一種檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的多重dpo-pcr引物組合及方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了兩組引物對，本發(fā)明還提供了所述的兩組引物對在檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌，或制備檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品中的應用；本發(fā)明同時還提供了含有該兩組引物對的試劑盒及應用，以及基于兩組引物對或試劑盒的檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的方法。經(jīng)實驗證明，本發(fā)明的兩組引物對特異性好、靈敏度高、檢測效率高，且基于該兩組引物對建立的副溶血弧菌和霍亂弧菌的多重DPO?PCR方法高通量、靈敏、準確和快速，為同時檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌提供了更有效的方法。
【專利說明】
一種檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的多重DPO-PCR引物組合及 方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領域，特別涉及檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的方法、引物及 試劑盒。
【背景技術】
[0002] 多重PCR是指在一個反應管內加入多對引物同時對多個靶基因進行擴增，可以實 現(xiàn)對樣品的高通量檢測，目前已經(jīng)被廣泛應用于轉基因物種的檢測。由于在PCR反應體系內 加入了多對引物，體系復雜，穩(wěn)定性不高，限制了其使用。D P 0 ( D u a I p r i m i n g oligonucleotide)引物技術的主要原理為其引物包含兩個各自獨立的特異性引物區(qū)域，5' 端序列由18-25個堿基組成并與靶基因序列配對，3'端序列由6-12個堿基用來引導PCR反應 的特異性延伸，這兩段獨立的特異性區(qū)域利用寡聚次黃嘌呤（In 〇Sine，I)進行連接，由于次 黃嘌呤比一般堿基的退火溫度低，在退火時寡聚次黃嘌呤形成類似泡狀的結構，從而使5' 和3'區(qū)域形兩個獨立功能的雙特異性引物結構，研究表明5'和3'引物區(qū)域中任何有3個及 以上堿基的錯配，PCR反應將不能進行，而且由于其特殊的結構，引物自身以及引物之間很 少形成二級結構且對退火溫度不敏感。該技術的優(yōu)點主要在于它對退火溫度等影響普通多 重PCR的關鍵因素不敏感，適用范圍廣，而且該技術特異性強，擴增效率高，為多重PCR技術 的應用提供了新的前景。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種靈敏、準確和快速的基于多重DPO-PCR技術 的可同時檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的方法，本發(fā)明還提供了用于該方法的特異性好、靈 敏度高、檢測效率高和適用范圍廣的兩組引物對，以及含有該兩組引物對的試劑盒及其應 用。
[0004] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明通過如下技術方案實現(xiàn)：
[0005] 本發(fā)明第一方面提供了兩組引物對，其中一組引物對包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列，另一組引物對包含SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的核苷酸序 列。
[0006] 本發(fā)明第二方面提供了所述的兩組引物對在檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂 弧菌，或制備檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品中的應用。
[0007] 在一優(yōu)選例中，所述檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌包括:檢測或輔助檢 測生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，以及檢測或輔助檢測病原菌是否為或候選為 副溶血弧菌和霍亂弧菌。
[0008] 在一優(yōu)選例中，所述制備檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品包括：制 備檢測或輔助檢測生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品，以及制備檢測或輔助 檢測病原菌為或候選為副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品。
[0009] 本發(fā)明第三方面提供了一種試劑盒，包括所述的兩組引物對。
