弗尼斯弧菌檢測(cè)用引物對(duì)、試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】弗尼斯弧菌檢測(cè)用引物對(duì)、試劑盒及檢測(cè)方法。所述引物對(duì)堿基序列為SEQ?ID?NO.1/2。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了包含上述引物對(duì)的試劑盒及應(yīng)用上述引物對(duì)進(jìn)行PCR檢測(cè)的弗尼斯弧菌檢測(cè)方法。本發(fā)明的引物特異性強(qiáng)，檢測(cè)試劑盒及方法簡(jiǎn)便易用，結(jié)果準(zhǔn)確，具有很高的特異性和靈敏度。
【專利說(shuō)明】弗尼斯弧菌檢測(cè)用引物對(duì)、試劑盒及檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及食源性病原菌的快速檢測(cè)方法，尤其涉及利用PCR技術(shù)檢測(cè)樣品中弗尼斯弧菌的方法。還涉及檢測(cè)所使用的特異性引物序列和檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]弧菌作為近海河口環(huán)境中微生物區(qū)系的成員，廣泛分布于自然水域及漁業(yè)生物中，是引發(fā)人類細(xì)菌性疾病的主要病原菌之一。人們通過(guò)飲用不清潔水、食用未加工或未加工熟的帶有致病性弧菌的食物，特別是海產(chǎn)品容易感染發(fā)病?；【鷮僦谢魜y弧菌(Vibr1.cholerae)、副溶血性弧菌(Vibr1 parahaemolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibr1vulcificus)、河弧菌(Vibr1 fluvialis)、擬態(tài)弧菌(Vibr1 minicus)、麥?zhǔn)匣【?Vibr1metschnikovii)、霍利斯弧菌(Vibr1 hollisae)、溶藻弧菌(Vibr1 alginolyticus)、弗尼斯弧菌(Vibr1 furnissii)、海魚(yú)弧菌(Vibr1 damsela)、辛辛那提弧菌(Vibr1cincinatiensis)和S魚(yú)弧菌(Vibr1 carchariae) 12個(gè)種為人潛在腸道致病菌。由弗尼斯弧菌引起的急性胃腸炎首先發(fā)現(xiàn)于日本及東方一些國(guó)家，其后擴(kuò)散至西方國(guó)家，通常呈爆發(fā)流行或散發(fā)性急性胃腸炎。弗尼斯弧菌能產(chǎn)生腸毒素，為旅游者腹瀉的病原菌之一，臨床上以腹瀉及腹痛為主，并伴隨有惡心及嘔吐等癥狀，也有嚴(yán)重致死病例報(bào)。
[0003]快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)食品中致病菌是有效預(yù)防和控制病原菌感染的重要保障，但是目前國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的檢測(cè)方法中，對(duì)弗尼斯弧菌的檢測(cè)只有常規(guī)的病原菌分離培養(yǎng)法，該方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，無(wú)法滿足快速高通量檢測(cè)病原菌的要求；再加上弧菌屬細(xì)菌生化反應(yīng)相對(duì)不穩(wěn)定，給鑒定工作帶來(lái)了很多困難和不確定性，容易出現(xiàn)假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果，影響檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量，并且會(huì)帶來(lái)較大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們采用PCR技術(shù)應(yīng)用于細(xì)菌的快速診斷，該方法不僅敏感、準(zhǔn)確，而且快速、高通量，通過(guò)DNA提取、PCR擴(kuò)增、電泳觀察等分子生物學(xué)手段檢測(cè)病原菌的方法，但現(xiàn)有技術(shù)中還未見(jiàn)有針對(duì)弗尼斯弧菌檢測(cè)的PCR技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種可快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)食品和水產(chǎn)品樣品中弗尼斯弧菌的PCR檢測(cè)方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種弗尼斯弧菌檢測(cè)用引物對(duì)，其堿基序列為SEQ ID N0.1/2。
[0006]正向引物(SEQID N0.1):5/ -CAATCCAAGATGGTCACGCTAA-3'，
[0007]反向引物(SEQID N0.2):5/ -TTTATCCACCGCGTACAGCTT-3'。
[0008]另一方面，本發(fā)明提供一種弗尼斯弧菌檢測(cè)用試劑盒，所述試劑盒是PCR檢測(cè)試劑盒，其中包括堿基序列為SEQ ID N0.1/2的引物對(duì)。
