專利名稱：用于檢測霍亂弧菌o1群的引物和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測霍亂弧菌01群的引物和試劑盒。
背景技術(shù)：
霍亂弧菌(Vibrio cholerae)屬于弧菌屬，是霍亂的病原菌，霍亂是一種烈性腸道傳染病，是流傳時間長、影響范圍廣的一種食源性疾病，其典型臨床表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐和由此引起的體液丟失、脫水、周身循環(huán)衰竭、電解質(zhì)紊亂、低鉀綜合癥、腹部痙攣甚至死亡，被世界衛(wèi)生組織確定為必須國際檢疫的傳染病之一，《中華人民共和國傳染病防治法》將其列為應(yīng)實施“強制管理”的甲類傳染病?；魜y腸毒素(Cholera enterotoxin，CT)是引起霍亂疾病的主要原因，產(chǎn)腸毒素基因的調(diào)控基因位于霍亂毒力島(vibrio pathogenicity islancUVPI)。從霍亂爆發(fā)流行分離的菌株，大部分具有耐熱的菌體(0)抗原和不耐熱的鞭毛(H)抗原。根據(jù)0抗原不同，目前已將霍亂弧菌分出近200個0血清型。1992年以前，僅01群霍亂弧菌的兩個生物型(古典生物型和埃爾托生物型)引發(fā)了七次霍亂世界大流行。1992年10月，在印度和孟加拉國首次發(fā)生了由非01群霍亂弧菌引起的霍亂大暴發(fā)。1989年2月21日中國公布的《中華人民共和國傳染病防治法》，規(guī)定管理的傳染病分為甲、乙、丙三類，霍亂為兩種甲類管理的傳染病之一。中國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局的2002年第25和26號令中明確規(guī)定霍亂弧菌為必檢項目。霍亂弧菌的快速而準確的檢測，有利于對其自然流行的監(jiān)測和預(yù)防，并且對生物恐怖活動的防范具有一定的應(yīng)用價值。目前對該菌的檢測，通常是在堿性瓊脂平板上經(jīng)選擇性增菌，后通過一系列的生化方法鑒定，費時費力，一般至少要耗時4-6天。且霍亂弧菌在某些不適合生長的條件下， 可形成一種存活但不可培養(yǎng)狀態(tài)(viable butnot culturabIe state，VBNCS)，采用傳統(tǒng)的免疫學方法和生物方法都不能全面的檢測和鑒定霍亂弧菌。但利用核酸檢測的方法，即使在不進行選擇性富集培養(yǎng)和純化的情況下，也可以進行檢測鑒定。因此，基于核酸的檢測方法比傳統(tǒng)的富集培養(yǎng)的方法更具優(yōu)勢。Taqman熒光PCR方法是核酸檢測方法的一種，是在擴增反應(yīng)體系中加入一對特異性引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，使用實時監(jiān)測的熒光PCR檢測儀來檢測靶核苷酸序列的技術(shù)。它還具有以下優(yōu)點(1)特異性強引物和探針的“雙保險”，避免檢測的假陽性。⑵靈敏度高分析PCR產(chǎn)物的對數(shù)期，自動化儀器收集熒光信號，避免了許多人為因素干擾。(3)避免污染全封閉反應(yīng)，無需PCR后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性。 (4)實現(xiàn)定量運用標準品獲得標準曲線，結(jié)合Ct值進行準確定量。(5)高效低耗可實現(xiàn)一管多檢。(6)操作簡便在線式實時監(jiān)測擴增結(jié)果，不必接觸有害物質(zhì)，操作安全。(7)快速反應(yīng)時間< 1.5小時。正因為熒光PCR具有這些優(yōu)勢，目前已被廣泛應(yīng)用于微生物檢測、疾病監(jiān)測和臨床檢驗等領(lǐng)域，大大提高了檢測效率，縮短了檢測周期，降低了檢測成本， 提高了經(jīng)濟和社會效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測霍亂弧菌01群的引物，以快速、方便地檢測霍亂弧菌01群，該引物由SEQ ID NO :1-2所示的核苷酸序列組成。本發(fā)明所述的引物可以用于制備用于檢測霍亂弧菌01群的基因芯片和/或試劑盒。其中所述的基因芯片優(yōu)選為微列陣芯片。本發(fā)明還提供一種用于檢測霍亂弧菌01群的基因芯片，其包含上述引物。