[0010] 在一優(yōu)選例中，還包括PCR擴增試劑。
[0011] 在一優(yōu)選例中，所述PCR擴增試劑包括dNTPs、Mg2+、PCR反應緩沖液和Taq DNA聚合 酶中的至少一種。
[0012] 在一優(yōu)選例中，所述dNTPs、Mg2+、PCR反應緩沖液和Taq DNA聚合酶均來源于TaKaRa 公司的貨號為RR060A的試劑盒。
[0013]在一優(yōu)選例中，還包括DNA提取試劑盒。
[0014]在一優(yōu)選例中，所述DNA提取試劑盒包括來自天根生化科技有限公司貨號為DP302 的細菌基因組DNA提取試劑盒所包含的試劑。
[0015] 在一優(yōu)選例中，還包括陽性對照和陰性對照。
[0016] 本發(fā)明第四方面提供了所述的試劑盒在檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌， 或制備檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品中的應用。
[0017] 在一優(yōu)選例中，所述檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌包括:檢測或輔助檢 測生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，以及檢測或輔助檢測病原菌是否為或候選為 副溶血弧菌和霍亂弧菌。
[0018] 在一優(yōu)選例中，所述制備檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品包括：制 備檢測或輔助檢測生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品，以及制備檢測或輔助 檢測病原菌為或候選為副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品。
[0019] 本發(fā)明第五方面提供了一種檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的多重DPO-PCR方法，包括使用所述的兩組引物對或所述試劑盒的步驟。
[0020] 在一優(yōu)選例中，所述檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌包括:檢測或輔助檢 測生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，以及檢測或輔助檢測病原菌是否為或候選為 副溶血弧菌和霍亂弧菌。
[0021 ]在一優(yōu)選例中，包括如下步驟：
[0022] 1)多重 DPO-PCR 擴增
[0023] 以生物樣品或病原菌含有的DNA為模板與權利要求1所述的兩組引物對或權利要 求3-4中任一項所述試劑盒進行多重DPO-PCR擴增。
[0024] 2)根據(jù)多重DPO-PCR擴增的結果判斷生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌， 或病原菌是否為或候選為副溶血弧菌和霍亂弧菌。
[0025]在一優(yōu)選例中，在步驟1)之前還包括在生物樣品或病原菌中提取DNA的步驟。
[0026]在一優(yōu)選例中，所述在生物樣品或病原菌中提取DNA是采用天根生化科技有限公 司貨號為DP302的細菌基因組DNA提取試劑盒進行。
[0027]在一優(yōu)選例中，所述多重DPO-PCR擴增的結果判斷的標準為：
[0028]若所述多重DPO-PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物同時含有大小為463bp和307bp的片段， 則所述生物樣品同時感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，或病原菌為或候選為副溶血弧菌和霍亂 弧菌;若所述多重DPO-PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物只含有大小為307bp的片段，則所述生物樣 品感染副溶血弧菌且排除霍亂弧菌，或病原菌為或候選為副溶血弧菌且排除霍亂弧菌;若 所述多重DPO-PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物只含有大小為463bp的片段，則所述生物樣品感染霍 亂弧菌且排除副溶血弧菌，或病原菌為或候選為霍亂弧菌且排除副溶血弧菌;若所述多重 DPO-PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物未含有大小為463bp和307bp的片段，則所述生物樣品未感染 副溶血弧菌和霍亂弧菌，或病原菌不為或候選不為副溶血弧菌和霍亂弧菌。
[0029] 在一優(yōu)選例中，所述多重DPO-PCR擴增的反應體系如下： 模板 DNA SOng 兩組引物對 其中每條引物的終濃度均為0.2 pmol/L
[0030] Mix I 0.25 Mix 2 25 'uL ddH20 補足