[0009]作為優(yōu)選，該試劑盒中還包括用于PCR檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照模板，所述陽(yáng)性對(duì)照模板為濃度為lOnmol/L~lOOnmol/L的弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA提取物。所述試劑盒在檢測(cè)應(yīng)用中，可以使用其它任意非弗尼斯弧菌DNA提取物為陰性對(duì)照模板，并使用雙蒸水為空白對(duì)照。
[0010]本發(fā)明的再一目的在于提供一種弗尼斯弧菌的檢測(cè)方法，所述方法為PCR檢測(cè)方法，其包括以SEQ ID N0.1/2為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。
[0011]上述本發(fā)明的弗尼斯弧菌的檢測(cè)方法的檢測(cè)對(duì)象是食品和水產(chǎn)品樣品，目的在于檢查待測(cè)樣品中是否存在弗尼斯弧菌。該方法中，PCR擴(kuò)增以弗尼斯弧菌ToxS基因(GenBank登陸號(hào)CP002377.1)的112~261位的核酸序列為靶基因，以SEQ ID N0.1/2所示的引物對(duì)，通過(guò)PCR選擇性擴(kuò)增所述靶基因，并檢測(cè)確認(rèn)是否存在有擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0012]更為具體地，上述本發(fā)明的的的弗尼斯弧菌檢測(cè)方法，包括如下步驟:
[0013]⑴提取待測(cè)樣品DNA，得到模板液；
[0014](2) PCR 擴(kuò)增:
[0015]反應(yīng)體系:模板液2μ 1U0XPCR緩沖液2μ L、dNTP0.4μ L、Taq酶1U、濃度為10 μ M的引物對(duì)SEQ ID N0.1/2各0.5 μ L、補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為20 μ L ;以上各組分加入至0.2mL PCR反應(yīng)管中，混勻，5000r/min離心1s ；
[0016]反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性4min,然后 94°C lmin、59°C lmin、72°C lmin, 35 個(gè)循環(huán),最后72°C延伸10min，4°C保存；
[0017]⑶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè):
[0018]用電泳緩沖液制備I %瓊脂糖凝膠，取步驟⑵所制備的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6 μ L，與
Iμ L上樣緩沖液混合后點(diǎn)樣，用DNA分子量標(biāo)記物做參照；3V/cm~5V/cm恒壓電泳，電泳20min~40min,電泳檢測(cè)結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄并保存；
[0019]⑷結(jié)果判定:以弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽(yáng)性對(duì)照，以其它非弗尼斯菌株作為陰性對(duì)照，以滅菌雙蒸水為模版作為空白對(duì)照進(jìn)行步驟⑴~⑷的操作；
[0020]如待測(cè)樣品擴(kuò)增片斷大小與陽(yáng)性對(duì)照一致即可判定為陽(yáng)性，若樣品無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物或者產(chǎn)物片段大小不一致即可判定為陰性，陽(yáng)性擴(kuò)增片段需進(jìn)行測(cè)序并與參考序列進(jìn)行比對(duì)；
[0021]本發(fā)明檢測(cè)條件下:陽(yáng)性對(duì)照的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為150bp，陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0022]【具體實(shí)施方式】中，步驟⑴模板液的制備方法可以從現(xiàn)有技術(shù)中簡(jiǎn)單獲取，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，確定模板液中DNA濃度及保證檢測(cè)樣品符合標(biāo)準(zhǔn)是無(wú)需花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)的，本發(fā)明中使用DNA濃度為lOnmol/L~lOOnmol/L的模板液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0023]具體地，以保藏菌株為原材料制備模板液可以使用下述方法:待測(cè)樣品用3%氯化鈉堿性蛋白胨水增菌培養(yǎng)后，取1.0mL培養(yǎng)液于13000rpm離心2min，棄上清液，用DNA提取試劑盒處理得模板液；或者向1.0mL培養(yǎng)液中加入20 μ L~30 μ L滅菌雙蒸水振蕩混勻后煮沸5min，再取2 μ L上清液做模板液。上述增菌培養(yǎng)時(shí)間一般需要8h~18h至菌濃度約0.5麥?zhǔn)蠞岫葧r(shí)，所得的模板液滿足反應(yīng)測(cè)量的要求。