其中所述的基因芯片優(yōu)選為微列陣芯片。本發(fā)明還提供一種用于檢測霍亂弧菌01群的試劑盒，其包含上述引物。本發(fā)明所述的試劑盒，還包含探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。本發(fā)明所述的試劑盒，還可以包含標準品、陽性對照、陰性對照、緩沖液(包括 buffer和dNTP)和DNA聚合酶。應(yīng)用本發(fā)明所述的試劑盒檢測霍亂弧菌01群的方法如下(1)提取待檢樣品中的細菌DNA作為模板；(2)在熒光PCR薄壁管中分別加入緩沖液、引物和探針的混合物，然后加入正對照、負對照或從檢測樣品中提取的模版DNA，并用ddH20補足到一定體積，混勻；(3)將PCR薄壁管中混勻的混合物在熒光定量PCR儀上擴增；(4)分析熒光定量結(jié)果并進行結(jié)果判斷。本發(fā)明配制的一種可檢測霍亂弧菌01群的可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的試劑盒，將熒光PCR檢測方法需要使用的組分組合在一起，使用時，提取待檢樣品基因組，同時經(jīng)過較為簡單的操作程序就可以進行快速、靈敏、簡便的檢測、試劑盒中各組分的用量和濃度均為試驗所得， 用該試劑盒檢測檢測霍亂弧菌01群操作簡便，快速，成本低。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。


圖1是菌落PCR鑒定含rfbH基因的陽性克隆的電泳圖；圖2是霍亂弧菌01群標準品各稀釋度的擴增曲線；圖3是霍亂弧菌01群標準品制訂的標準曲線；圖4是霍亂弧菌01群的擴增曲線；圖5是未分型的霍亂弧菌和其他弧菌的擴增曲線。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限定本發(fā)明的范圍。此外，應(yīng)理解在閱讀了本發(fā)明講述的內(nèi)容以后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對本發(fā)明做各種改動或修改，這些等價形式同樣屬于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。本發(fā)明的具體原理是利用一對靶核苷酸序列的特異性引物和一個特異性熒光探針，采用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTP)等成分，并應(yīng)用PCR技術(shù)實現(xiàn)靶核苷酸序列的核酸片段擴增。所使用的探針為兩端分別標記熒光報告基團(R)和熒光淬滅基團(Q)的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團所吸收，而在 PCR擴增過程中，Taq酶的5’端外切酶活性將特異結(jié)合在靶核苷酸片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報告基團游離于反應(yīng)體系中，脫離了熒光淬滅基團的屏蔽作用，熒光報告基團的熒光信號就可以由儀器檢測到，熒光信號量的變化與擴增產(chǎn)物量成正比，從而判定待測樣本中靶核苷酸序列的存在。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗指南》(第三版)(J.薩姆布魯克等著)或按照試劑廠商說明書的條件。所用無機化學和有機溶劑均符合分子生物學試驗要求。引物和探針由大連寶生物公司合成，PGEM-T Easy Vector和T41igase均購自Promega，Taq DNA聚合酶購自上海生工生物工程技術(shù)公司，熒光PCR儀為美國ABI的7300。實施例1引物和探針設(shè)計根據(jù)GeneBank公布的霍亂弧菌01群的0抗原基因簇序列(序列接收號X59554)， 通過對該0抗原序列的各基因的功能分析和蛋白質(zhì)輸水結(jié)構(gòu)分析，選擇霍亂弧菌01群的 rfbH基因為靶基因，設(shè)計特異引物和探針，引物長度一般為20個堿基左右，引物間和引物內(nèi)無互補序列。所設(shè)計的引物和探針都經(jīng)Blast檢索能檢測出所有已知的霍亂弧菌01群菌，不與其他霍亂弧菌血清型和其他細菌產(chǎn)生陽性結(jié)果。