[0031] 在一優(yōu)選例中，所述Mix I內含DNA聚合酶，Mix 2內含dNTPs、MgCl2、反應緩沖液。 [0032] 在一優(yōu)選例中，所述Mix 1和Mix 2均來自TaKaRa公司的貨號為RR060A試劑盒。 [0033] 在一優(yōu)選例中，所述多重DPO-PCR反應條件為:94°C 1分鐘；94°C30秒，退火溫度為 45 °C ~65 °C 90秒，72 °C 90秒，共40個循環(huán)；72 °C 10分鐘。
[0034] 在一優(yōu)選例中，所述退火溫度為60 °C。
[0035] 本發(fā)明第六方面提供了一種篩選副溶血弧菌和霍亂弧菌的系統(tǒng)，包括：
[0036] 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于提取所述生物樣品或病原菌中的核酸樣 本；
[0037]多重DPO-PCR擴增裝置，所述多重DPO-PCR擴增裝置與所述核酸提取裝置相連，適 用于采用權利要求1所述的兩組引物對或權利要求3-4中任一項所述試劑盒對所述核酸樣 本進行多重DPO-PCR擴增；以及
[0038] 判斷裝置，所述判斷裝置與所述多重DPO-PCR擴增裝置相連，以便基于多重DPO-PCR擴增的結果，判斷所述生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，或病原菌是否為或候 選為副溶血弧菌和霍亂弧菌。
[0039] 在一優(yōu)選例中，所述多重DPO-PCR擴增的反應體系如下： 核酸樣本 50 ng 兩組引物對 其中每條引物的終濃度均為0.2 fimol/L
[0040] Mix 1 0.25 μL. Mix 2 25 ^iL CidH2O 補足允50丨止。
[0041 ] 在一優(yōu)選例中，所述Mix 1內含DNA聚合酶，Mix 2內含dNTPs、MgCl2、反應緩沖液。 [0042] 在一優(yōu)選例中，所述Mix 1和Mix 2來自TaKaRa公司的貨號為RR060A試劑盒。
[0043] 在一優(yōu)選例中，所述多重DPO-PCR反應條件為:94°C 1分鐘；94°C30秒，退火溫度為 45 °C ~65 °C 90秒，72 °C 90秒，共40個循環(huán)；72 °C 10分鐘。
[0044] 在一優(yōu)選例中，所述退火溫度為60°C。
[0045] 本發(fā)明的生物樣品為血液、細胞、組織等，或混雜了血液、細胞、組織等的食物等 等;而病原菌則是一種純菌種或至少二種以上的菌種的混合。
[0046] 本發(fā)明的有益效果包括：
[0047] (1)本發(fā)明針對設計的多條多重DPO-PCR引物進行了大量篩選，綜合其特異性、靈 敏度、引物與引物之間的作用，以及所使用的各引物與多重DPO-PCR擴增試劑盒的適配性， 最終篩選出特異性好、靈敏度高、適用性廣且可同時檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的兩組引 物對。
[0048] (2)本發(fā)明針對在前述兩組引物對的基礎上建立了副溶血弧菌和霍亂弧菌的多重 DPO-PCR方法，可對副溶血弧菌和霍亂弧菌進行定性檢測，且特異性好、通量高、快速，提高 了檢測效率，為副溶血弧菌和霍亂弧菌的檢測提供了更有效的方法。
【附圖說明】
[0049 ]圖1為本發(fā)明實施例4中多重DPO-PCR引物組合的特異性試驗電泳檢測結果。其中M 為marker DL1000，1:陰性對照；2:副洛血弧囷和霍亂弧囷；3:副洛血弧囷；4:霍亂弧囷。 [0050]圖2為本發(fā)明實施例5中多重DPO-PCR引物組合的特異性試驗電泳檢測結果。其中M 為marker DL1000，1:陰性對照;2:陽性對照;3:副溶血弧菌;4:霍亂弧菌;5:溶藻弧菌;6:創(chuàng) 傷弧菌;7:擬態(tài)弧菌;8:美麗弧菌;9:河流弧菌；10:哈維氏弧菌；11:大腸桿菌；12:金黃色葡 萄球菌;13:沙門氏菌;14:單增李斯特菌。
[0051 ]圖3為本發(fā)明實施例6中多重DPO-PCR引物組合的靈敏度試驗電泳檢測結果。其中M 為marker DL1000，1-6:兩種弧菌模板量依次為100ng、10ng、lng、0 · lng、0 · Olng和0 · OOlng。
[0052] 圖4為本發(fā)明實施例7中多重DPO-PCR引物組合的退火溫度敏感實驗的電泳檢測結 果。其中M為marker DL100 0，1 -5:退火溫度分別為45 °C、50 °C、55 °C、60 °C 和65 °C。
【具體實施方式】
[0053] 除非特殊說明，本發(fā)明所用術語具有本發(fā)明所屬領域中的一般含義。
[0054] 下面參考具體實施例和附圖，對本發(fā)明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅 是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術或條件的，均按照常 規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual ,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。所用試劑或儀 器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0055] 以下實施例中使用的副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、美麗 弧菌、河流弧菌、哈維氏弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和單增李斯特菌均由湛 江出入境檢驗檢疫局提供。