[0024]使用本發(fā)明的方法，尤其是特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)，與經(jīng)典方法的細(xì)菌培養(yǎng)、分離、鑒定方法相比，本發(fā)明的方法更快速、準(zhǔn)確。且較傳統(tǒng)方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，對(duì)弗尼斯弧菌檢測(cè)特異性為100%，檢測(cè)靈敏度為2400CFU/mL。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]本發(fā)明附圖3幅:
[0026]圖1是弗尼斯弧菌特異性檢驗(yàn)結(jié)果，其中:l、20:Marker DL2000 ;2、3、4、5、6、7:弗尼斯弧菌DNA PCR產(chǎn)物；8:水對(duì)照；9、10:霍亂弧菌DNA PCR產(chǎn)物；11、12:副溶血性弧菌DNAPCR產(chǎn)物;13、14:溶藻弧菌DNA PCR產(chǎn)物;15、16:創(chuàng)傷弧菌DNA PCR產(chǎn)物;17、18:擬態(tài)弧菌DNA PCR產(chǎn)物；19:水對(duì)照。
[0027]圖2是弗尼斯弧菌特異性檢驗(yàn)結(jié)果，其中:1、24 =Marker DL2000 ;2、3:河弧菌DNAPCR產(chǎn)物；4、5:霍利斯弧菌DNA PCR產(chǎn)物；6、7:鯊魚(yú)弧菌DNA PCR產(chǎn)物；8、9:海魚(yú)弧菌DNAPCR產(chǎn)物;10、11:麥?zhǔn)匣【鶧NA PCR產(chǎn)物;12、13:嗜水氣單胞菌DNA PCR產(chǎn)物;14、15:大腸桿菌DNA PCR產(chǎn)物；16、17:志賀氏菌DNA PCR產(chǎn)物；18、19:金黃色葡萄球菌DNA PCR產(chǎn)物；20、21:弗尼斯弧菌DNA PCR產(chǎn)物;22、23:水對(duì)照。
[0028]圖3是弗尼斯弧菌靈敏度檢驗(yàn)結(jié)果，其中:1、25:Marker DL2000 ;2、3:弗尼斯弧菌(2.4X108cfu/mL) DNA PCR 產(chǎn)物;4、5 弗尼斯弧菌(2.4X107cfu/mL) DNA PCR 產(chǎn)物;6、7:弗尼斯弧菌(2.4X106cfu/mL)DNA PCR 產(chǎn)物；8、9:弗尼斯弧菌(2.4X 105cfu/mL)DNA PCR 產(chǎn)物;10、11:弗尼斯弧菌(2.4X104cfu/mL)DNA PCR 產(chǎn)物;12、13:弗尼斯弧菌(2.4 X 13Cfu/mL)DNA PCR 產(chǎn)物;14、15:弗尼斯弧菌(2.4X 102cfu/mL) DNA PCR 產(chǎn)物;16、17:弗尼斯弧菌(2.4X 11CfuZmL) DNA PCR 產(chǎn)物;18、19:弗尼斯弧菌(2.4cfu/mL) DNA PCR 產(chǎn)物;20、21:弗尼斯弧菌(0.24cfu/mL)DNA PCR產(chǎn)物;22、23:陰性對(duì)照；24:水對(duì)照。

【具體實(shí)施方式】
[0029]下面為本發(fā)明的具體實(shí)施例，它對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的建立及其應(yīng)用作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不以任何形式限制本發(fā)明的內(nèi)容。
[0030]若無(wú)特殊說(shuō)明，本部分試驗(yàn)所用生物樣品來(lái)自丹東出入境檢驗(yàn)檢疫局微生物實(shí)驗(yàn)室、大連出入境檢驗(yàn)檢疫局微生物實(shí)驗(yàn)室的水廣品和動(dòng)植物樣品。
[0031]DNA 提取試劑盒:TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extract1n KitVer.3.0 (貨號(hào)9763)購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；
[0032]PCR擴(kuò)增酶試劑:TaKaRa Ex Taq (貨號(hào)RR001A)購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；
[0033]ABI Veriti PCR 儀(ABI 公司，美國(guó))。
[0034]實(shí)施例1、檢測(cè)方法的建立
[0035]一、引物的設(shè)計(jì)
[0036]根據(jù)同源性基因篩查比較結(jié)果，選擇具有很高特異性的弗尼斯弧菌的ToxS基因(SEQID N0.3)為檢測(cè)擴(kuò)增的目標(biāo)基因。據(jù)NCBI上已公布的上述基因的核酸序列，并通過(guò)對(duì)檢測(cè)引物退火溫度的一致性以及GC含量的相似性等因素的綜合考慮，設(shè)計(jì)了如下特異性引物:
[0037]正向引物:5'-CAATCCAAGATGGTCACGCTAA-3'，
[0038]反向引物:5'-TTTATCCACCGCGTACAGCTT-3'；
[0039]二、弗尼斯弧菌PCR檢測(cè)方法的建立:
[0040]1、制備模板DNA樣品溶液；
[0041]本實(shí)施例基因組DNA的抽提采用寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒(貨號(hào)9763)并按其操作說(shuō)明進(jìn)行抽提樣品DNA，得到模板液。
[0042]模板液DNA濃度和純度的測(cè)定:取5 μ L制得的DNA溶液加ddH20梯度稀釋至lmL，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)測(cè)260nm和280nm處的光密度值。DNA的濃度按照如下公式計(jì)算獲得:C = AXNX 50/1000，式中:
[0043]C 為 DNA 濃度(μ g/ μ L)；
[0044]A為260nm處的吸光值；
[0045]N為核酸稀釋倍數(shù)；
[0046]1D260nm = 50 μ g/mL 雙鏈 DNA ；
[0047]當(dāng)0D26Q/0D28Q比值在1.7~1.9之間時(shí)，適宜于PCR擴(kuò)增。
[0048]2、PCR 檢測(cè)
[0049]①反應(yīng)體系:總體積20ul，包括步驟I制得的模板DNA溶液2 μ 1，10XPCR緩沖液
2μ L、dNTP0.4 μ L、引物(10 μ Μ)各0.5 μ L、Taq酶1U，補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為20 μ L0
[0050]②以上各組分加入至0.2mL PCR反應(yīng)管中，混勻，5000r/min，離心10s。
[0051]③步驟②的反應(yīng)體系按下述條件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè):
[0052]94°C預(yù)變性 4min，然后 94°C lmin、59°C lmin、72°C lmin，35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸10min，4°C 保存。
[0053]④步驟③PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè):
[0054]用電泳緩沖液制備I %瓊脂糖凝膠，取6 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別和I μ L上樣緩沖液混合，進(jìn)行點(diǎn)樣，用DNA分子量標(biāo)記物做參照。3V/cm~5V/cm恒壓電泳，電泳20min~40min,電泳檢測(cè)結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄并保存。陽(yáng)性對(duì)照的弗尼斯弧菌轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子ToxS基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為150bp，陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。樣品擴(kuò)增片斷大小與陽(yáng)性對(duì)照一致即為陽(yáng)性，若樣品無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物或者產(chǎn)物片段大小不一致即為陰性。陽(yáng)性擴(kuò)增片段需進(jìn)行測(cè)序并與參考序列進(jìn)行比對(duì)。
[0055]實(shí)施例2、特異性試驗(yàn)
[0056]應(yīng)用實(shí)施例1的特異性引物及檢測(cè)方法檢測(cè)含有弗尼斯弧菌的DNA樣品。同時(shí)檢測(cè)含有麥?zhǔn)匣【?、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、擬態(tài)弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、霍利斯弧菌、鯊魚(yú)弧菌、河弧菌、海魚(yú)弧菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌等其它致病菌DNA樣品，以對(duì)方法的特異性進(jìn)行評(píng)估，檢測(cè)結(jié)果如圖1和2所示:
[0057]電泳檢測(cè)結(jié)果顯示陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明反應(yīng)結(jié)果正常，反應(yīng)體系無(wú)污染；陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物為150bp大小的基因片斷，反應(yīng)結(jié)果正常。
