一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠的制備方法。將水產(chǎn)魚皮膠原蛋白在4℃下不斷攪拌的條件下，充分溶于濃度為0.5mol/L的醋酸溶液中，配置成膠原液；將溶解后的膠原液離心收集上清液，待用；用過濾后的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)上述膠原上清液的pH；或，用過濾后的磷酸鹽緩沖液與上述膠原上清液按按體積比1:1的比例混合，并不斷攪拌混合液，而后用過濾后的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合液的pH；將調(diào)節(jié)pH后的膠原上清液混合液置于模具中，然后在30-40℃水浴靜置1-2h，使其充分自聚凝固成型；將成型后的水凝膠從模具中取出，置于超純水中浸泡20-30min，即得水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠。本發(fā)明制備過程簡單、廉價(jià)易得，產(chǎn)品用途廣泛。
【專利說明】一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原蛋白是動物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣泛的蛋白質(zhì)。膠原蛋白具有獨(dú)特的三螺旋結(jié)構(gòu)、低抗原性、無毒性、良好的生物相容性和生物可降解性等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于組織工程支架材料、止血海綿、藥物控緩釋系統(tǒng)、基因傳遞載體、美容外科等生物醫(yī)用領(lǐng)域。目前，國內(nèi)使用的膠原蛋白主要來自豬和牛的皮膚和跟腱，但隨著瘋牛病和口蹄疫等疾病的發(fā)生，使人們對它們的安全性產(chǎn)生了質(zhì)疑；另外，由于宗教和習(xí)俗等原因，豬來源的膠原蛋白在某些地區(qū)的應(yīng)用受到了限制。因此，迫切需要尋求質(zhì)量和安全性更好的膠原蛋白來源。
[0003]我國每年魚鱗，魚皮等水產(chǎn)品廢棄物約有40多萬噸，這些水產(chǎn)品廢棄物均含有豐富的膠原蛋白，其氨基酸組成與陸生哺乳動物膠原蛋白無明顯差異，且其不存在人畜共患的傳染性疾病，具有極大的開發(fā)和利用價(jià)值，但這些廢棄物除小部分被用于生產(chǎn)飼料外，大部分卻被丟棄。因此，開發(fā)魚皮等水產(chǎn)品廢棄物的利用新途徑，不僅可提高水產(chǎn)品加工的附加值，而且能減少環(huán)境污染，具有良好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠的制備方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為:
[0006]一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠的制備方法，
[0007]I)將水產(chǎn)魚皮膠原蛋白在4°C下不斷攪拌的條件下，充分溶于濃度為0.5mol/L的醋酸溶液中，配置成膠原液；
[0008]2)將溶解后的膠原液于4°C、20000g的條件下離心30min，充分除去不溶性的雜質(zhì)，用移液槍小心吸出上清液，待用；
[0009]3)用過濾后的10-15mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)上述膠原上清液的pH至?.0-7.8 ；
[0010]或，用過濾后的磷酸鹽緩沖液與上述膠原上清液按體積比1:1的比例混合，并不斷攪拌混合液，而后用過濾后的10-15mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合液的pH至7.0-7.8 ；
[0011]4)將調(diào)節(jié)pH后的膠原上清液混合液置于模具中，然后在30_40°C水浴靜置l_2h，使其充分自聚凝固成型；
[0012]5)將成型后的水凝膠從模具中取出，置于超純水中浸泡20_30min，即得水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠。
[0013]所述過濾后的磷酸鹽緩沖液為濃度為40mM的含濃度為260mM的氯化鈉的磷酸鹽緩沖液，濾紙過濾，待用。