[0056] 實施例1
[0057]本實施例提供了兩組引物對及其應用。
[0058] 兩組引物對的篩選方法為：針對副溶血弧菌col lagenase基因 （GenBank ID : AF326572.1)和霍亂弧菌ompW基因 （GenBank ID: X51948.1 )，設計了多條多重DPO-PCR引物 并進行了大量篩選，綜合其特異性、靈敏度、引物與引物之間的作用，以及所使用的各引物 與多重DPO-PCR擴增試劑盒的適配性，最終篩選出特異性好、重復性好且靈敏度高的如下可 同時檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的多重DPO-PCR引物組合（引物序列中的I為次黃嘌呤）：
[0059] VP-F：57-AGCGCAAGTCACAGAGAAAGTTGAIIIIIATCAGCA CGA-37(SEQ ID NO：1)；
[0060] VP-RiS7-CTTTGCCACGTTGTACATGTGGTIIIIITCAAACGCC G-37(SEQ ID N0：2)；
[0061] VC-FiS7-CGCTCCTGTATTTGCTCACCAAGIIIIIGACTTTATT GTG-37(SEQ ID N0：3)；
[0062] VC-R:5' -GAGCATATAATCAAAGCCAACGTTAIIIIIAAGTCC CCAT-3' (SEQ ID NO:4)。
[0063] 上述多重DPO-PCR引物由上海生工生物技術有限公司合成。
[0064] 利用上述多重DPO-PCR引物組合可同時針對副溶血弧菌和霍亂弧菌進行多重DPO-PCR擴增，得到的DPO-PCR擴增產(chǎn)物的大小分別為307bp和463bp。
[0065] 在應用上，上述兩組引物對可應用于檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌上， 例如檢測或輔助檢測生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，或檢測或輔助檢測病原菌 是否為或候選為副溶血弧菌和霍亂弧菌;還可以用來制備檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍 亂弧菌的產(chǎn)品，例如制備檢測或輔助檢測生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn) 品，或制備檢測或輔助檢測病原菌為或候選為副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品。
[0066] 實施例2
[0067] 本實施例提供了一種試劑盒及其應用，所述試劑盒包括：
[0068] (I)SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4(來自實施例 1);
[0069] (2)dNTPs、Mg2+、PCR反應緩沖液、Taq DNA聚合酶中的至少一種。
[0070] 上述dNTPs、Mg2+、PCR反應緩沖液、Taq DNA聚合酶優(yōu)選來源于TaKaRa公司的貨號為 RR060A的試劑盒。
[0071]進一步優(yōu)選包括DNA提取試劑盒，所述DNA提取試劑盒優(yōu)選來源于天根生化科技 (北京)有限公司貨號為DP302的細菌基因組DNA提取試劑盒。
[0072]進一步優(yōu)選包括陽性對照和陰性對照。
[0073] 實驗證明，上述細菌基因組DNA提取試劑盒、TaKaRa公司的貨號為RRO60A的試劑 盒，以及與SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4的聯(lián)合使用，效果更加 優(yōu)越，具體表現(xiàn)在特異性強、重復性好和靈敏度高。
[0074] 在應用上，上述試劑盒可應用于檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌上，例如 檢測或輔助檢測生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，或檢測或輔助檢測待測生物樣 品是否為或候選為副溶血弧菌和霍亂弧菌;還可以用來制備檢測或輔助檢測副溶血弧菌和 霍亂弧菌的產(chǎn)品，例如制備檢測或輔助檢測生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn) 品，或制備檢測或輔助檢測病原菌為或候選為副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品。
[0075] 實施例3
[0076]本實施例提供了一種檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的方法，例如檢測或 輔助檢測生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，或檢測或輔助檢測病原菌是否為或候 選為副溶血弧菌和霍亂弧菌，該方法使用了實施例1的兩組引物對或實施例2的試劑盒。 [0077]上述方法包括如下步驟：