最優(yōu)引物、探針序列組合如下(1)霍亂弧菌 01 群的上游引物，其序列為 VCOlF 5-CGTTGCAGATGCTCGAGTATACC-3 (SEQ ID NO 1) (2)霍亂弧菌 01 群的下游引物，其序列為 VCOlR 5-GAAGAATCAGCACGTTCCGATAT-3 (SEQ ID NO 2)(3)霍亂弧菌 01 群的 TaqMan 探針，其序列為 01-P 5-CAACCTTTTATGCTTTCAGTCGG TGCTCA-3(SEQ ID NO 3)下述為GeneBank公布的X59554號霍亂弧菌01群的rfbH基因的核酸序列(SEQ ID NO :4，下述序列中的開始粗體到末后粗體之間的序列為531bp)及標注的設(shè)計引物和探針序列的設(shè)計區(qū)，其中下劃線標識的為real-time PCR上下游引物設(shè)計區(qū)，斜體為TaqMan 探針設(shè)計區(qū)。ATGTATTTTTTGGGAATGAAAATGCTTAAAGATATAGTTTCGGTTTTTTATAATTGGCGTATTGTG CATCTATTGGGGGTTTCTACACTTAGAAGTAGATACTCTCGGTCTAAATTTGGACAAACTTGGTTAAGCATCACAAT GTTCGTACAAATTCTCTGTATAGGGCTAATTTGGTCTTT AATATGGAGAATGGGAGTAG ATGATTATTTAC CATATGTCGGTGTTGGACACATAATTTACTTGTTTTATACTCAAACAATTAACGAAAGCACAGGAATCTTCGTTGCA GATGCTCGAGTATACCTAAATGATAGG CAACCTTTTATGCTTTCAGTCGGTGCTCA CATATATCGGAACGTGCT GATTCTTCTTCATAATATACCAACCATATTTTTGCTTGTCATATGGTCTAGCTCGGCAAACTTTGAATTTAGTTTTA TGTTTGTCATTTCGTTGAGTTTAAGTCTGTTTTTCGTCCTATTTGCTAGCTATTTTTGTGCTGTTATTTCAACGAGA TTTAGAGACTTAATCCAGCTGATTGGGCTTTTGATGCAGTTAGCTTTCTTTGTAAGTCCTGTCATGTGGAAAGTAAG CTTTCTACCCGAACAATATCAAAACTATGTGTACATAAATCCATTTGCTTCGCTATTGGAATTAATTAGAAATCCGA TAATAGGAATCGACGTTAAT CCTTTAGCATTTGTTTCGTT AGTAGCATGGACTTTTATAATTGGTATGGTCA GCTACTTCTCGTACAAAGTACTCGATAAAAAAGTCATTTTTTGGGTGTAG實施例2霍亂弧菌01群標準品的制備和標定(I)PCR擴增目的帶
用PCR方法將包含有real-time PCR引物和探針的序列擴增出來(引物序列如SEQ ID NO :1-2所示)，PCR反應(yīng)程序如下94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，50°C退火30秒， 72°C延伸1分鐘，進行30個循環(huán)；最后72°C繼續(xù)延伸5分鐘，得到PCR產(chǎn)物，用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小及其特異性；產(chǎn)物長度為531bp。PCR產(chǎn)物切膠回收，并用上海生工生物工程技術(shù)公司的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物。(2)連接將PCR純化產(chǎn)物與Promega公司的3 X 10_3的pGEM-T-Easy載體于4°C連接24小時，總體積為 ο μ 1，其中有1 μ 1的IOX緩沖液和0. 5U的T4DNA連接酶，得到連接產(chǎn)物。(3)電轉(zhuǎn)化用Bio-Rad公司的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的制備方法制備感受態(tài)大腸桿菌DH5 α細胞，取2-3 μ 1上述O)的連接產(chǎn)物與60 μ 1感受態(tài)大腸桿菌DH5 α混合后，轉(zhuǎn)到Bio-Rad 公司的0. 