[0014]所述磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉一磷酸二氫鈉緩沖液，pH7.4。[0015]所述水產(chǎn)魚皮膠原蛋白為羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白；
[0016]I)將清洗并吸干表面水分的羅非魚皮在磁力攪拌下用10%正丁醇對魚皮進(jìn)行脫脂24h，期間每8h更換一次正丁醇溶液；而后清洗待用；
[0017]2)于4°C條件下，用0.lmol/L的氫氧化鈉對上述處理后魚皮進(jìn)行脫雜蛋白24h，期間每8h更換一次氫氧化鈉溶液,而后清洗待用；
[0018]3)將上述脫雜蛋白后的魚皮粉碎，粉碎后魚皮粉與0.5mol/L醋酸溶液混合，混合后再加入原料魚皮質(zhì)量0.5%-1%的胃蛋白酶(750U/mg，Sigma)，而后于4°C下攪拌提取48h ；
[0019]4)將上述提取后魚皮提取液離心收集上清液，并在冰水浴及攪拌的條件下向上清液中緩緩加入研磨細(xì)碎的氯化鈉至終濃度為0.9mol/L，而后將液體置于4°C冰箱中過夜鹽析；
[0020]5)將上述鹽析液離心，收集沉淀，而后將沉淀復(fù)溶于0.5mol/L的醋酸溶液中；所得復(fù)溶液裝于3.5kDa透析袋中，透析24h，透析液0.02mol/L的磷酸氫二鈉溶液(pH8.6)；
[0021]6)上述所得透析液再用0.lmol/L的醋酸溶液透析24h，透析后再用純水透析48h ；透析后的膠原液于_80°C快速遇冷，然后_60°C冷凍干燥48h，即得羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白(PSC)。
[0022]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)效果:
[0023]1.本發(fā)明所用原 料為水產(chǎn)加工的下腳料羅非魚皮，原料來源安全，本發(fā)明充分利用羅非魚水產(chǎn)加工過程中產(chǎn)生的魚皮廢料，變廢為寶，提高經(jīng)濟(jì)效益。
[0024]2.本發(fā)明所用提取方法為酶促提取法，這樣不僅可以使魚皮膠原蛋白提取的更加徹底，而且在提取過程中，酶可以切除膠原蛋白的末端端肽，這樣可以降低人體對其的免疫抗性。
[0025]3.本發(fā)明可以開發(fā)哺乳動物(豬和牛)以外來源的水產(chǎn)膠原蛋白醫(yī)用材料，其安全系數(shù)更高、產(chǎn)量更大，而且更加廉價(jià)。
[0026]4.本發(fā)明開發(fā)的水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠，是在模擬生理酸堿度和離子強(qiáng)度環(huán)境的條件下完全依靠膠原蛋白自聚的性質(zhì)制備的，未加任何交聯(lián)劑，所以其在體內(nèi)的安全性、穩(wěn)定性和相容性會更好。
[0027]5.本發(fā)明獲得的水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠，其低溫(4-10°C )下為透明無色液體，當(dāng)水浴達(dá)到一定溫度(30_40°C)時(shí)便會快速自聚成型變?yōu)楣腆w狀，機(jī)械強(qiáng)度良好，具有一定的支持作用，而且可降解；當(dāng)溫度高于一定值時(shí)(50V )便會再次變回為液體，但當(dāng)溫度再次降到30_40°C，液體無法再次聚集成固體，即這是一個(gè)不可逆的過程。通過本發(fā)明所獲得的水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠用途廣泛，如脊髓手術(shù)后填充等，前景可觀。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的濃度為lmg/mL膠原液制備的水凝膠；
[0029]圖2本發(fā)明實(shí)施例提供的濃度為2mg/mL膠原液制備的水凝膠；
[0030]圖3本發(fā)明實(shí)施例提供的濃度為3mg/mL膠原液制備的水凝膠；
[0031]圖4本發(fā)明實(shí)施例提供的生理鹽度下濃度為lmg/mL膠原液制備的水凝膠；
[0032]圖5本發(fā)明實(shí)施例提供的生理鹽度下濃度為2mg/mL膠原液制備的水凝膠；[0033]圖6本發(fā)明實(shí)施例提供的生理鹽度下濃度為3mg/mL膠原液制備的水凝膠。【具體實(shí)施方式】