[0078] 步驟一：多重DPO-PCR擴增
[0079]以生物樣品或病原菌的DNA為模板，采用兩組引物對進行多重DPO-PCR擴增，得到 多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物，同時設置空白對照(模板為超純水）。
[0080] 多重DPO-PCR反應體系如表1所示。其中，Mix 2內含dNTPs、MgCl2和反應緩沖液； Mix 1內含DNA聚合酶，Mix 2和Mix 1均來自TaKaRa公司的貨號為RR060A的試劑盒。
[0081] 表1
LUUB3J 多里UPO-PCK反應條仵：941:預雙性Imin;然后941:雙性30s，60XJ退火90s，72XJ延 伸90s，在此條件下進行40個循環(huán);最后72 °C再延伸IOmin。
[0084] 步驟二:多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測
[0085]多重DPO-PCR反應結束后，取5yL的多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳 檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結果并對擴增產(chǎn)物進行測序。
[0086]所述多重DPO-PCR擴增的結果判斷的標準為：
[0087]若所述多重DPO-PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物同時含有大小為463bp和307bp的片段， 則所述生物樣品同時感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，或病原菌為或候選為副溶血弧菌和霍亂 弧菌;若所述多重DPO-PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物只含有大小為307bp的片段，則所述生物樣 品感染副溶血弧菌且排除霍亂弧菌，或病原菌為或候選為副溶血弧菌且排除霍亂弧菌;若 所述多重DPO-PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物只含有大小為463bp的片段，則所述生物樣品感染霍 亂弧菌且排除副溶血弧菌，或病原菌為或候選為霍亂弧菌且排除副溶血弧菌;若所述多重 DPO-PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物未含有大小為463bp和307bp的片段，則所述生物樣品未感染 副溶血弧菌和霍亂弧菌，或病原菌不為或候選不為副溶血弧菌和霍亂弧菌。
[0088] 如果生物樣品或病原菌還未提取DNA，上述方法步驟（1)多重DPO-PCR擴增之前還 可以包括使用細菌基因組DNA提取試劑盒（購自天根生化科技（北京）有限公司，貨號為 DP302)按照試劑盒說明書對生物樣品或病原菌中的DNA進行提取的步驟。
[0089] 實施例4
[0090] 本實施例對實施例3建立的檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的方法進行了 有效性驗證，所用的供試材料如下:副溶血弧菌和霍亂弧菌。
[0091] 步驟一:基因組DNA的提取
[0092]采用天根生化科技(北京)有限公司的貨號為DP302的細菌基因組DNA提取試劑盒 按照試劑盒說明書分別提取副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA。
[0093] 步驟二：多重DPO-PCR擴增
[0094]采用陰性對照模板和各種基因組DNA模板：
[0095]組1以水為模板(陰性對照）；
[0096] 組2以副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA混合物為模板；
[0097] 組3以副溶血弧菌的基因組DNA為模板；
[0098] 組4以霍亂弧菌的基因組DNA為模板。
[0099]分別以組1-組4為模板，進行多重DPO-PCR擴增，多重DPO-PCR擴增的方法同實施例 3的步驟一。
[0100] 步驟三:多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測
[0101 ]多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測的方法同實施例3的步驟二。
[0102] 結果分析：
[0103] 結果如圖1所示，組1(陰性對照）的DPO-PCR擴增產(chǎn)物無條帶;組2(副溶血弧菌和霍 亂弧菌）的DPO-PCR擴增產(chǎn)物含有2個條帶，大小分別為307bp和463bp;組3 (副溶血弧菌）的 DPO-PCR擴增產(chǎn)物含有1個條帶，大小為307bp;組4(霍亂弧菌）的DPO-PCR擴增產(chǎn)物含有1個 條帶，大小為463bp。說明本發(fā)明的基于實施例1的兩組引物對和實施例2的試劑盒建立的檢 測或輔助副溶血弧菌和霍亂弧菌的方法可以有效檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌。
[0104] 實施例5
