(jìn)食被副溶血性弧菌污染的食物后10小時(shí)左右出現(xiàn)上腹部陣發(fā)性絞痛、腹瀉，多數(shù)患者在腹瀉后出現(xiàn)惡心、嘔吐，腹瀉多為水樣便，重者為黏液便和黏血便。嘔吐、腹瀉嚴(yán)重，失水過(guò)多者可引起虛脫并伴有血壓下降。大部分病人發(fā)病后2~3天恢復(fù)正常，少數(shù)嚴(yán)重病人由于休克、昏迷而死亡。
[0005]創(chuàng)傷弧菌(Vibr1 vulnificus)的感染造成臨床上的病癥有兩種，即原發(fā)性敗血癥和嚴(yán)重的窗口感染，也可導(dǎo)致壞死性胃腸炎、腦膜炎、肺炎、眼角膜炎等疾病。敗血癥多與生食含菌的牡蠣等貝類海產(chǎn)品有關(guān)，尤其好發(fā)于肝硬化、血色素沉著癥、地中海貧血等體內(nèi)荷鐵量過(guò)多的人群中，病死率超過(guò)50%。皮膚創(chuàng)口受海水中的創(chuàng)傷弧菌感染，常導(dǎo)致嚴(yán)重的組織壞死。
[0006]目前，多重PCR主要應(yīng)用于可引起人類疾病的弧菌檢測(cè)，如食品檢測(cè)等，而在水產(chǎn)動(dòng)物弧菌基本上都是沿用普通PCR方法，一次只能檢測(cè)一種弧菌，檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)且常常造成漏檢或誤檢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有的技術(shù)所存在的PCR方法檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物弧菌病致病菌，一次性只能檢測(cè)一種弧菌，檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)，且造成漏檢或誤檢現(xiàn)象的問(wèn)題。提供一種可以同時(shí)檢測(cè)多種弧菌致病菌檢測(cè)的多重PCR方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
一種可同時(shí)檢測(cè)溶藻弧菌(吻)、副溶血性弧菌m及創(chuàng)傷弧菌(m的多重PCR檢測(cè)方法，其特征在于依次按如下步驟進(jìn)行:
(一)適量待檢樣本(奠便、培養(yǎng)物或環(huán)境樣品)于0.5ml堿性蛋白胨水中37°C培養(yǎng)6h，取液體300μ1，4000rmp離心，留取沉淀加入50μ1無(wú)菌水，震蕩15秒鐘，置100°C沸水中煮沸l(wèi)Omin，冰上放置3?5分鐘，I, 3000轉(zhuǎn)離心5分鐘，取上清液約30μ1即為DNA提取液。
[0009](二)多重降落PCR所需的引物:
VAtoxR-V:5’ - CAACTCATTTGTTCAGTGGAACGC -3’ (SEQ ID N0.1)
VA toxR-R:5> - TACRCAAAYAGGAAGCAGYAGAG -3’ (SEQ ID N0.2)
VPcol-V:5’ - GTAGTACGCTTCCGCAAGATTG -3’(SEQ ID N0.3)
VP col-R:5’ - CAAGCTTCCGCGTCAAAATCTAC -3’ (SEQ ID N0.4)
VV WhA-V:5’ - GTTTTACTCCTGACGCCAAAATTGTC -3’ (SEQ ID N0.5)
VV vvhA-R:5’ - GCGAATACGTTGTTTCACAGTACTG -3’ (SEQ ID N0.6)
化納參-F: 5，- CAGCAGCCGCGGTAATACG -3，(SEQ ID N0.7)
化納參-R: 5，- GCTCGTTGCGGGACTTAACC -3，(SEQ ID N0.8)
(三)多重降落PCR法擴(kuò)增檢測(cè)待檢樣本DNA中的.ο說(shuō)VPcoUVVvvhA^W 7_參基因，具體步驟如下:
反應(yīng)體系:25 μ?
緩沖液(10 X PCR)2.5 μ?
VA toxR-V (10 Mmol/L)0.2 μ?
VAtoxR-R (10 Mmol/L)0.2 μ?
VP col -F (10 Mmol/L)0.4 μ?
VPcol -R (10 Mmol/L)0.4 μ?
VVvvM-F (10 Mmol/L)0.4 μ?
VVvvM-R (10 Mmol/L)0.4 μ?
16S -F (10 Mmol/L)0.4 μ?
16S-R (10 Mmol/L)0.4 μ?
MgCl2 (25 mM)1.5 μ?
dNTP(10 mM)2 μ?
Taq DNA 聚合酶(5 U/μΙ)0.2 μ?
DNA模板I μ?
ddH2015μ1
(四)PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)如下:
94 °C 8 min ； [94 °C 40s, 65 °C (每循環(huán)降低 0.5°C) 25 s, 72 °C I min，20 個(gè)循環(huán)];[94 °C 40s, 55 °C 25s, 72 °C I min, 20 個(gè)循環(huán)];72 °C 8 min。
[0010](五)電泳檢測(cè)鑒定:
對(duì)多重降落PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，如電泳圖中含有740 bp,598 bp,349bp和246 bp條帶，其中740 bp,349 bp和246 bp分別代表檢出創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌和溶藻弧菌，598 bp則代表提取出有效的模板。
[0011]有益效果:本發(fā)明所建立的多重降落PCR可克服常規(guī)培養(yǎng)的耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低等問(wèn)題，具有快速、簡(jiǎn)便、特異、靈敏度高等特征?？捎诋?dāng)天出檢測(cè)結(jié)果報(bào)告，可同時(shí)檢測(cè)3種臨床常見的海洋性弧菌，對(duì)創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌及溶藻弧菌的檢測(cè)下限分別為2X 13CFU/μΙ、5.3 X 104CFU/>1、6.6 X 104CFU/>1。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為建立的多重降落PCR的特異性檢測(cè)結(jié)果；
圖2為9例模擬樣品檢測(cè)結(jié)果；
圖3為10例臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0013]為了更好的理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明。
[0014]實(shí)施例1
(I)大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)、奚腸球菌(Enterococcus faecalis)、費(fèi)希爾弧菌(Vibr1 fischeri)、哈維氏弧菌(Vibr1harveyi)的DNA提取液為模板。
[0015](2)多重降落PCR所需的引物:
VAtoxR-V:5’ - CAACTCATTTGTTCAGTGGAACGC -3’ (SEQ ID N0.1)
VA toxR-R:5> - TACRCAAAYAGGAAGCAGYAGAG -3’ (SEQ ID N0.2)
VPcol-V:5’ - GTAGTACGCTTCCGCAAGATTG -3’(SEQ ID N0.3)
VP col-R:5’ - CAAGCTTCCGCGTCAAAATCTAC -3’ (SEQ ID N0.4)
VV WhA-V:5’ - GTTTTACTCCTGACGCCAAAATTGTC -3’ (SEQ ID N0.5)
VV vvhA-R:5’ - GCGAATACGTTGTTTCACAGTACTG -3’ (SEQ ID N0.6)
化納參-F: 5，- CAGCAGCCGCGGTAATACG -3，(SEQ ID N0.7)
化納參-R: 5，- GCTCGTTGCGGGACTTAACC -3，(SEQ ID N0.8)
(3)多重降落PCR法擴(kuò)增檢測(cè)待檢樣本DNA中的FA1H/koJ、FFvvM和MS'內(nèi)參基因，具體步驟如下:
反