[0034]下面用具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
[0035]實(shí)施例1水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠的制備:
[0036]1.1酶促溶性羅非魚皮膠原蛋白的提取:
[0037]1.1.1清洗魚皮:取出一定量保存于_20°C的羅非魚皮，用大量自來水浸泡并沖洗，去除魚皮表面殘留的魚肉、魚鱗等其他組織，用超純水浸泡清洗3次，再用吸水紙吸干魚皮表面的水分，
[0038]1.1.2脫脂:準(zhǔn)確稱取1g上述魚皮，將魚皮剪成I X 2cm大小，于4°C冰柜中，在磁力攪拌器不斷攪拌的條件下，用200mL的10%正丁醇水溶液脫脂8h，重復(fù)上述脫脂過程3次，然后用自來水沖洗30min，再用超純水清洗3次；
[0039]1.1.3脫雜蛋白:在4°C冰柜中，將脫脂后的上述魚皮浸泡于200mL的0.lmol/L氫氧化鈉溶液中脫雜蛋白8h，期間適時(shí)用玻璃棒攪拌，重復(fù)上述脫脂過程3次，然后用自來水沖洗至中性，再用超純水清洗3次；
[0040]1.1.4酶解提取:用組織粉碎機(jī)將上述魚皮粉碎，粉碎后魚皮粉中加入500mL的 0.5mol/L醋酸溶液及0.05g(原料魚皮質(zhì)量的0.5% )胃蛋白酶(750U/mg Sigma)，于4°C冰柜中，用磁力攪拌器攪拌提取48h，然后于4°C，lOOOOr/min條件下離心30min，收集上清液；
[0041]1.1.5鹽析及透析:準(zhǔn)確稱取5.2596g研磨細(xì)碎的氯化鈉，緩緩加入到酶提上清液中(最后濃度為0.9mol/L)，整個(gè)過程均在冰水浴和磁力攪拌器不斷攪拌的條件下進(jìn)行，然后將其置于4°C冰箱中過夜鹽析，于4°C，10000r/min條件下離心30min，收集沉淀，將沉淀復(fù)溶于0.5mol/L的醋酸溶液中，復(fù)溶液裝于3.5kDa的透析袋中，依次在0.02mol/L磷酸氫二鈉(pH8.6)溶液中透析24h、0.lmol/L醋酸溶液中透析24h和純水中透析48h，整個(gè)透析過程均在4 °C冰柜中進(jìn)行，
[0042]1.1.6冷凍干燥:將透析完成的膠原蛋白，在_80°C快速預(yù)冷，再在_60°C下冷凍干燥48h，即得羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白。
[0043]1.2羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白自聚制備水凝膠:
[0044]1.2.1不同濃度膠原蛋白自聚制備水凝膠:
[0045]準(zhǔn)確稱取10、20、30及40mg的膠原蛋白分別加入到1mL0.5mol/L醋酸溶液中，在4°C冰柜中、磁力攪拌器攪拌條件下充分溶解48h，然后于4°C、20000g條件下離心30min，用移液槍取出上清液，即得濃度分別為1、2、3及4mg/mL的膠原液，然后用lOmol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)混合液PH至7.4，迅速將調(diào)節(jié)好pH的膠原上清液倒入模具中，然后置于37°C水浴中自聚成型lh，然后將成型的不同濃度的水凝膠洗入超純水中，浸泡30min即得不同濃度的水凝膠(參見圖1-3)。
[0046]1.2.2模擬生理鹽水濃度對不同膠原蛋白濃度自聚水凝膠制備的影響:
[0047]準(zhǔn)確稱取20、40、60和80mg的膠原蛋白分別溶于1mL0.5mol/L醋酸溶液中，在4°C冰柜中、磁力攪拌器攪拌條件下充分溶解48h，然后于4°C、20000g條件下離心30min，用移液槍取出上清液，即得濃度分別為2、4、6和8mg/mL的膠原液；向各膠原液中緩慢加入10mL40mM含氯化鈉260mM pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(膠原液與上述磷酸鹽緩沖液體積比為1:1)即得生理鹽度條件下不同濃度的膠原蛋白液(終濃度為1、2、3和4mg/mL、磷酸鹽終濃度分別為20mM、氯化鈉的終濃度分別為130mM)，期間不斷攪拌，然后用10mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)混合液PH至7.4，迅速將調(diào)節(jié)好pH的膠原混合液倒入模具中，然后置于37°C水浴中自聚成型lh，然后將成型的生理鹽度條件下的不同濃度的水凝膠洗入超純水中，浸泡30min即得不同濃度的水凝膠(參見圖4-6)。