[0105] 本實施例對實施例1的兩組引物對進行了特異性驗證，所用的供試材料如下：副溶 血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、美麗弧菌、河流弧菌、哈維氏弧菌、大腸 桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和單增李斯特菌。
[0106] 步驟一:基因組DNA的提取
[0107]采用天根生化科技(北京)有限公司的貨號為DP302的細菌基因組DNA提取試劑盒 按照試劑盒說明書分別提取副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、美麗弧 菌、河流弧菌、哈維氏弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和單增李斯特菌的基因組 DNA0
[0108] 步驟二：多重DPO-PCR擴增
[0109] 采用陰性對照模板和各種基因組DNA模板：
[0110]組1以水為模板(陰性對照）。
[0111] 組2以副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA混合物為模板(陽性對照）。
[0112] 組3以副溶血弧菌的基因組DNA為模板。
[0113] 組4以霍亂弧菌的基因組DNA為模板。
[0114] 組5以溶藻弧菌的基因組DNA為模板。
[0115] 組6以創(chuàng)傷弧菌的基因組DNA為模板。
[0116] 組7以擬態(tài)弧菌的基因組DNA為模板。
[0117] 組8以美麗弧菌的基因組DNA為模板。
[0118] 組9以河流弧菌的基因組DNA為模板。
[0119] 組10以哈維氏弧菌的基因組DNA為模板。
[0120]組11以大腸桿菌的基因組DNA為模板。
[0121] 組12以金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板。
[0122] 組13以沙門氏菌的基因組DNA為模板
[0123] 組14以單增李斯特菌的基因組DNA為模板。
[0124] 分別以組1 -組14為模板，進行多重DPO-PCR擴增，多重DPO-PCR擴增的方法同實施 例3的步驟一。
[0125] 步驟三:多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測
[0126] 多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測的方法同實施例3的步驟二。
[0127] 結果分析：
[0128] 結果如圖2所示，從組3-組14中順利檢出組3的副溶血弧菌和組4霍亂弧菌，其余組 5-組14均無擴增，由此證明本發(fā)明實施例1的兩組引物對具有高特異性;進一步的，本發(fā)明 基于兩組引物對及試劑盒建立的檢測或輔助副溶血弧菌和霍亂弧菌的方法能夠準確的對 副溶血弧菌和霍亂弧菌進行檢測。
[0129] 實施例6
[0130] 本實施例對實施例1的兩組引物對進行了靈敏度驗證，所用的供試材料如下：副溶 血弧菌和霍亂弧菌。
[0131] 步驟一:基因組DNA的提取
[0132] 采用天根生化科技(北京)有限公司的貨號為DP302的細菌基因組DNA提取試劑盒 按照試劑盒說明書分別提取副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA，并將得到的基因組DNA進 行10倍稀釋，制備不同濃度的副溶血弧菌的基因組DNA和霍亂弧菌的基因組DNA的混合物。
[0133] 步驟二：多重DPO-PCR擴增
[0134] 采用不同濃度的副溶血弧菌的基因組DNA和霍亂弧菌的基因組DNA的混合物作為 模板：
[0135] 組1:以IOOngAxL的副溶血弧菌基因組DNA(IyL)和IOOngAxL的霍亂弧菌的基因組 DNA(IyL)為模板。
[0136] 組2:以IOngAxL的副溶血弧菌基因組DNA(IyL)和IOngAxL的霍亂弧菌的基因組DNA (IyL)為模板。
[0137] 組3:以Ing/yL的副溶血弧菌基因組DNA(IyL)和Ing/yL的霍亂弧菌的基因組DNA(1 yL)為模板。
[0138] 組4:以0.1 ngAxL的副溶血弧菌基因組DNA(IyL)和0.1 ngAxL的霍亂弧菌的基因組 DNA(IyL)為模板。
[0139] 組5:以0.OlngAxL的副溶血弧菌基因組DNA(IyL)和0.OlngAxL的霍亂弧菌的基因 組DNA(IyL)為模板。
[0140] 組6:以0.OOlngAxL的副溶血弧菌基因組DNA(IyL)和0.OOlngAxL的霍亂弧菌的基 因組DNA(IyL)為模板。
[0141] 分別以組1-組6為模板，進行多重DPO-PCR擴增，多重DPO-PCR擴增的方法同實施例 3的步驟一。
[0142] 步驟三:多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測
[0143] 多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測的方法同實施例3的步驟二。
[0144] 結果分析：
[0145] 結果如圖3所示，組1-4有條帶，說明本發(fā)明實施例1的兩組引物對具有較高的靈敏 度，可檢測出樣品中僅含有〇. Ing的微量DNA。