[0058]由圖1和圖2可知，對(duì)弗尼斯弧菌中toxS基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果擴(kuò)增產(chǎn)物為150bp大小的基因片斷，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；其他致病菌的toxS基因檢測(cè)結(jié)果顯示無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。
[0059]由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，本發(fā)明具有很好的特異性。
[0060]實(shí)施例3、靈敏度試驗(yàn)
[0061]—、標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度
[0062]應(yīng)用實(shí)施例1的特異性引物及檢測(cè)方法，對(duì)弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)物進(jìn)行檢測(cè)靈敏度的研究。
[0063]取上述標(biāo)準(zhǔn)菌株于3%氯化鈉堿性蛋白胨水中培養(yǎng)18h左右后，測(cè)其麥?zhǔn)蠞岫?，估?jì)其菌數(shù)，然后按十倍遞增進(jìn)行梯度稀釋到10_7，取最后四個(gè)稀釋液的菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度重復(fù)3個(gè)，按照相應(yīng)的方法培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)取平均值確定其真實(shí)的菌密度。同時(shí)每個(gè)稀釋液各取ImL菌液于2mL離心管中并作3管重復(fù)，用于提取DNA并應(yīng)用本發(fā)明方法進(jìn)行PCR檢測(cè)，以確定本發(fā)明方法的檢測(cè)靈敏度。
[0064]檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，從圖中可以看出，陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明反應(yīng)結(jié)果正常，反應(yīng)體系無(wú)污染；陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物為150bp大小的基因片斷，反應(yīng)結(jié)果正常；標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)物靈敏度檢測(cè)結(jié)果顯示，弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度分別為24000cfu/mL,2400cfu/mL時(shí)均能很好檢出。結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度2400cfu/mL。
[0065]二、樣品中添加弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的靈敏度實(shí)驗(yàn)
[0066]應(yīng)用實(shí)施例1的特異性引物及檢測(cè)方法，對(duì)樣品中添加弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行檢測(cè)靈敏度的研究。
[0067]選用已經(jīng)確定弗尼斯弧菌陰性的樣品，分別取1g樣品加入10mL增菌液中同時(shí)添加已知不同濃度梯度的弗尼斯弧菌，均質(zhì)后取ImL均質(zhì)液提取DNA，用于靈敏度試驗(yàn)，確定樣品中添加弗尼斯弧菌后的檢測(cè)靈敏度。同時(shí)提取陰性樣品均質(zhì)液ImL提DNA用于PCR檢測(cè)。
[0068]檢測(cè)結(jié)果:陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，說(shuō)明反應(yīng)結(jié)果正常，反應(yīng)體系無(wú)污染；陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物為150bp大小的基因片斷，反應(yīng)結(jié)果正常；標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)物靈敏度檢測(cè)結(jié)果顯示，弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株濃度分別為24000Cfu/mL、2400Cfu/mL時(shí)均能很好檢出。結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度2400cfu/mL。
[0069]實(shí)施例4、應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測(cè)