[0048]實(shí)施例2水產(chǎn)魚皮水凝膠抗壓能力測定:
[0049]將上述各條件制備得到的水凝膠放置于水平的玻璃板上，用面積為S的測力計(jì)向水凝膠施加一個(gè)垂直壓力，緩緩增大壓力，直至水凝膠碎裂為止，記錄水凝膠碎裂時(shí)的瞬間壓力F，計(jì)算膠原蛋白水凝膠產(chǎn)品的抗壓力性質(zhì)，公式如下:
[0050]抗壓力強(qiáng)度(N/cm2)= F/S
[0051] 經(jīng)測定，結(jié)果顯示本發(fā)明制得的上述不同濃度水凝膠或生理鹽度下的不同濃度的水凝膠，其抗壓強(qiáng)度范圍均在0.2-0.8之間，抗壓能力性質(zhì)優(yōu)良。
【權(quán)利要求】
1.一種水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠的制備方法，其特征在于: 1)將水產(chǎn)魚皮膠原蛋白在4°c下不斷攪拌的條件下，充分溶于濃度為0.5mol/L的醋酸溶液中，配置成膠原液； 2)將溶解后的膠原液離心，收集上清液，待用； 3)用過濾后的10— 15mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)上述膠原上清液的pH至7.0-7.8 ； 或，用過濾后的磷酸鹽緩沖液與上述膠原上清液按體積比1:1的比例混合，并不斷攪拌混合液，而后用過濾后的10 — 15mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)混合液的pH至7.0—7.8 ； 4)將調(diào)節(jié)pH后的膠原上清液混合液置于模具中，然后在30-40°C水浴靜置l_2h，使其充分自聚凝固成型； 5)將成型后的水凝膠從模具中取出，置于超純水中浸泡20-30min，即得水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠。
2.按權(quán)利要求1所述的水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠的制備方法，其特征在于:所述過濾后的磷酸鹽緩沖液為濃度為40mM的含濃度為260mM的氯化鈉的磷酸鹽緩沖液，濾紙過濾，待用。
3.按權(quán)利要求2所述的水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠的制備方法，其特征在于:所述磷酸鹽緩沖液為磷酸氫 二鈉一磷酸二氫鈉緩沖液，PH7.4。
4.按權(quán)利要求1所述的水產(chǎn)魚皮膠原蛋白水凝膠的制備方法，其特征在于:所述水產(chǎn)魚皮膠原蛋白為羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白； 1)將清洗并吸干表面水分的羅非魚皮在磁力攪拌下用10%正丁醇對魚皮進(jìn)行脫脂24h，期間每8h更換一次正丁醇溶液；而后清洗待用； 2)于4°C條件下，用0.lmol/L的氫氧化鈉對上述處理后魚皮進(jìn)行脫雜蛋白24h，期間每8h更換一次氫氧化鈉溶液,而后清洗待用； 3)將上述脫雜蛋白后的魚皮粉碎，粉碎后魚皮粉與0.5mol/L醋酸溶液按質(zhì)量比1:50混合，混合后再加入原料魚皮質(zhì)量0.5% -1%的胃蛋白酶(750U/mg, Sigma),而后于4°C下攬祥提取48h ； 4)將上述提取后魚皮提取液離心收集上清液，并在冰水浴及攪拌的條件下向上清液中緩緩加入研磨細(xì)碎的氯化鈉至終濃度為0.9mol/L，而后將液體置于4°C冰箱中過夜鹽析； 5)將上述鹽析液離心，收集沉淀，而后將沉淀復(fù)溶于0.5mol/L的醋酸溶液中；所得復(fù)溶液裝于3.5kDa透析袋中，透析24h，透析液0.02mol/L的磷酸氫二鈉溶液(pH8.6)； 6)上述所得透析液再用0.lmol/L的醋酸溶液透析24h，透析后再用純水透析48h ;透析后的膠原液于_80°C快速遇冷，然后_60°C冷凍干燥48h，即得羅非魚皮酶促溶性膠原蛋白(PSC)。
【文檔編號】C12P21/06GK104031274SQ201410231874
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】閆鳴艷, 史文軍, 秦松, 張朝暉, 崔紅利 申請人:中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所, 江蘇省海洋水產(chǎn)研究所