2cm的電擊杯中電擊，電壓為2. 5kv,時間為5. 0毫秒-6. 0毫秒，電擊后立即在杯中加入ImL的SOC培養(yǎng)基使菌復(fù)蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上37°C過夜培養(yǎng)，次日得到藍白菌落。(4)菌落PCR鑒定隨機挑取4個白色菌落即白色克隆進行菌落PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同本實施例(1)中的常規(guī)PCR相同。反應(yīng)結(jié)束后，取3μ1 PCR擴增產(chǎn)物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測結(jié)果見圖1所示(泳道M :DL2000Marker，泳道1_4分別為隨機挑取的白色菌落1-4)，結(jié)果4個克隆經(jīng)PCR鑒定都有531bp的目的條帶，都為正確克隆。(5)質(zhì)粒提取取上述中鑒定正確的陽性克隆菌落1(命名為H1981)，將其接種于含氨芐的 LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，采用《分子克隆試驗指南》(第三版)(J.薩姆布魯克等著)(請確認)中SDS堿裂解法提取質(zhì)粒。該質(zhì)粒命名為PLW1536。(6)測序用SP6和T7引物對提取的PLWl536質(zhì)粒進行測序，結(jié)果表明PLWl536所攜帶的擴增片段序列具有上述的531bp的核苷酸序列，表明PLW1536所攜帶的531bp的擴增片段與霍亂弧菌01群的rfbH基因待擴增的序列完全一致，構(gòu)建的質(zhì)粒序列完全正確。(7)PLW1536 的濃度測定取1 μ 1 PLW1536的原液用NanoDrop OD儀測定OD260值，結(jié)果測得的PLW1536原液的濃度為153ng/l·! 1，1 μ 1 PLW1536原液含有4X 101°個拷貝。實施例3.繪制標準曲線將PLW1536 原液 10 倍梯度稀釋得到 4X 107、4X 106、4X 105、4X 104、4X IO3 個拷貝 real-time PCR檢測，25 μ 1反應(yīng)體系見下表1 表 lreal-time PCR 反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種用于檢測霍亂弧菌01群的引物，其特征在于，由SEQ IDNO :1-2所示的核苷酸序列組成。
2.權(quán)利要求1所述的引物在制備用于檢測霍亂弧菌01群的試劑盒和/或基因芯片中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的基因芯片為微列陣芯片。
4.一種用于檢測霍亂弧菌01群的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包含探針，該探針的核苷酸序列如 SEQ ID NO 3 所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，還包含標準品、陽性對照、陰性對照、緩沖液和DNA聚合酶。
7.一種用于檢測霍亂弧菌01群的基因芯片，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因芯片，其特征在于，所述的基因芯片為微列陣芯片。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測霍亂弧菌O1群的引物和試劑盒，該引物由SEQ ID NO1-2所示的核苷酸序列組成，其試劑盒中含有上述的引物。使用本發(fā)明的引物和試劑盒，經(jīng)過較為簡單的操作程序就可以進行快速、靈敏、簡便的檢測霍亂弧菌O1群，操作簡便，快速，成本低。
文檔編號G01N21/64GK102296107SQ201010212469
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月28日
發(fā)明者劉斌, 吳凡, 張曦, 王敏, 王磊, 陳敏 申請人:上海市疾病預(yù)防控制中心, 上海市預(yù)防醫(yī)學研究院, 天津生物芯片技術(shù)有限責任公司