[0146] 實施例7
[0147] 本實施例提供了對實施例1的兩組引物對的退火溫度敏感性的檢測，包括如下步 驟：
[0148] 步驟一:基因組DNA的提取
[0149] 采用天根生化科技(北京)有限公司的貨號為DP302的細菌基因組DNA提取試劑盒 按照試劑盒說明書分別提取副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA，將副溶血弧菌和霍亂弧 菌的基因組DNA混合得到副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA混合物。
[0150] 步驟二：多重DPO-PCR擴增
[0151] 采用副溶血弧菌和霍亂弧菌的基因組DNA混合物進行多重DPO-PCR擴增，用不同的 退火溫度(45 °C、50 °C、55 °C、60 °C、65 °C)分別進行DPO-PCR擴增，其余反應條件同實施例3的 步驟一，分別得到多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物。
[0152] 步驟三:多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測
[0153 ]多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測的方法同實施例3的步驟二。
[0154] 結果分析：
[0155] 結果如圖4所示：電泳檢測結果顯示用不同的退火溫度(45°C、50°C、55°C、60°C、65 °C)進行多重DPO-PCR擴增得到的多重DPO-PCR擴增產(chǎn)物均含有大小為307bp和463bp的片 段，無非特異性擴增條帶，說明本發(fā)明的多重DPO-PCR引物對退火溫度不敏感。
[0156] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 兩組引物對，其特征在于，其中一組引物對包含SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示的 核苷酸序列，另一組引物對包含SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列。2. 根據(jù)權利要求1所述的兩組引物對在檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌，或制 備檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品中的應用； 任選的，所述檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌包括:檢測或輔助檢測生物樣品 是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，以及檢測或輔助檢測病原菌是否為或候選為副溶血弧菌 和霍亂弧菌； 任選的，所述制備檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品包括：制備檢測或輔 助檢測生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品，以及制備檢測或輔助檢測病原菌 為或候選為副溶血弧菌和霍亂弧菌的廣品。3. -種試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的兩組引物對。4. 根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括PCR擴增試劑； 任選的，所述PCR擴增試劑包括dNTPs、Mg2+、PCR反應緩沖液和Taq DNA聚合酶中的至少 一種； 任選的，所述dNTPs、Mg2+、PCR反應緩沖液和Taq DNA聚合酶均來源于TaKaRa公司的貨號 為RR060A的試劑盒； 任選的，還包括DNA提取試劑盒； 任選的，所述DNA提取試劑盒包括來自天根生化科技有限公司貨號為DP302的細菌基因 組DNA提取試劑盒所包含的試劑； 任選的，還包括陽性對照和陰性對照。5. 權利要求3或4所述的試劑盒在檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌，或制備檢測 或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品中的應用； 任選的，所述檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌包括:檢測或輔助檢測生物樣品 是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，以及檢測或輔助檢測病原菌是否為或候選為副溶血弧菌 和霍亂弧菌； 任選的，所述制備檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品包括：制備檢測或輔 助檢測生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌的產(chǎn)品，以及制備檢測或輔助檢測病原菌 為或候選為副溶血弧菌和霍亂弧菌的廣品。