[0070]應(yīng)用實(shí)施例1的特異性引物和檢測(cè)方法，以傳統(tǒng)的檢測(cè)方法為對(duì)照(ISO/TS21872-2Microb1logy of food and animal feeding stuffs-Horizontal method forthe detect1n of potentially enteropathogenic Vibr1 spp.- Part2:Detect1n ofspecies other than Vibr1 parahaemolyticus and Vibr1 cholerae.)。實(shí)際檢測(cè)樣品包括江瑤貝、蜆子肉、凍雞肉及凍花菜等共358份，檢測(cè)結(jié)果如表1所示:
[0071]表1
[0072]

【權(quán)利要求】
1.弗尼斯弧菌檢測(cè)用引物對(duì)，其特征在于，堿基序列為SEQID N0.1/2。
2.弗尼斯弧菌檢測(cè)用試劑盒，包括堿基序列為SEQID N0.1/2的引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的弗尼斯弧菌檢測(cè)用試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括濃度為10~lOOnmol/L的弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA提取物。
4.一種弗尼斯弧菌的檢測(cè) 方法，其特征在于，所述方法包括以SEQ ID N0.1/2為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟。
5.權(quán)利要求4所述的弗尼斯弧菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增以弗尼斯弧菌ToxS基因112~261位的核酸序列為靶基因。
6.權(quán)利要求5所述的弗尼斯弧菌的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的ToxS基因的GenBank 登陸號(hào) CP002377.1。
7.權(quán)利要求4所述的弗尼斯弧菌檢測(cè)方法，包括如下步驟: ⑴提取待測(cè)樣品DNA，得到模板液； ⑵PCR擴(kuò)增: 反應(yīng)體系:模板液2μ 1U0XPCR緩沖液2yL、dNTP0.4yL、Taq酶1U、濃度為10 μ M的引物對(duì)SEQ ID N0.1/2各0.5 μ L、補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為20 μ L ;以上各組分加入至.0.2mL PCR反應(yīng)管中，混勻，5000r/min離心1s ； 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性4min，然后94°C lmin,59 °C lmin,72 °C lmin，35個(gè)循環(huán)，最后.72°C延伸 10min，4°C保存； (3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè): 用電泳緩沖液制備I %瓊脂糖凝膠；取步驟⑵所制備的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6 μ L，與I μ L上樣緩沖液混合后點(diǎn)樣，用DNA分子量標(biāo)記物做參照；3V/cm~5V/cm恒壓電泳，電泳20min~.40min,電泳檢測(cè)結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄并保存； ⑷結(jié)果判定:以弗尼斯弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽(yáng)性對(duì)照，以其它非弗尼斯菌株作為陰性對(duì)照，以滅菌雙蒸水為模版作為空白對(duì)照進(jìn)行步驟⑴~⑷的操作； 如待測(cè)樣品擴(kuò)增片斷大小與陽(yáng)性對(duì)照一致即可判定為陽(yáng)性，若樣品無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物或者產(chǎn)物片段大小不一致即可判定為陰性，陽(yáng)性擴(kuò)增片段需進(jìn)行測(cè)序并與參考序列進(jìn)行比對(duì)。
8.權(quán)利要求7所述的弗尼斯弧菌檢測(cè)方法，其特征在于，所述的步驟⑴模板液的制備方法是:待測(cè)樣品以3%氯化鈉堿性蛋白胨水增菌培養(yǎng)至菌濃度約0.5麥?zhǔn)蠞岫葧r(shí)，取.1.0mL培養(yǎng)液于13000rpm離心2min，棄上清液，用DNA提取試劑盒處理得模板液，或者向.1.0mL培養(yǎng)液中加入20~30 μ L滅菌雙蒸水振蕩混勻后煮沸5min，再取2 μ L上清液做模板液。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104073566SQ201410339945
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】王殿夫, 高世光, 麻麗丹, 黃大亮, 騰艷霞 申請(qǐng)人:王殿夫, 高世光, 麻麗丹, 黃大亮, 騰艷霞