6. -種檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌的多重DP0-PCR方法，其特征在于，包括 使用權利要求1所述的兩組引物對或權利要求3-4中任一項所述試劑盒的步驟； 任選的，所述檢測或輔助檢測副溶血弧菌和霍亂弧菌包括:檢測或輔助檢測生物樣品 是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，以及檢測或輔助檢測病原菌是否為或候選為副溶血弧菌 和霍亂弧菌。7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于:包括如下步驟： 1) 多重DP0-PCR擴增 以生物樣品或病原菌含有的DNA為模板與權利要求1所述的兩組引物對或權利要求3-4 中任一項所述試劑盒進行多重DP0-PCR擴增； 2) 根據(jù)多重DP0-PCR擴增的結果判斷生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，或病 原菌是否為或候選為副溶血弧菌和霍亂弧菌； 任選的，在步驟1)之前還包括在生物樣品或病原菌中提取DNA的步驟； 任選的，所述在生物樣品或病原菌中提取DNA是采用天根生化科技有限公司貨號為 DP302的細菌基因組DNA提取試劑盒進行； 任選的，所述多重DPO-PCR擴增的結果判斷的標準為： 若所述多重DPO-PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物同時含有大小為463bp和307bp的片段，則所 述生物樣品同時感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，或病原菌為或候選為副溶血弧菌和霍亂弧 菌;若所述多重DPO-PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物只含有大小為307bp的片段，則所述生物樣品 感染副溶血弧菌且排除霍亂弧菌，或病原菌為或候選為副溶血弧菌且排除霍亂弧菌;若所 述多重DPO-PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物只含有大小為463bp的片段，則所述生物樣品感染霍亂 弧菌且排除副溶血弧菌，或病原菌為或候選為霍亂弧菌且排除副溶血弧菌；若所述多重 DPO-PCR擴增得到的擴增產(chǎn)物未含有大小為463bp和307bp的片段，則所述生物樣品未感染 副溶血弧菌和霍亂弧菌，或病原菌不為或候選不為副溶血弧菌和霍亂弧菌。8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于:所述多重DPO-PCR擴增的反應體系如下： 模板DNA 50 ng 兩組引物對 其中每條引物的終濃度均為0.2 μ mol/L Mix 1 0.25 μL^ Mix 2 25 μL ddH,(3 補足允50 pL; 任選的，所述Mix 1內含DNA聚合酶，Mix 2內含dNTPs、MgCl2、反應緩沖液； 任選的，所述Mix 1和Mix 2均來自TaKaRa公司的貨號為RR060A試劑盒； 任選的，所述多重DPO-PCR反應條件為:94°C 1分鐘；94°C 30秒，退火溫度為45 °C~65°C 90秒，72 °C 90秒，共40個循環(huán);72 °C 10分鐘； 任選的，所述退火溫度為60°C。9. 一種篩選副溶血弧菌和霍亂弧菌的系統(tǒng)，其特征在于，包括： 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于提取所述生物樣品或病原菌中的核酸樣本； 多重DP0-PCR擴增裝置，所述多重DP0-PCR擴增裝置與所述核酸提取裝置相連，適用于 采用權利要求1所述的兩組引物對或權利要求3-4中任一項所述試劑盒對所述核酸樣本進 行多重DP0-PCR擴增；以及 判斷裝置，所述判斷裝置與所述多重DP0-PCR擴增裝置相連，以便基于多重DP0-PCR擴 增的結果，判斷所述生物樣品是否感染副溶血弧菌和霍亂弧菌，或病原菌是否為或候選為 副溶血弧菌和霍亂弧菌。10. 根據(jù)權利要求9所述的系統(tǒng)，其特征在于： 所述多重DP0-PCR擴增的反應體系如下： 核酸樣本 50 ng 兩組引物對 其中每條引物的終濃度均為0.2 pmol/L Mix 1 0.25 pL Mix 2 uL ddH20 補足半50 μL; 任選的，所述Mix 1內含DNA聚合酶，Mix 2內含dNTPs、MgCl2、反應緩沖液； 任選的，所述Mix 1和Mix 2來自TaKaRa公司的貨號為RR060A試劑盒； 任選的，所述多重DP0-PCR反應條件為:94°C 1分鐘；94°C 30秒，退火溫度為45 °C~65°C 90秒，72 °C 90秒，共40個循環(huán);72 °C 10分鐘； 任選的，所述退火溫度為60°C。
【文檔編號】C12Q1/04GK105861499SQ201610414413
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】龍陽, 汪天杰, 魏霜, 馬新華, 袁俊杰, 張娜, 楊卓瑜, 楊勁, 丁秀瓊, 劉驍
【申請人】湛江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 中華人民共和國汕頭出入境檢驗檢疫局